Method Article

멤브레인 운송은 단일 단백질 해상도에서 고도의 병렬 나노 기공 칩 시스템에 의해 분석 처리합니다

DOI:

10.3791/53373

⸱

August 16th, 2016

 ,  , 
1Institute of Biochemistry, Biocenter, Goethe University Frankfurt, 2Nanospot GmbH

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

제시된 프로토콜은 공극 스패닝 무용매 지질 이중층을 사용하여 단일 수송체 수준에서 막 단백질 매개 수송을 분석하는 방법을 설명합니다. 이는 대단히 병렬적인 데이터 수집 및 분석과 결합된 대량 생산된 나노포어 어레이 칩을 생성함으로써 달성되며, 향후 멤브레인 단백질 이펙터 스크리닝의 확립을 가능하게 합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

전좌 기판 비 electrogenic 경우 단일 단백질 수준에서 세포막 단백질 수송 여전히 상세한 분석을 기피한다. 상당한 노력이 분야에서 제조되었지만, 막 수송의 분석에 필요한 무용제 지질 이중층 기술과 조합하여 높은 처리량 자동 반송 분석을 가능 기술들은 드물다. 운송의이 클래스는 그러나 세포 항상성에 중요한 따라서 신약 개발과 새로운 통찰력을 얻을 수있는 방법론의 주요 대상이 절실히 필요하다.

여기에 제시된 논문은 단일 트랜스 해상도 세포막 단백질 매개 수송 과정의 분석을위한 신규 한 바이오칩의 확립 및 처리를 설명. 바이오칩은 설계에서 매우 평행하고 산업 등급과 양으로 제조 할 수 나노 기공으로 둘러싸인 미세 공동으로 구성된다. 단백질 형질 리포좀에 직접 적용 할 수있다SSM-기술을 이용하여 자기 조립 기공 걸친 지질 이중층을 구성하는 칩면 (고체 지질 막을 지원됨). 막의 일부가 자립으로 또는 실시간 다중 분광 형광 판독 하였다 가능 캐비티 공간에서 기판 전위에 대한 인터페이스를 제공하는 세공은 스패닝. 표준 작업 절차 (SOP)의 설립은 기능적으로 재구성 될 수있는 거의 모든 막 단백질 칩 표면에 단백질 형질 지질 이중층의 간단한 구축을 허용한다. 유일한 필수 비 electrogenic 기판 반송 용 형광 판독 시스템의 구축이다.

하이 콘텐츠 스크리닝 응용 병렬 다중 칩 녹화 자동 반전 된 형광 현미경을 사용하여 accomplishable이다. 큰 데이터 세트는 자유롭게 사용할 맞춤 설계 해석 소프트웨어를 사용하여 분석 될 수있다. 세 가지 색 멀티 스펙트럼 형광판독 또한 거짓 긍정적 인 결과를 제거, 다른 이벤트 클래스로 편견 데이터 차별을 허용합니다.

칩 기술은 현재의 SiO2 표면을 기반으로하지만, 금 코팅 칩 표면을 사용하여 추가로 작용하는 것도 가능하다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

막 단백질의 분석은 지난 20 년 동안 기본 및 제약 연구에 대한 관심이 증가되고있다. 신약 개발은 현재 제한 요인 중 하나 인, 식별 및 새로운 목표의 상세한 특성에 의존한다. 모든 약물 표적의 약 60 %는 단백질 막 한 사실이 기술의 개발은 그 기능이 가장 중요 규명 할 수있다.

4 - 과거 electrogenic 채널 및 수송을 연구하는 기술이 다수 개발되었다. 반면에 비 electrogenic 기판은 더 어려운 과제를 제시한다. 그들은 캐스케이드 5 시그널링 키 수용체로서 세포막 기능 및 전체 용질 및 영양소의 유동을 제어하는대로 그러나 프라임 약물 표적으로서 특별한 관심이다.

