Semiochemicals에 침대 버그의 후각 신경 세포 응답을 감지하기 위해 단일 ​​Sensillum 기록을 사용하여

요약

빈대는 더듬이 후각 감각에 있는 후각 수용체 뉴런에 의존하여 환경의 기호화학 물질을 감지합니다. 단일 센실럼 기록을 활용하여 기호화학 물질에 대한 빈대 반응을 평가하고 관련된 코딩 프로세스를 탐구하는 방법을 보여줍니다.

초록

곤충 후각 시스템은 환경에 semiochemicals 검출에 중요한 역할을한다. 특히, 내부에 하나 또는 여러 개의 뉴런을 수용 더듬이 sensilla는 화학적 자극에 반응에서 중요한 기여를 할 것으로 간주됩니다. 직접 자극에 노출 된 후 후각 sensillum에서 활동 전위를 기록함으로써, 단일 sensillum 레코딩 (SSR) 기술은 화학적 자극에 곤충의 신경 반응을 조사하기위한 강력한 방법을 제공합니다. 악명 높은 인간의 기생충 인 베드 버그를 들어, 후각 sensillum의 여러 유형이 특징으로하고있다. 이 연구에서 우리는 두 가지 화학 자극과 SSR 방법을 사용하여 그들 중 하나에 용량 의존적 반응에 침대 버그 후각 sensilla의 신경 반응을 보여 주었다. 이 방법은 (STABLE)에 대한 중요한 정보를 제공 할 것이다 침대 버그 후각의 sensilla 개별 화학적 자극, 조기을 조회 연구자 수새 침대 버그 유인 또는 방충제 및 혜택 침대 버그 제어 노력의 opment.

서론

임시 기생충으로, 생존, 개발 및 재생이 인간과 동물 ^{1, 2} 모두를 포함하는 호스트의 혈액 소스를 필요로 의미 의무가 피를 빨아 먹는 곤충이다 : 일반적인 침대 버그 CIMEX는 L (Cimicidae 매미목)를 lectularius. 바이러스 전달은 거의 C. 인해보고되었지만 lectularius은 감염에 의해 발생 무는 성가신 심각한 신체적으로나 심리적으로 ³ 호스트에 영향을 미친다. 소개 및 화학 살충제의 광범위한 사용, 특히 DDT, 침략의 위험을 감소하고, 1950 년대 침략의 말에 더 이상 심각한 공공 우려했다 이러한 낮은 수준이었다. 그러나, 가능한 요인은 살충제의 사용 감소로, 전 세계적으로 침대 버그 인구에 부활하는 주도, 대중의 인식의 감소, 활동을 여행 증가, 살충제 ^4-9 저항의 개발.

환경 화학 단서가 감지 및 안테나와 상악 palps으로 후각 기관을 통해 곤충에 의해 인식됩니다. 곤충 안테나에 후각 sensilla이 화학 신호를 검출하는 데 중요한 역할을한다. 화학 분자는 표피 표면에 구멍을 통해 더듬이 표피를 입력합니다. 취제이 화학 분자 더듬이 림프 바인드에 결합 단백질과 후각 수용체 ^(10)에 그들을 수송. 후각 수용체 이러한 화학 분자되면 탈 분극 될 신경 막에 비 선택적 양이온 이온 채널에서 자신의 공동 수용체는 후각 수용체 ^(11)에 의해 인식됩니다.

단일 sensillum 기록 (SSR)은 화학적 또는 비 화학 자극 중 하나의 애플리케이션에 의한 활동 전위에서 세포의 변화를 검출하기 위해 개발되었다. sensillum 림프 및 기준 전극에 기록 전극을 삽입하여곤충의 몸 (보통 화합물 눈 또는 복부 중 하나)의 다른 부분으로, 자극에 반응하여 신경 세포의 발사 속도는 ^12을 기록 할 수 있습니다. 스파이크의 수의 변화는 특정 자극에 대한 곤충의 감도를 나타낸다. 다른 ID 및 농도의 화학적 자극이 다른 연소 속도와 시간적 구조와 다른 신경 반응을 유발하며, 따라서 특정 화학 물질에 대한 곤충의 부호화 처리를 조사하는데 사용될 수있다.

