Optogenetic 기능 MRI

Summary

이 프로토콜은 광유전학적 기능적 자기공명영상(ofMRI)을 성공적으로 수행하는 데 필요한 단계와 데이터 분석을 설명합니다. ofMRI는 고자기장 fMRI 판독과 광유전학적 자극을 결합한 새로운 기술로, 살아있는 뇌 전체에 걸쳐 기능적 신경 회로와 그 역학의 세포 유형별 매핑을 가능하게 합니다.

Abstract

온전한 뇌 전체에 걸쳐 정밀한 신경 회로의 기능적 연결성에 대한 조사는 고자기장 fMRI의 상대적으로 높은 공간 해상도와 광유전학적 자극의 정밀도를 결합한 새로운 기술인 광유전학적 기능적 자기공명영상(ofMRI)을 통해 달성할 수 있습니다. 생체 내에서 특정 파장의 빛을 뇌 깊숙이 전달할 수 있는 광섬유는 옵신(opsin)이라고 하는 빛에 민감한 막횡단 전도 채널을 발현하도록 유전적으로 유도된 표적 세포 유형을 특이적으로 자극하기 위해 관심 영역에 이식됩니다. fMRI는 뉴런 활동의 간접 측정을 제공하는 BOLD(Blood-Oxygen-Level-Dependent) 신호의 측정을 통해 특정 신경 회로의 광유전학적 자극에 대한 뇌의 전반적인 동적 반응을 결정하는 비침습적 방법을 제공하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 광섬유 임플란트의 구성, 임플란트 수술, 광자극을 통한 이미징 및 MRI를 성공적으로 수행하는 데 필요한 데이터 분석에 대해 설명합니다. 요약하면, MRI의 정확한 자극과 전뇌 모니터링 능력은 MRI를 건강한 상태와 질병 상태 모두에서 뇌의 커넥토믹스를 연구하기 위한 강력한 도구로 만드는 데 중요한 요소입니다.

Introduction

Optogenetic 기능적 자기 공명 영상 (ofMRI)의 전체에 걸쳐 세포 유형 특정한 기능적 신경 회로의 맵핑 및 역학을 가능 optogenetic 자극 ^1-11,38의 정밀도 높은 필드의 fMRI의 공간 분해능을 겸비한 신규 한 기술이다 뇌. 특정 세포 유형은 빛에 민감한 횡단 막 전도 채널,라는 opsins의 도입에 의해 자극의 대상이 될 때까지 Optogenetics가 있습니다. 신경 회로의 특정 요소는 유 전적으로 그대로 뇌 ^1-15에서 활동 밀리 초 - 시간 척도 변조를 가능하게,이 채널을 표현하기 위해 수정됩니다. 자기 공명은 신경 활성의 간접적 인 측정을 제공 혈중 산소 수준 의존 (BOLD) 신호 ^16-18의 측정을 통해 특정 신경 회로의 optogenetic 자극 뇌 전체 동적 응답을 결정하는 비 침습적 방법을 제공한다.

상대적으로 높은 공간 해상도로 전체 뇌의 뷰를 제공 할 수 있기 때문에, 이들 두 기술의 조합, optogenetic 기능적 자기 공명 영상 (ofMRI)를 지칭 같은 전기 생리학 같은 자극시 기록 뇌 활동의 다른 방법에 비해 유리하다. 이것은 침습 기록 전극 ^1-11 주입 없이도 자극 부위로부터 먼 거리에서 대상의 자극에 반응하여 신경 세포 활성도의 감지를 가능하게한다. ofMRI 전극 근처에서 다른 세포 유형을 채용함으로써 각 인구 ^(19)의 인과 영향을 혼동 할 수의 fMRI 동안 전기 자극을 수행하는 전통적인 방법보다 유리하다. 또한, 상기 전극은 전기 자극을 위해 사용되며 발전 전류는 MR 촬상 ²⁰ 동안에 아티팩트를 생성 할 수있다. 사실, ofMRI 특정 modulati에서 글로벌 두뇌 활동에 영향을 관찰 할 수 있습니다이러한 형질 전환 동물에서의 LOX-Cre 호텔 시스템 또는 촉진제의 사용과 같은 진보 된 유전자 타겟팅 기술의 사용을 통해 세포 유형의 다양한에서. 전체 뇌 모니터링 조합 광 제어는 특정 세포 유형을 자극하기 위해 억제 ChR2 NpHR 모두의 사용을 통해 ofMRI 가능하다. ofMRI에서 사용할 수있는 optogenetic 툴킷은 또한 신속하게 이식 섬유에 대한 요구 사항을 부정 할 수 안정화 단계 기능 opsins (SSFOs) 또는 적색 편이 opsins의 증가 빛이 감도 또는 개선 된 반응 속도와 opsins의 도입으로 시간이 지남에 따라 개선 영상 ^21시 비 침습적 자극을 가능하게 광학,. 이러한 가능성은 전기 자극과 함께 사용할 수 없습니다.