상당한 노력이 t의 개발에 투입하고있다echniques은 막 수송 단백질 (6), (7)의 기능을 연구한다. 몇 가지 이름 고체 지원 지질 이중층, 닿는 이중층 11, 12, microblack 지질 막 13, 14 및 기본 소포 어레....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

대형 단일 층 소포 1. 준비 (LUVs)

  1. 먼지 입자를 제거하기 위해 질소 가스 둥근 바닥 플라스크 (10 ㎖ 부피)를 청소한다. 에탄올로 둥근 바닥 플라스크를 씻어.
    참고 : 잔류 에탄올이 허용 될 수 있으며, 다음 단계를 방해하지 않습니다.
  2. 어떤 오염을 제거하기 위해, 클로로포름으로 1 ml의 유리 주사기의 4 배를 씻으십시오. 둥근 바닥 플라스크에 4- ML의 SoyPC20 (클로로포름 25 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 0.1 몰 %의 최종 농도로 추가 도핑 ATTO 390 지질 용액을 도핑.
    주 : ATTO 390 대신 DOPE 다른 형광 표지 된 지질 또는 친 유성 염료를 사용할 수 있으며, 사용 가능한 여진 원에 따라.
  3. 회전 증발기에 둥근 바닥 플라스크를 연결합니다. 플라스크의 유리 벽에 균일 지질 막을 형성, 300 mbar에서, 30 ℃의 수조 온도와 최대 회전 속도로 40 분 동안 지질 막을 건조.
  4. TRANSFER을 실온에서 추가로 30 분 동안 고 진공 펌프 건조한 지질 필름 플라스크.
  5. 플라스크 8 유리 구슬 (2.7 mm 직경, 에탄올 세척 및 건조) 5 ml의 버퍼 (멸균 여과 2....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

기공 멤브레인 스패닝 쉽게 자기 조립 방식으로 나노 칩 표면 상에 생성 될 수있다. 그러나 기본 프로세스는 여전히 섬세하고 리포좀의 크기, 리포좀 인구, lamellarity, 지질 및 소금 농도와 화학적 표면 특성의 단 분산 같은 많은 매개 변수에 의해 영향을 받는다. 이러한 매개 변수의 대부분은주의 깊게 특징 및 위의 프로토콜 표준화되었다. 그러나 모든 새로운 제조시 확인해야 다른 매개 변수, 성공적인 실험을 보장합니다. 이러한 리포솜 크기 분포 및 인구 분산도 (도.이 A)이다. 최적의 기공 스패닝 제막과 잘 공경 상기 캐비티 공간 리포솜 크기로 리포좀의 침입을 방지하기 위해 필수적이다. 또한, 단 분산 리포좀 제제는 확산 및 FUSI 막에서 최상의 결과를 생성하는 것으로 나타났다에. 모든 제조 확인하는 또 다른 중요한 단계는 재구성 후 단백질 활성이다. 후 MsCl

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시된 기술은 막 단백질 수송의 고도의 병렬 분석을 할 수 있습니다. 재구성 세포막 단백질 시스템은 직접 이론적마다 막 수송 체의 적응을 가능 또는 채널은 바이오 칩에 적용될 수있다. 전송 분석은 직접 형광 변화 (형광의 전위 또는 형광 표지 된 기판) 또는 간접 형광 변화 (pH 민감성 염료, 보조 효소 반응)을 통해 중, 형광 판독 시스템의 구축에 의해 제한된다. 후자는 그러나 아직 확립되어야한다.

단일 단백질 수준에서 막 채널 또는 운송의 기능 특성이 기술의 주요 초점이다. 자동화 현미경과 결합하여 단백질 이펙터 선별 애플리케이션의 구축이 가능하다. 분석 설정은 각각의 칩에 여러 개의 분석 포인트, 최대 8 개의 칩을 병렬 녹화를 할 수 있습니다. 때문에 칩의 완전한 분리, 그것은 조건이 설정 한 후에는 여러 실험적인 반복은 하나의 실험 실행에 컨트롤을 포함하여 허용, 진정으로 평행하다.