구 홈 페그 C의 sensilla, 29 머리와 같은 E (E1 및 E2) sensilla, 한 쌍 Dα, Dβ, Dγ 부드러운 말뚝을 각각 : 일반 침대 버그, 모두 성적 형태의 안테나에 후각 sensilla의 동일한 패턴을 공유 sensilla ^{(13, 14).} 여러 뉴런 sensillum 각 유형에서 식별 된 바와 같이, 그것은, 동일한 sensillum 수납 다른 뉴런에서 활동 전위를 구별하는 것은 쉽지 않다 실험자는 tota 이처럼활동 전위의 L 번호는 이전과 자극 후 500 밀리 초 동안 오프라인 계수 하였다. 자극 후 활동 전위의 수는 전 자극 활동 전위의 수로부터 감산하고 ¹⁵ 초 당 스파이크 각 sensillum에서 소성 율의 변화를 정량화하기 위해 두 곱 하였다.

프로토콜

악기, 자극 솔루션, 그리고 침대 버그 1. 준비

1. 20 ㎖ 병 (V / W) 50 % KNO ₂ 솔루션을 준비합니다.
2. 반복과 솔루션에서 텅스텐 전극을 담그고 5 V에서 KNO ₂ 용액에 두 개의 텅스텐 미소 전극을 선명하게.
   1. 대략 텅스텐 와이어의 선단부를 소비 크게 할 수는 약 5 분 동안 2 딥 / 초의 속도 및 KNO ₂ 용액 중에서 텅스텐 와이어의 약 10mm 침지하여 텅스텐 와이어를 선명.
   2. 전극의 미세하고 날카로운 포인트가되도록 섬세 적어도 1 분 동안 2 딥 / 초의 속도 및 용액 중 와이어 팁의 약 1mm 침지하여 전극을 선명. 이 침대 버그 후각 sensillum의 표피에 구멍을 충분히 괜찮을 0.2 ~ 0.5 μm의에 도달 할 때까지 자주 현미경으로 전극의 끝 부분의 직경을 확인합니다.
      참고 : 수동으로 날카로운 동안전극 위할, KNO ₂ 용액에 텅스텐 와이어의 침지 속도는 항상 일정하지 않다. 더 연습, 그것은 전극 선명에서 비교적 일정한 속도를 유지하는 것이 훨씬 쉽다. 선명 화 시간은 전극이어야 방법에 따라 미세도 불확실하다. 여기서, ~ 0.2 ㎛의 직경을 가진 전극 팁은 후각 sensillum 뚫 정도로 충분하다.
3. 원액 1:10의 V / V의 초기 농도로 단정 화합물에서 디메틸 설폭 시드 (DMSO)에 화학적 자극의 각각의 희석. 각 화학 물질에 대한 재고 솔루션의 각에서, DMSO 다시, 실험에 필요한 얼마나 많은 용량에 따라 십진 희석 시리즈를 만듭니다. β - 피넨과 유칼 립톨 - 여기, 10 % (+)를 사용합니다.
4. unfed 또는 칠일 배치 후 공급 포트에서 (남성 또는 여성 중) 성인 침대 버그. 딕스 식민지 (켄터키 대학에서 박사 헤인즈의 선물)은 T에 사용되는그는 배양 접시에서 실험.
   참고 : 페트리 접시에 배치 침대 버그에 대한 정확한 수는 없습니다. 이 적거나 많은 수있다.

2. 침대 버그 더듬이 준비

1. 얼음 (2-3 분)에 침대 버그를 마취.
2. 양면 테이프로 현미경 커버 슬립에 안테나와 곤충의 몸을 모두 수정하고 미세 가위 다리를 제거합니다.
3. 꾸준히 테이프를 부착 할 수 있도록 부드럽게 안테나를 만져 작은 핀을 사용합니다.
4. 조작을 용이하게하고, 기록 전극 (그림 1)에 대한 적절한 각도 (~ 90 °)로 조정하는 치과 왁스의 작은 공 (~ 1cm 직경)에 대한 커버 슬립을 놓습니다.
5. 일단, 스테레오 현미경 침대 버그를 배치 차가운 광원을 켜고 안테나가 명확하게 제시 될 때까지 조명의 강도를 조정하고, 높은 배율에서 침대 버그 안테나의 두 번째 편모에 현미경을 집중 확보 (720X) .
   노트: 실험에 사용 된 조명의 강도는 정말 실험자의 눈이 조명의 강도를 어떻게 생각하는지에 의존하는, 정량화되지 않습니다.