그러나, 뇌에서 광 전달 티슈 가열로 인한 신호 아티팩트는 완화 시간의 온도에 의한 변형 pseu을 생성하는 것으로 나타났다 ^(22),보고 된정품 인증을한다. ofMRI을 수행하는 연구자들은 따라서 이러한 잠재적 혼란을 알고 있어야합니다. 적절한 설정 및 제어로, 문제가 해결 될 수 있습니다. 또한, 자기 공명의 혈역학 적 반응을 측정하는 상대적으로 낮은 시간 해상도는이 기술의 특정 응용 프로그램에 대한 제한 요인이 될 수있다.

이 프로토콜은 제 깊은 생체의 뇌에 빛의 특정 파장의 전달을 가능하게하는 광섬유 임플란트의 구성을 설명한다. 프로토콜은 정위 수술을 이용하여 정확한 뇌 영역에 옵신 코딩하는 바이러스 벡터의 전달을 설명한다. 프로토콜 옆에 동시 빛 자극하는 동안 전체 뇌 기능 자기 공명 영상의 프로세스에 대해 설명합니다. 마지막으로, 프로토콜은 수집 된 데이터의 기본 데이터 분석을 설명합니다.

참고로, 여기에 설명 된 optogenetics은 빛 전달을위한 만성 이식을 필요로한다. 그러나, 광섬유 임플란트가 안정되어 바이오호환, 세로 스캔 달 ^{23, 24의} 기간 동안 신경 회로의 조사를 허용한다.

요약하면, 정확한 자극 및 ofMRI의 전체 뇌 모니터링 능력은 뇌의 connectomics의 연구를위한 강력한 도구를 ofMRI 만드는 중요한 요인이다. 또한, 그것은 상이한 동물 모델과 결합 된 신경 질환 ^{(25)의기구에} 신규 한 통찰력을 제공 할 수있다. 실제로 ofMRI 발작 ^(8)와 연관된 고유 한 해마 하위 영역의 네트워크 활동을 명료하게하기 위해 사용되었다. 따라서, 시스템 수준의 신경 과학의 질문에 대답에 관심이 실험실 중요성이 기술을 찾을 수 있습니다.

Protocol

윤리 정책 : 여기에 스탠포드 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 실험 절차.

1. 준비 패치 케이블 및 페럴 임플란트

참고 : 패치 케이블과 페룰 임플란트 생산, 시판되고 있지만이 자체 특수 설계를 가능하게하고 더 적은 비용을 것입니다.

