유동 세포 계측법에 의해 A549 세포의 부착 및 국제화 인플루엔자의 바이러스를 측정

요약

우리는 인플루엔자 A 바이러스가 A549 세포에 부착하는 것과 유세포 분석을 통해 바이러스 입자가 표적 세포로 내재화되는 것을 모두 측정하기 위한 반정량적 방법을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

표적 세포에 대한 부착 후 내재화는 인플루엔자 A 바이러스(IAV)의 수명 주기의 첫 번째 단계입니다. 여기에서는 인간의 폐 상피 세포주인 A549 세포에 부착하는 바이러스 입자의 양과 세포에 내재화된 입자의 양에 대한 상대적 변화를 측정하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 당사는 Cy3 표지 스트렙타비딘(STV-Cy3)으로 염색한 후 쉽게 검출할 수 있는 비오틴화 바이러스를 사용합니다. 우리는 널리 사용되는 IAV 실험실 균주인 A/WSN/33의 성장, 정제 및 비오틴화에 대해 설명합니다. A549 세포의 저온 결합 비오틴화 IAV 입자는 STV-Cy3로 염색되고 유세포 분석을 사용하여 측정됩니다. 바이러스 입자의 흡수를 조사하기 위해 저온 결합 바이러스는 37°C에서 내재화할 수 있습니다. 외부 바이러스 입자와 내부화된 바이러스 입자를 구별하기 위해 차단 단계가 적용됩니다: 세포 표면에 부착된 바이러스의 비오틴에 있는 자유 결합 반점은 표지되지 않은 스트렙타비딘(STV)에 의해 결합됩니다. 이후 STV-Cy3로 세포를 투과하고 염색하면 내부화된 바이러스 입자를 검출할 수 있습니다. 내재화된 바이러스의 상대적인 양을 결정하기 위한 계산을 제시합니다. 이 분석은 IAV의 부착 또는 내재화에 대한 약물 치료 또는 기타 조작의 효과를 측정하는 데 적합합니다.

서론

인플루엔자 바이러스 (IAV)의 엔트리 ⁽¹⁾ 표적 세포의 세포막 수용체에 바이러스의 결합으로 시작 다단계 공정이다. IAV의 수용체는 당 단백질과 당지질의 큰 다양성에 존재하는 시알 산이다. 바이러스 엔벨로프에 존재 IAV의 헤 마글 루티 닌 (HA) 단백질은 시알 산에 결합함으로써 표적 세포 ^(2)의 세포막에 바이러스 입자의 부착을 매개한다. 바이러스는 ^3-6 설명되었다 클라 트린 매개 엔도 시토 시스를 통하여 세포뿐만 아니라, macropinocytosis 같은 대체 입력 경로를 들어간다. HA 및 시알 산 사이의 상호 작용은 모두 중재 첨부 파일 및 바이러스 입자 ^(7)의 내재화를 유발하기에 충분한 것으로 보인다. 그럼에도 불구하고, 대안적인 엔트리 수용체가 제안되었으며, IAV 항목의 역할은 현재 ^1,8,9을 연구되고있다.

똥개다발 적 노력 시급 신규 항 바이러스 요법 ^10-12을 개발 목표로 바이러스의 라이프 사이클에 관여하는 숙주 요인을 파악하게된다. 바이러스 엔트리는 그 최초의 지점에서 바이러스 감염을 차단하기 위해 IAV 성장 타겟팅 유리한 공정이 될 것이다. 바이러스 보통 다량 들어오는 바이러스를 검출하는....

프로토콜

전에 시작 주 : 사용 층류 후드 및 적절한 biocontainment을 라이브 바이러스에 작업 할 때. 여기서는 배양 인플루엔자 바이러스 균주 A / WSN / 33에 적합한 성장 조건을 설명한다. 감염의 다중성 (MOI)와 배양 시간은 사용 바이러스 균주에 따라 달라질 수 있습니다.