3. 단일 Sensillum 기록

1. 신호 기록 및 시각화를위한 컴퓨터와 연결되어 신호 포착 컨트롤러와 프리 앰프 (10X)를 연결한다. 컴퓨터를 켜고 소프트웨어, 예를 들어, AutoSpike32를 시작하고 메뉴 바에서 "녹음"모드를 클릭합니다. 이어서 웨이브 신호 기록을 시작하도록 "웨이브"선택.
   참고 : 반복적으로 모니터의 오른쪽 왼쪽에서 실행하는 평면 라인은 이제 볼 수 있어야합니다. 여기서, 기록 창 40 초 정도. 맥스 웨이브 녹음은 10 초입니다. 선택된 샘플링 속도가 96,000이고 디지털 샘플링 속도 오프셋은 0 % 및 필터링없이, 기록 신호의 부정은 정류가 240이다. 필요에 따라 소프트웨어의 이러한 모든 파라미터 설정이 수정 될 수있다.
<리> 더듬이 sensillum에서 신경 응답을 토닝 모드를 제공하는 데 사용되는 프리 앰프에 연결 스피커의 전원을 켭니다.
2. 안정화 된 침대 버그의 복부에 기준 전극을 삽입합니다.
   주 : 기준 전극은 자기 에어 테이블 스탠드에 부착 된 금속에 의해 유지되었다.
3. 기준 전극은 침대 벌레의 복부에 접속 된 후, 침대 벌레의 안테나의 후방 단부를 향해, ​​미세 조작기에 의해 전치 증폭기에 접속되고 조작되는 기록 전극을 이동.
4. 기록 전극은 안테나의 오른쪽 끝과 접촉 할 때, 현미경 켜고 저배율에서 전극을 찾아.
5. 전극과 더듬이 sensillum 모두 동일 평면에 있고 현미경으로 명확하게 표시 될 때까지 점차적으로 배율을 증가시키면서 기록 전극을 조정한다.
   참고 :이 시간까지, 현미경 보통이다가장 높은 배율 LY.
6. 미세 조작기를 사용 sensillum의 샤프트에 기록 전극을 삽입하고 배경 잡음이 활동 전위에 비해 높은 경우 조금 더 깊게.
7. β - 피넨 - 일단 명확한 활동 전위가 기록 된 sensillum에서 관찰된다, 10 % (+)와 마이크로 피펫을 입력합니다. 유리 파스퇴르 피펫 내부에 배치 필터 종이 스트립 (~ 3 × 15mm)에 β-피넨 - 10 % (+)의 10 μL 나누어지는을 입금 마이크로 피펫을 사용합니다.
   1. 자극 컨트롤러의 펄스 흐름 튜브의 콘센트에로드 된 피펫을 연결하고 안테나 지향 튜브에있는 작은 구멍에 피펫의 팁을 배치합니다.
8. 모든 연결이 안정되면, 연속 가습 공기 흐름에 자극 (/ 분 0.5 L)의 0.5 초 퍼프를 제공하기 위해 자극 컨트롤러의 풋 스위치를 우울. 활동 전위의 녹음 할 때 footswitc 동시에 시작됩니다시간은 우울하다. 기록 처리는 자극 전에 1 초부터 10 초 지난 것이다.
9. 이 500 밀리 초 기간 전에 하나는 자극 후 한 오프 라인 활동 전위를 계산합니다. 선행하는 500 밀리 초 동안 기록 운동량로부터 500 밀리 초 후의 자극 동안 스파이크 속도의 변화를 빼고 2별로 곱하여 스파이크 / (S)의 크기로 종래의 수를 변환한다.