1. 먼저 원하는 길이의 광섬유를 절단, 뇌 임플란트 레이저로부터의 광을 전달하는 광섬유 패치 케이블을 제조 하였다.
   1. 섬유 칼을 이용하여 종단점 평평한 단부를 생성하기 위해 광섬유를 종료. 섬유는 재킷을 코팅 한 경우, 미리 섬유 스트리핑 공구 재킷 벗겨.
   2. 케이블의 보어 내부 동물 광원으로부터 연장하도록 충분히 길다 보장 케이블의 원하는 길이를 생성하기 위해 상기 광섬유의 타단을 절단스캐너.
2. 에폭시 접착제를 혼합 한 후 5 분간 사용하기에는 너무 점성대로 곧 다음 단계 전에 알루미늄 포일 조각 상 : 1 비율 (1) 에폭시 접착제를 소량 혼합한다.
3. 작은 나무 막대기를 사용하여 부드럽게 세라믹 페룰의 오목면 내부에 배치 한 후 페룰의 평평한면의 표면에 작은 방울을 적용한다 섬유의 부분에 에폭시 접착제를 적용합니다. 페룰에 삽입 한 후, 파이버 (<0.5 mm)의 길이가 작은 세라믹 페룰의 평평한 측면으로부터 돌출되도록. 에폭시 접착제는 최적의 결과를 O / N을 강화 할 수 있습니다.
4. 레이저 광원에 연결하는 광섬유 패치 케이블 측 부드럽게 FC / PC 커넥터의 페룰의 오목면 내에 배치되는 섬유의 일부에 에폭시 접착제를 적용하고 작은 적용 페룰의 평탄면의 표면에 떨어. 페룰에 삽입 한 후, 확인있음 섬유 (<0.5 mm)의 작은 길이는 페룰의 평평한 측면으로부터 돌출되어있다. 에폭시 접착제는 최적의 결과를 O / N을 강화 할 수 있습니다.
5. 3 μm 인 1 ㎛] 그릿 0.3 내지 산화 알루미늄 랩핑 시트 (그림 -8- 회전을시키면서 페룰에 완만 한 하향 압력을 핀셋을 이용하여 연마 디스크를 사용하여 케이블의 양측 페룰의 평평한 단부를 연마 ).
6. 100X 배율에서 현미경으로 페룰의 평평한 끝을 검사합니다. 광섬유 표면 자체를 포함 플랫 끝의 표면이 어떤 에폭시 접착제 없음을 확인합니다 에폭시 접착제가 표면에 남아있는 경우 연마를 계속합니다. 광섬유 표면이 깨지거나 부서진되지 않았 음을 확인합니다.
   주의 : 확인 담당자가 적절한 레이저 안전 교육 수업을하고 레이저 장비를 취급하기 전에 레이저 안전 고글을 착용하십시오.
7. 은 FC / PC 커넥터를 통해 상기 레이저 광원 광섬유 패치 케이블을 연결하고 F 정렬커플러의 초점에 IBER 팁. 충분한 광 출력을 확보하기 위해 전력 미터와 광섬유의 광 송신 전력을 측정한다.
   참고 : 다음 단계는 뇌에 만성 주입 광섬유 세라믹 페룰을 제조이다; 세라믹 페룰은 중앙에 중공 뇌 내에서의 ROI에 패치 케이블로부터의 광을 전달하는 광섬유를 운반.
8. 섬유 칼을 이용하여 종단점 평평한 단부를 생성하기 위해 광섬유를 종료. 섬유는 재킷을 코팅 한 경우, 미리 섬유 스트리핑 공구 재킷 벗겨.
9. 뇌 내로 이식의 원하는 길이를 생성하기 위해 상기 광섬유의 타단을 절단. 뇌 내의 ROI를 타겟팅하는 정위 아틀라스를 사용하여 섬유의 길이를 결정한다.
   1. 예를 들면 다음과 같습니다 브레 그마 아래 3.5 mm이다 쥐 등의 해마를 대상으로, 섬유의 길이가 ferrul에서 돌출되도록전자는 + 0.25 mm 3.5 mm, 두개골 두께에 대한 회계 오류의 마진을 허용합니다. 따라서, 섬유의 최종 길이는 + 0.25 mm + 10.5 mm 3.5 mm (페룰의 길이) = 14.25 mm인지 확인합니다.
10. 1 에폭시 접착제를 소량 믹스 : 곧 다음 단계 전에 알루미늄 포일의 일부에 1 비율 (에폭시 접착제는 혼합 후 5 분 사용하기에는 너무 점성이된다).
11. 작은 나무 막대기를 사용하여 부드럽게 세라믹 페룰의 오목면 내부에 배치 한 후 페룰의 평평한면의 표면에 작은 방울을 적용한다 섬유의 부분에 에폭시 접착제를 적용합니다. 페룰에 삽입 한 후, 파이버 (<0.5 mm)의 길이가 작은 세라믹 페룰의 평평한 측면으로부터 돌출되도록. 에폭시 접착제는 최적의 결과를 O / N을 강화 할 수 있습니다.
12. 도 -8- 회전하면서 페룰에 완만 한 하향 압력을 핀셋을 이용하여 연마 디스크를 사용하여 페룰의 평평한 단부를 연마알루미늄 산화물 랩핑 시트에의 (3 μm의 1 μm의 0.3 μm의 그릿에).
13. 100X 배율에서 현미경으로 페룰의 평평한 끝을 검사합니다. 광섬유 표면 자체를 포함 플랫 끝의 표면이 어떤 에폭시 접착제 없음을 확인합니다 에폭시 접착제가 표면에 남아있는 경우 연마를 계속합니다. 광섬유 표면이 깨지거나 부서진되지 않았 음을 확인합니다.
14. 몇 연마 페룰 슬리브 광섬유 패치 케이블 페룰 및 레이저 광원에 패치 케이블을 연결한다. 충분한 효율을 확보하기 위해 전력 미터와 광섬유의 선단에서의 광 송신 전력을 측정한다.
15. 출력 임플란트 페룰 광섬유 (이 프로토콜 2.5 MW)의 선단에서의 소정의 전력 레벨에 대한 패치 케이블의 페룰에서 필요한 출력의 로그를 유지한다. 50 %의 감쇠율과 비 원형의 출력 패턴과 페룰 버린다.