바이오틴 / WSN / 33 바이러스의 1. 준비

1. 시드 Madin-다비 송곳니 kindey (MDCK), 10 % FBS, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (PEN / 패 혈성)이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 사용하여 ² cm의 T175 플라스크에 세포. 약 70 %의 전면 생장까지 37 ℃에서 배양 된 세포로 진행한다.
2. 감염 전에 배지 제거하고 세포 단층을 덮도록 충분한 양을 첨가하여 인산염 완충 식염수 (PBS, pH7.0-7.3)으로 세포를 세척 하였다.
3. PBS를 제거하고 ^10-4의 방어와 A / WSN / 33 세포를 감염. PBS에 바이러스를 희석은 0.02 mg의 마그네슘 ^2+, 0.01 mg의 칼슘 ^{2 + <보충}/ SUP>, 0.3 % 소 혈청 알부민 (BSA), 1 % 펜 / 스트렙토 (....

결과

네 개의 다른 실험 조건을 나타내는 만화는도 1에 도시되는 대표적인 실험의 결과는도 2에 제시된다 -. 5. "0 분"샘플에서 바이오틴 바이러스 초기 바인딩 된 STV-Cy3에 염색으로 가시화 될 수있는 세포를 대상으로 (도 1 및도 2). ( "0 분 + STV"샘플에서) 차단하는 단계가 적용되는 경우, 세포 표면에서 바이러스가 더 이상 STV-Cy3에 염색에 의해 검출 될 수 없다. 결과적으로, "0 분 + STV"샘플 신호 강도가 강한 (도 1 및 2) "0 분」시료에 비해 감소된다. 37 ° C까지 온도를 상승시, 첨부 된 바이러스는 세포 ( "30 분"샘플)에 흡수된다. 내면화 바이러스는 & #에서 신호 강도에 덜 극적인 하락을 초래 레이블이없는 STV.......

토론

우리의 프로토콜은 유동 세포 계측법에 의해 바이러스 첨부 파일 및 내재화를 측정하는 쉬운 방법을 설명합니다. 또한 바이러스 유사 입자 (VLP)의 사용에 비해 더 가깝게 모방하는 바이러스 감염 표지 야생형 바이러스의 사용을 허용한다. 우리 프로토콜 IAV의 부착 및 내재화를 측정하는 데 최적화되어 있지만 이는 다른 바이러스를 쉽게 적용 할 수있다. 유동 세포 계측법은 판독에 사용되는 바와 같이 또한, 공동 착색을 용이하게 목적 단백질의 과발현 다음 최저 또는 발현 수준을 테스트하기 위해 프로토콜 등을 첨가 할 수있다. 따라서, 분석은 개인의 필요에 따라 프로토콜의 변형을 허용한다. 참고로, 분석은 또한 운동 시간 정보를 통해 바이러스 내재화를 측정하고 얻기 시점 일련에 대하여 수행 될 수있다. 분석 알 수없는 국제화 반응 속도와 다른 바이러스 적용 할 것 인 경우에 특히 중요 할 수 있습니다.

하우버전, 그것의 검출 창 인해 바이러스 복제의 부재에의 부착 또는.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM	Life Technologies	41966-052
FBS	Life Technologies	10270-106
페니실린-스트렙토마이신	Life Technologies	15140-163
PBS	Life Technologies	14190-169
BSA	VWR Calbiochem	126579
HEPES	Life Technologies	15630-100
D-Sucrose	Fluka	84100
TRIS	Biosolve BV	20092391
EDTA	Sigma-Aldrich	3680
EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN 키트	Fisher Scientific	W9971E
Bio Rad 단백질 바이오 분석	Bio Rad	500-0006
딥웰 튜브 (1.2 ml 마이크로튜브)	Milian	82 00 001
PFA	루세르나 화학  전자 현미경 과학	15710
초원심분리기 튜브	Hemotec HmbH	253070
Triton X-100	Fluka	93420
STV-Cy3	Life Technologies	43-4315
STV	Life Technologies	43-4302
아지드화나트륨	Fluka	71290
세균성 뉴라미니다아제/ 시알리다제	시그마-알드리치	N6514-1UN