SSR 4. 자극 교체

1. 침대 벌레 안테나 상으로 피펫에 β-피넨과 피펫이 제거 된 후 10 초이 특정 취제에 응답하여 기록 - 풋 스위치가 트리거되면, 10 % (+)를 제공한다.
2. 0.001 %의 유칼 립톨와 다른 새로운 피펫 레이블을 테스트 할 수 있습니다. 자극의 10 μL가 새로운 피펫으로, 적용된 필터에 종이의 작은 조각을 놓습니다.
3. 자극이 완전히 vapori 때까지 2-5 분 동안 기다립니다유리 피펫에 데이빗. 펄스 흐름 튜브의 출구에 피펫을 연결합니다.
4. 안테나 지향 튜브의 작은 구멍에 피펫 팁을 삽입합니다. 풋 스위치를 누르고 전송 10 초 녹화를 시작합니다.
5. 피펫을 분리하고 0.01 %의 유칼 립톨와 다른 피펫을 준비합니다.
6. 용량 의존적 반응을 관찰하는 더듬이 sensilla에 유칼 립톨의 용량 (0.001 %에서 10 %)의 모든 나머지를 테스트합니다. 대부분의 시험은 희석 최소 용량으로 희석.

결과

단일 sensillum 녹음 곤충 화학 생태학 및 신경 생리학의 연구에 사용되는 강력한 수사 기법이다. 다른 휘발성 화합물, 생각, 특히에 곤충의 신경 반응을 조사하는 곤충의 생존과 발전에 생태 학적으로 관련 될뿐만 아니라, 우리에게 곤충의 후각 과정에 귀중한 통찰력을 제공 할뿐만 아니라 잠재적으로 이어질 수있는 유망한 새로운 길을 열어 해충 제어를위한 유용한 새로운 시약의 개발.

일반 침대 버그, 악명 높은 도시 해충으로, 확실히 많은 연구자의 관심을 모으고있다. 침대 버그에 관련된 다양한 연구 분야 중 자신의 후각 메커니즘은 침대 버그의 화학적 생태에 대한 가장 중요합니다. 이전의 연구는 명시 양과 침대에 후각 sensillum의 다른 유형의 분포를 설명했다버그 안테나. 도 2a에 도시 된 바와 같이, 침대 벌레 안테나 네 개...

토론

단일 Sensillum 녹화 기술은 광범위하게 이러한 환경에서 다른 화학적 자극에 과일 파리, 모기와 빈대 같은 곤충의 신경 반응을 테스트에 사용되어왔다. 이러한 화학적 자극에 종종 용해 치료의 상이한 투여 량을 준비하기 위해 공통의 용매로 희석된다. 그러나, 다른 용매는 자극을위한 상당히 다른 방출 속도를 생산할 수있다. 이러한 초파리 melanogaster의,과 아노 펠 레스 gambiae, 쿨 렉스 quinquefasciatus 및 Aedes aegypti 한 일부 광범위하게 연구 곤충에 대한 이전의 연구 이 곤충은 오일 ^17-20 파라핀 상대적으로 둔감로 일반적으로, 자극을 용해하는 용매로 파라핀 오일을 사용했다. 파라핀 오일은 또한 동일한 이유로 ^14, 빈대 이전 단일 sensillum 기록 연구에 사용되었다. 그러나 가장 일반적으로 사용되는 용매는 각 곤충 종에 가장 적합한되지 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
텅스텐 와이어	AM SYSTEMS	#716500	전극
KNO2	Sigma	#310484	전극 준비에 사용
AC 전원 공급 장치	BK Precision	1653A	텅스텐 와이어 샤프닝에 전압 제공
Leica Z6 APO 현미경	Leica	10447424	안테나의 센실라를 관찰하는 데 사용됩니다
Simulus 컨트롤러	Syntech	CS-55	자극 응용 프로그램 제어에 사용
4 채널 USB 수집 컨트롤러	Syntech	IDAC-4	기록 전과 기록 중 모든 신호의 실시간 화면 표시
광원	SCHOTT	A20500	관찰을위한 광원 제공
Micromanupulator	Leica	115378	작은 움직임에 사용 전극
스피커	Juster	95a	수집 컨트롤러 IDAC-4와 연결되어 신호에 사운드를 제공
마그네틱 스탠드	Narishige	GJ-1	기준 전극, 안정화 된 빈대 및 자극 전달 튜브를 고정하는 데 사용
TMC 진동 차단 테이블	TMC	63-500	장비에서 진동을 분리하는 데 사용
커버 슬립	테 펠라	2225-1	침대 벌레를 고정하는 데 사용됩니다
. 양면 테이프	3M	XT6110	커버 클립의 침대 벌레를 안정화하는 데 사용됩니다
. 치과 왁스	Dentakit	DK-R012	침대 벌레가 안정화되는 커버 클립을 지원하는 데 사용됩니다