2. 정위 임프μM 농도로 배양액 수술 및 바이러스 주입

1. 동물의 사용과 관련된 모든 실험 절차는 로컬 IACUC에 의해 승인되어 있는지 확인합니다. 멸균 장갑, 멸균 마스크, 무균 수술 드레이프와 살균 수술 도구를 사용하여 포함, 무균 절차에 따라 생존 수술시 무균 상태를 유지한다.
   주의 : 외과 의사가 절차를 시작하기 전에 안전 고글을 포함하여 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하고 있는지 확인합니다. 튀는 것을 방지하기 위해주의하면서, 아데노 - 관련 벡터 (AAV)로 작업 할 때 표준 바이오 안전성 절차를 따르십시오. 생물 학적 용기에 AAV 폐기물 폐기하십시오.
2. 사용하기 전에 얼음에 주사기를 유지, 동물에 주입을위한 충분한 AAV와 마이크로 리터 주사기를로드 플러스 잠재적 인 볼륨 손실 (동물 당 4 μL 총)을 설명하는 추가. 이 프로토콜에서, 4 × ¹² VG / ㎖의 역가에 AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP이 사용됩니다. 이소 플루 란 하에서 동물 놓고산소 가스 원과 4 % - 3에서 정밀 이소 플루 란 기화기 세트에 연결된 유도 챔버와 E 마취.
3. 전기 면도기로 면도 헤드 betadine 및 70 % 에탄올 세정을 이용하여 피부에 트리플 스크럽 수술을 수행한다.
4. 동물이 깊은 마취 (발가락 반사와 호흡 속도를 확인)가되면, 내 청각 위치 스터드와 치아 바가있는 정위 장치에서 동물의 두개골을 고정.
   참고 : 전체 절차는 1 소요됩니다 - 마취 유도에서 회복, 2 시간을.
5. (- 증발기에 3 % 이소 플루 란 1) 계속 40 호흡 / 분 ~의 호흡 속도를 유지하기 위해 필요에 따라 마취를 조정하는, 동물의 생체 신호를 모니터링하는 적절한 레벨로 마취를 설정한다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 대한 안과 용 연고를 관리.
6. A A 메스와 20mm 중간 선 두피 절개 수술 지혈제​​를 사용하여 두피를 철회 - 15을골막에 ttached. 참조 람다와 브레 그마는 투자 수익 (ROI)에 대한 좌표를 통해 드릴 비트를 배치합니다.
7. 뇌에 구멍 않도록주의하면서, 치과 드릴 투자 수익 (ROI)를 통해 - (3mm 2) 작은 개두술을 드릴. 천천히 뇌의 ROI에 개두술을 통해 마이크로 리터 주사기에 부착 된 바늘을 삽입합니다.
8. 마이크로 실린 펌프 컨트롤러, 투자 수익 (ROI)에 벡터 솔루션 2 μl를 주입. 조직 손상을 피하기 위해 150 NL / 분의 유속을 사용한다. 주입이 완료된 후, 0.5 mm / min의 속도로 천천히 주사기를 제거하기 전에 10 분 동안 기다린다.
9. 주입 후, 두개골의 표면을 건조. 약 0.5 mm / min의 속도 : 좌표를 확인하고 (등쪽 해마 정수리 3.5 mm 이하 예컨대) 목표 깊이 페룰 임플란트를 삽입 참조 브레 그마 및 람다. 치과 용 시멘트를 사용하여 두개골에 페룰 임플란트를 탑재합니다. 치과 용 시멘트가 고화되면, 봉합 절개를 밀봉 (SI치과 시멘트 캡 주위에 쥐에 대한 ZE 5-0).
10. 수술 후 단독으로 마취 복구를위한 히터의 상단에있는 케이지의 절반 보관 새장에 동물을 배치합니다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에서 동물을 올려 놓지 마십시오.
11. 통증의 수술 후 관리, 24 시간 동안 0.05 ㎎ / ㎏의 용량에서 관리] 프레 노르 핀 피하 매 12 시간 동안. 3 일간 절개 사이트를 통해 매일 항생제 분말을 관리 할 수​​ 있습니다.
12. 가피을 방지하기 위해 약 2 주 수술 후 봉합사를 제거합니다.
13. 실험을 수행하기 전에 optogenetic 유전자의 충분한 표현 바이러스 주입 후 육주 - 4 기다립니다.

3. Optogenetic 기능성 MRI

주의 : MRI 스캐너의 영구 자기장 주위에주의하십시오. 보안 장 비용함수 발생기, 광원, 호흡기, capnograph 및 연료 탱크를 포함 이비인후과, 충분히 멀리 (적어도 5 가우스 한계 이상).

1. 산소 가스 원과 5 % 이소 플루 란 정밀 기화기 세트에 연결된 유도 챔버로 가스 마취하에 동물을 놓는다.
2. 동물이 깊은 마취 (체크 발가락 반사 및 호흡 속도)가되면, Rivard 등에 설명 된 프로토콜에 따라 동물을 삽관. (2006) 호 기말 이산화탄소 분압 ^(26)에 의해 이산화탄소의 감시를 허용 할 수 있습니다. 참고 : 삽관 이미징 동안 호기 CO _2의 적절한 수준을 유지하는 것이 중요합니다.
3. 스캐너 크래들에 동물을 고정합니다.
   참고 :이 프로토콜에서 요람 맞춤 제작되었지만 이러한 크래들도 시판되고있다. 쥐 크래들 기능 마취, 가열 된 공기의 전달과 운동의 제한은 스캐너에서 동물을 고정합니다.
4. 이소 플루 란의 혼합 (rangin를 제공크래들을 통해 튜브를 통해 약 60 %, 질소 산화물 40 %의 산소) 1.5 % - g 1.2. 동물의 머리가 안전하게 모션 아티팩트를 방지하기 위해 고정되어 있는지 확인합니다.
5. 크래들의 튜브를 통해 가열 된 공기를 제공하고 체온을 모니터링 윤활제 직장 온도계를 삽입한다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 대한 안과 용 연고를 관리.
6. 레이저 광원 광섬유 패치 케이블을 연결 및 전력 미터와 패치 케이블의 페룰의 선단에서의 출력을 측정한다.
7. 뇌의 내부에 주입 된 광섬유의 끝에서 원하는 출력 (이 프로토콜 2.5 Mw)이 생성한다 (단계 1.15에서 이미 결정된) 적절한 전력 레벨을 조정한다. 광섬유로부터의 과도한 동력 출력 잠재적 뇌 내부 조직이 손상되거나 신호 아티팩트를 만들어 조직 가열을 야기 할 수 있기 때문에, 크게 레이저의 파워 출력을 증가시키지의도 된 출력 이상.
8. 검은 전기 테이프의 콘 임플란트의 빛 누출을 방지하고 동물의 눈을 커버한다. 커플 페룰 슬리브 동물에 페룰 임플란트 광섬유 케이블.
9. 동물의 머리에 코일을 배치합니다. 스캐너의 구멍에 동물과 크래들을 삽입합니다.
   주 :이 프로토콜은 단일 루프 코일 맞춤 제작하고, 뇌 조직에서 최적의 무선 주파수를 수신하기 위해 사전 조정을 송수신.
10. 4 % 스트로크 주파수 및 음량을 조절하는 인공 호흡기에 노브를 회전하고 있음 -이 과정에서 속도 및 체온, 호흡 한계 내 생리 값을 유지하기 위해 필요에 따라 인공 호흡기와 히터를 조정 모니터 (있는지 확인 호기 CO ₂ 3은 온도는 온도 설정에 대한 화살표)를 클릭하여 37 °의 C이다.
11. 이미지에 위치 시퀀스 동물 머리의 위치를​​ 선택합니다. ㄴ 경우비는 동물 머리의 위치를​​ 조정하고 뇌가 이소 - 중앙 때까지 위치 검사를 반복 이소 중심이 아니다. 선형 shimming 시퀀스를 선택하고 시퀀스 선택 창에서로드를 클릭합니다. 다음으로, 자계의 불균일성을 감소시키기 시작 클릭.
    참고 Shimming 직접 자기 공명 데이터의 무결성에 영향을 미칠 것이다 중요한 단계이다.
12. T2 강조 시퀀스를 선택하고 시퀀스 선택 창에서로드를 클릭합니다. 다음으로, 전체 뇌의 무결성을 확인하고, 광섬유 임플란트의 위치를​​ 확인하기에 앞서 자기 공명 T2 강조 고해상도 관상 해부학 적 영상을 얻기 위해 시작을 클릭.
    주 :이 이미지가 ofMRI 스캔 시리즈 해부학 오버레이로서 사용될 수있다.
13. 레이저 광원은 자극 실험 패러다임에 따라 구동되도록 함수 발생기에 MRI 스캐너의 트리거 포트 BNC 케이블을 연결한다.
    참고 :이 프로토콜에서, 자극 페이지aradigm 여섯 분 / 40 초 오프 20 초 다음 기준의 30 초입니다.
14. 그라데이션 에코 (GRE) 시퀀스를 불러 멀티 슬라이스를 선택하고 순서 선택 창에서로드를 클릭합니다. 다음으로, 0.5 mm X 0.5 mm X 0.5 mm 공간 해상도와 코로나 조각을 평면 35mm X 35mm (2D FOV)를 취득 시작을 클릭합니다.
    참고 : 여기에 사용되는 GRE 시퀀스는 TR / TE의 반복 시간 (TR) 및 에코 시간 (TE)가 = 밀리 초 750/12 및 30 ° 플립 각도.
15. 스캔의 결론에서, 스캐너에서 동물을 제거하고이 마취에서 깨어하고 흉골 드러 누움을 유지할 수있을 때까지 모니터링 할 수 있습니다.

4. ofMRI 데이터 분석

참고 : 다음 단계는 MATLAB에서 수행되는 높은 처리량의 게시 ofMRI ^(27)에 설명 된대로.

1. 원시 스캔 데이터 분석에 사용되는 컴퓨터로 전송 된 이후로, 각 화상 TR을 업데이트 윈도우 재구성 슬라이딩 사용하십시오네 인터리브 나선형 판독 값은 750 밀리 초 TR 12 밀리 에코 시간은 스캔 시리즈 당 23 조각을 획득 할 수 있습니다. 대신 모든 인터리빙이 슬라이스마다 획득 된 후에 만 새로운 자기 공명 영상이 재구성되어 재구성 종래의 슬라이딩 윈도우의 재구성 방법은 ²⁷ 간지 각각의 취득 후 이미지를 재구성한다.
2. 앞서 설명한 바와 같이 ²⁷ 개의 차원 리딩 재구성, 움직임 보정, 시계열의 계산에 대한 원시 데이터를 처리한다.
3. 이전 ²⁷ 바와 같이 종래 자극 수집 기준 기간에 각 복셀 상대의 BOLD 신호의 비율을 계산 변조 활성화 복셀을 결정하는 임계 간섭 법을 사용한다. 푸리에 변환의 크기가 모든 주파수 성분 ^(8)의 제곱합으로 나누어 반복 자극 사이클의 주파수 변환으로 코 히어 런스 값을 계산한다.
4. 각 V에 대한 시계열 데이터를 사용하여oxel, 평균 모션 보정 이미지를 먼저 동일한 자극 패러다임의 연속 스캔에 속하는. 이전 ²⁷ 설명 된대로 그런 내에서 동물 사이의 비교를위한 여섯 자유도 강체 변환 플러스 등방성 스케일링과 공통의 좌표 프레임에 평균 4D 이미지를 맞 춥니 다.

Results

그림 1과 그림 2는 20 Hz (15 밀리 초 펄스 폭, 473 nm의 30 % 듀티 사이클) 운동 피질의 optogenetic 자극으로 인한 대표적인 데이터가 표시됩니다. 여섯 분은 사용을위한 기본 30 초의 자극 패러다임은 / 40 초에서 20 초만큼 떨어져 하였다. 이전의 연구는이 패러다임은 optogenetic 자극 ^1,8에서 강력한 BOLD 신호를 생성하는 것으로 나타났습니다. 1 활성화 복셀은 자극 (운동 피질)의 로컬 사이트에서 모두 검출 쇼와 시상에 그림, 장거리 시냅스 연결의 결과로 이들 영역 사이.도 2는 시상 응답 지연으로 시각 정보가 HRFs로부터 수집 될 수 있음을 보여준다 (낮은 초기 기울기) optogenetic 자극 후의 운동 피질 응답과 비교 하였다.

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모터 피질 세포를 CaMKIIa가 발현의 Optogenetic 자극에 의해 유도 된 BOLD 신호 그림 1. 활성화지도. 상당히 반복 자극에 동기화하는 것으로 확인 활성 복셀의 일관성 값은하는 T2 강조 관상 해부학 조각에 겹쳐 표시됩니다. 데이터는 하나의 활성화 맵에 응축된다 (473 nm의 광, 20 Hz에서 15 msec의 펄스 폭 / 40 초 Off 20 초 처음 30 초 기준 여섯 자극주기) 여섯 분 30 초에 걸쳐 수집 하였다. 순차 조각은 0.5 mm 떨어져 및 광섬유 임플란트의 위치가 삼각형으로 표시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

촬영시 피사체의 모션 데이터가 손상 될 수있는 이슈의 중요한 소스입니다. 적절한 마취 적절한 수준을 유지하는 것 같은 아티팩트를 최소화 할 수있는 촬상 크래들 동물을 고정. 여기, 우리는 이소 플루 란되지만, 메데 토미 또는 케타민과 자일 라진과 같은 대체 마취제를 사용, 또한 고려되어야한다. 그러나, 마취제의 레벨 선택은 BOLD 응답 ^(28)을 포함하여, 뇌의 많은 매개 변수에 영향을 미칠 수있다. 이소 플루 란은 신경 흥분 ^(29)의 변화를 일으킬 수 있습니다. 다른 마취제는 GABA 시냅스 억제 ^{(30)에 영향을 줄} 수 있습니다. ofMRI가 신경 세포 활성도에 영향을 미칠 수있는 능력을 부여 수행 할 때 즉, 마취의 선택은 중요하다. 마취의 부재 ofMRI 가능하지만 동물 길들여 경우 감소 될 수있는, 동물에서 증가 된 운동으로 도전 될 수있다 이러한 웨이크 ofMRI 연구는 이전에 수행되어왔다차 뇌 ^9,10에 마취의 혼란 효과를 피할 것이다. 후 처리 동작 보정 알고리즘이 크게 움직임의 영향을 완화하기 위해 사용될 수있다. 이들 방법 중 일부는 보정하에 사각형 선정 기준 화상의 함수 및 이미지의 합을 최소화하는 이러한 프로토콜에 사용되는 역 가우스 뉴튼 알고리즘을 포함하여 존재한다. 이 처리 기간 ^(27)을 감소시키기 위해 GPU 병렬 플랫폼 설계를 사용하여 신속하고 강력한 모션 보정이 가능하기 때문에이 알고리즘이 유용하다.

이 프로토콜의 데이터 재구성 들어, MATLAB 환경에서 사용자 작성된 소프트웨어는 나선형 시료 격자 이미지로 ^31-33 k- 스페이스에 재구성 이차원 리딩 재건을 위해 사용되었다. 시계열 데이터는 자극하기에 앞서 수집 된베이스 라인 기간에 각 복셀 상대의 BOLD 신호의 비율 변조를 계산함으로써 생성 하였다. 그 시간 시리즈 복셀은 SYN했다활성화 복셀로 정의 된 0.35 이상의 코 히어 런스 값 optogenetic 자극 블록 chronized; 이 코 히어 런스 값은 이하 ^10-9 P 값 ^(8)에 대응한다. 푸리에 변환의 크기가 모든 주파수 성분 ^8,27의 제곱합으로 나누어 반복 자극 사이클의 주파수 변환으로 코 히어 런스 값을 계산 하였다. Familywise 에러는 다중 비교를 위해 본 페로 니 보정을 사용하여 제어 될 수있다. 분석의 다른 방법은 같은 일반 선형 모델 (GLMS)와 같은 파라 메트릭 통계 테스트를 포함하여, 사용할 수 있습니다. 일관성 방법은 종래의 일반적인 선형 모델에 비해 적은 HRF에 대한 사전 지식을 필요로한다. ofMRI를 사용하여 데이터를 탐색 할 때 때문에, 유리하다. 그러나, 간섭 방법은 오직 간격 interstimulus 고정되고 다른 이벤트와 RELA ofMRI 데이터에서 사용되지 않을 경우에 관련된 설계 블록 디자인 데이터 사용 또는 선택 될 수있다테드는 디자인 또는 혼합 디자인. 이어서, 동적 인과 모델링 (DCM)을 통해 식별 ofMRI 뇌 영역 사이의 상호 작용을 분석하는데 사용될 수있다. DCM은 자기 공명 ⁽³⁴⁾ 동안 실험 입력에 대한 시스템 응답에서 기능적 연결성 분석을 위해 개발 된 베이지안 통계 기법이다.

ofMRI에 대한 추가 기술적 인 문제는 여기에서 논의된다. 임플란트가 손상되거나 연구에서 영향을받는 동물의 제거로 이어지는 떨어질 수 있습니다. 재 이식 수술로 인해 동물 복지 문제에 대한 원래의 이식 수술로 인해 동일한 투자 수익 (ROI)을 대상으로하는 추가 불확실성에 권장되지 않습니다. 때문에 각 동물 대상에 투자 된 시간과 리소스의 상당한 양의 재료의 강도를 고려 ofMRI 연구에 사용하기위한 적절한 치과 용 시멘트를 선택하는 중요한 관심사이다. 이식 수술은 IMPLAN의 수명을 극대화하는 중요한 요소이다t 동물 될 수 있습니다. 예를 들어, 두개골 연구 동안 동물의 전위 개월 긴 막대 위에 안정성을 확보 할 수있는 세라믹 페룰 임플란트 주위 시멘트 적당량을 치과 용 시멘트를 도포하고 배치하기 전에 건조 것을 보장한다. 또한, 다른 케이지 디자인 탐구 종종 케이지에 돌출 와이어 음식을 들고 탑 물 케이지를 방지하고, 주입 손상을 동물을위한 기회를 제공하기 위해 로컬 동물 보호 시설로 설명 될 수있다. 중요한 것은, 치과 용 시멘트는 이미징 및 다른 시멘트는 동물 실험에 사용하기 전에 스캐너에서 팬텀 및 이미징에 응용 프로그램을 테스트 할 수에 영향 유물을 줄이기 위해 신중하게 선택해야합니다. 다양한 치과 용 시멘트로 시행 착오는이 프로토콜에서 사용되는 시멘트는 비교적 적은 아티팩트를주는 것으로 나타났다. ofMRI을 수행하는 또 다른 기술적 과제는 extr 주어진 의도 된 ROI에서 광섬유 위치의 정확성이다뇌 ^(35)에 핵 사이에 존재할 수 emely 작은 거리. 이식 수술을 마친 후, T2 강조 해부 검사는 뇌 아틀라스에 중첩하여 정확한 위치를 결정하는데 사용될 수있다. 외과 의사 이러한 수술을 수행하는 연습의 기술은 정확한 위치 속도를 향상시킬 수 있습니다. 의도 된 ROI의 특이성 및 옵신 발현 동물을 관류 뇌 고정, 면역 또는 시각화 옵신로 태그 된 리포터 단백질의 내인성 형광을 사용하여 연구의 결론에서 확인할 수있다. 이러한 리포터 단백질은 옵신 원하는 신경 세포 형태 ^1,8,15,25 표현되도록 다른 단백질 colocalized 수있다. 앞서 언급 한 바와 같이 빛 전달 ^(22)에 의한 조직 가열 ofMRI을 수행 할 때, 이슈가 발생할 수 있습니다. 조직 가열 거짓 BOLD 신호의 결과로, 휴식 시간의 변경이 발생합니다. 그 교류를 보장하기 위해ofMRI 동안 빛 자극에 의​​한 tivati​​on이 이슈로 인해 아니라, 옵신 음성 제어하는​​ (예 AAV-CaMKIIa - EYFP)를 제어 형광 벡터 주입 식염수 주입 동물이나 동물 중 하나가 ofMRI를 받아야 수행해야합니다. 또한, 좋은 광 투과 효율 만 잘 구성된 광섬유 임플란트는 높은 레이저 파워를 사용할 필요성을 제거하기 위해 사용되어야한다. ofMRI 연구 인해 조직 가열되는 거짓 활성화에 수행 된이 문제가 ^{1,6-8,10,11되지} 않았습니다.

표현 뉴런에 필요한 optogenetic 유전자를 도입하는 벡터의 선택에 관해서는, AAVs은 인간의 질병을 일으키는 것으로 알려져 있으므로 편리한 옵션이며, 이러한 에이전트 (BSL-1)를 사용하는 데 필요한 낮은 바이오 안전성 수준을 제공하지 않습니다. 또한, 벡터 코어의 군중은 재고 및 여러 혈청 형과 다양한 optogenetic 유전자와 함께 패키지 AAVs을 수행한다. AAV의 혈청 형은 b를 선택해야합니다최적의 발현 수준 ^{(36, 37)를} 위해 의도 된 세포 집단을 대상 ased. 렌티 바이러스는 사용하지만, 더 높은 수준의 바이오 필요할 수있다. optogenetic 유전자의 충분한 발현을 위해 필요한 시간은 사용되는 특정 AAV와 특정 실험 패러다임에서, 사용 된 특정 동물 모델에 따라 가변적이다. 이 프로토콜에서, 11 주 이전에 스프 라그 돌리 쥐를 사용하고 optogenetic 연구는 바이러스 주사 후 4 주에서 6 주를 시작합니다. 트랜스 제닉 마우스는 또한 optogenetic 연구에 사용될 수있다. opsins 충분히 발현에 필요한 시간의 특정 량을 결정하기 위해 파일럿 실험을 수행 할 필요가있다. 자극 패러다임은 사용되는 특정 옵신에 따라 달라질 수 있습니다. 이 프로토콜에서 AAV5 - CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP를 사용하고, 자극 패러다임은 / 40 초 오프 20 초입니다. SSFO는 AC로 빛의 짧은 펄스를 필요 때문에 SSFO를 사용하는 경우, 자극 패러다임 달라질tivated 다음 다른 파장에서 빛의 짧은 펄스가 종료 될 수 있습니다.

ofMRI는 동물이 마취 경우에도, 시각적 자극 유래 교란 뇌 신호 방지 optogenetic 자극 동안 광섬유 패치 케이블 페룰 임플란트 계면에서 빛의 누설을 방지한다 수행 추가적인 중요한 관심사. 흑색 전기 테이프 콘 페룰로부터의 광을 차단하고, 동물의 눈을 커버하기 위해 사용될 수있다. 중요한 것은 환자의 호기 CO ₂ 및 신체 온도를 포함한 생리 값 적절히 촬상 기간에 걸쳐 유지되어야한다. 37 ℃에서 4 % 체온 - 호기 CO ₂ (3) 사이에 유지되어야한다. 또한 shimming 서열은 종래 ofMRI 크게 스캔 얻어진 BOLD 데이터의 품질을 결정 시작하기 자장 가능한 불균일성을 감소시킨다. 이러한 요소의 제어신뢰성 ofMRI 데이터 생성에 중요하다. 이 프로토콜에서, DPSS 레이저는 optogenetic 자극 용 광원으로서 사용된다. 레이저 광의가 간섭 성이므로, 충분한 전력을 용이하게 광섬유를 통해 공급 될 수있다. 광섬유에 결합 된 LED 광원은 상용 공급 업체에서 사용할 수 있지만, 광 투과율의 감소 힘의 단점이있다. 레이저 광원은, 각각의 특정 광섬유 패치 케이블 정렬이 필요하지하지만 연습, 배향 분 초 내에 달성 될 수있다.

ofMRI 미래 애플리케이션은 이미징 동안 비 침습적 자극을 사용하는 적색 편이 opsins 같은 차세대 opsins의 사용을 포함한다. 또한, MRI 호환 EEG 또는 광섬유 임플란트와 함께 유사한 기록 전극의 주입 MRI의 높은 공간 해상도 데이터 외에 높은 시간 해상도 데이터의 포착을 허용 할 수있다. ofMRI와 electrophysiological 기록 뇌의 기능적 연결성에 광범위한 정보를 제공 할 수있다. 요약하면, 유전자 또는 해부학 신원 의해 정의 특정 세포 집단의 자극에 응답하여 전체 뇌를 모니터링 ofMRI의 힘 ofMRI에게 신경계 질환의 연구 및 건강한 뇌의 connectomics의 사용에 중요한 도구를 만든다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7 테슬라 스캐너	Agilent Technologies	Discovery MR901 시스템
Sprague Dawley 쥐	Charles River	Crl:SD	11주 된
섬유 식칼	Fujikura	CT-05
멀티모드 광섬유	Thor Labs	AFS105/125Y
섬유 스트리퍼;	Thor Labs	T08S13
세라믹 분할 슬리브	정밀 섬유 제품	SM-CS1140S
에폭시 접착제	Thor Labs	G14250
면 팁 애플리케이터	Stoelting Co.	50975
다중 모드 세라믹 지르코니아 페룰	정밀 섬유 제품	MM-FER2002
FC/PC 다중 모드 커넥터	Thor Labs	30128C3
광섬유 연마 디스크	정밀 섬유 제품	M1-80754
알루미늄 산화물 래핑 시트, 0.3 &마이크로; m	Thor Labs	LFG03P
알루미늄 산화물 래핑 시트, 1 &마이크로; m	Thor Labs	LFG1P
알루미늄 산화물 래핑 시트, 3 &마이크로; m	Thor Labs	LFG3P
쌍안 생물 현미경 40X-1,000X	Amscope	B100
레이저 보안경	Kentek	KXL-62W01
473nm DPSS 레이저	Laserglow	LRS-0473
594nm DPSS 레이저	Laserglow	LRS-0594
Allen 육각 렌치 세트			레이저 파워 미터에서 커플러의 초점에 섬유 팁을 정렬하기 위한 2.0 mm (5/64"
), Si 센서, 400-1,100 nm	Thor Labs	PM121D
Isoflurane (Isothesia)	Henry Schein	50033
인덕션 챔버가 있는 이소플루란 기화기	VetEquip	901806
NanoFil 100 µ l 주사기	세계 정밀 기기	NANOFIL-100
UltraMicroPump SYS-Micro4 컨트롤러 세계	정밀 기기	UMP3-1
함수 발생기	A.M.P.I.	Master-8
작은 동물 스테레오탁	David Kopf Instruments	모델 940
모델 683 소형 동물 인공호흡기	Harvard Apparatus	550000
Type 340 캡노그래프	Harvard Apparatus	733809
dental drill (rotary micromotor kit)	Foredom Electric Co.	K.1070
안과 연고 (인공 눈물)	럭비	00536-6550-91
기기 살균기	CellPoint Scientific	Germinator 500	유리 구슬 살균기
항생제 분말	화이자	NEO-PREDEF	네오 마이신 설페이트, 이소 플루돈 아세테이트 및 테트라 카인 염산염
부프레노르핀 진통제	호스피라	NDC:0409-2012	Schedule III 규제 물질, 0.3 mg/ml 원료