실험 설정시 중요한 단계.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SOP를 수립하는 데 도움을 준 Barbara Windschiegl에게 감사드립니다. Dennis Remme는 NanoCalcFX 소프트웨어에 대한 작업을 해왔으며 Alina Kollmannsperger, Markus Braner 및 Milan Gerovac은 원고에 대한 유용한 제안을 제공했습니다. DFG와 독일 연방 교육연구부(Federal Ministry of Education and Research)가 R.T.에 제공한 독일-이스라엘 프로젝트 협력(DIP)과 R.T. 및 Nanospot GmbH에 대한 연방 경제기술부(ZIM R&D Project)가 이 작업을 지원했습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<강>시약
[2-(트리메틸암모늄)에틸]
메탄에티오설포네이		토론토 연구 화학제품 Inc.T792900MTSET; 물에 의해 가수화됩니다. 건조 분말 부분 표본을 -80 °C로 유지하십시오. 완충액에 가용화 후 즉시(30분) 사용하십시오.
1ml 기밀 주사기Hamilton#1001
10ml 원형 플라스크Schott Duran
2.7mm 유리 비즈RothN032.1
2-프로판올Roth9866.5
30cm Luer-Lock 확장 튜브Sarstedt744304
AcetoneRoth5025.5
Bio-Beads SM-2 흡착제Bio-Rad152-3920처음 사용하기 전에 활성화해야
CaCl2 DihydratRothHN04.3
CalceinSigmaC0875-20°C에서 어둡게 보관합니다. C
클로로포름 시약 등급VWR 화학 물질22711324
DOPEATTO390ATTO-TECAD 390-165-20 °에서 어둡게 저장; C
에탄올 앱솔루트Sigma-Aldrich32205
Injekt 일회용 주사기Braun460 60 51V
Injekt-F 일회용 주사기Braun91 66 017V
Keck 클립SchottKC29
L-α-Phosphatidylcholine, 20% (Soy)Avanti Polar Lipids5416016 -20°C에서 불활성 가스 아래에 저장합니다. C
NaCl 99.5% 정제Roth3957.2
Nanopore E100 웨이퍼/칩Micromotive (Mainz/Germany)요청 시 사용 가능
Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 µ mWhatman800282
Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)life TechnologiesD-7173상점 -20 °에서 어둡다. C
Oy647Luminartis (Mü nster/Germany)OY-647-T-1mg매장 어둡게 -20 ° C
Rotilabo-syringe 여과, 비멸균, 기공 크기 0.22 &마이크로; mRothP 818.1
Sephadex G-50Sigma-AldrichG5080컬럼 재료 크기 배제 크로마토그래피용
Silastic MDX4-4210다우코닝경화제 커버 유리 지지대에 칩 고정용
접착 슬라이드 8-웰ibidi80828멀티 웰 챔버 유리 슬라이드(칩 홀더)에 장착하기 위한 3
방향 스토콕 블루Sarstedt744410001
Tris Pufferan 99.9% Ultra QualityRoth5429.2
Triton-X 100Roth6683.1
Whatman 0.2 µ m 셀룰로오스 질산염 멤브레인 필터RothNH69.1
NameCompany카탈로그 번호Comments
Equipment
Bü chi 461 수조Bü 치
Bü chi Rotavapor RE 111Bü chi
Cary Eclipse 형광 분광계 Varian
LiposoFast 미니 압출기Avestin
멤브레인 펌프 Vaccubrand15430
Nanosight 나노 입자 추적 현미경Malvern / NanosightLM 14C
NyONE 현미경Synentec요청시 사용 가능
펌프 제어VaccubrandCVC 2II
초음파 발생기 목욕 Sonorex RK100HBrandelin 전자31200001107477
진공 펌프 RC5Vaccubrand1805400204
수조 W13Haake002-9910
플라즈마 클리너 PDC-37GHarrick 플라즈마PDC-37G
NameCompany카탈로그 번호Comments
Software
ImageJ오픈 소스http://imagej.nih.gov/ij/과학적 이미지 처리 소프트웨어
NanoCalcFX프리웨어대규모 수송 키네틱 데이터 세트를위한 http://sourceforge.net/projects/nanocalc/ 데이터 분석 / 평가 소프트웨어
NTA 2.3 분석 소프트웨어나노 입자 추적을위한 Nanosight데이터 수집 및 분석 소프트웨어 현미경
NTA 2.3 온도 통신나노 입자 추적 현미경 용Nanosight
트 은 합니다. 는 온도 제어 소프트웨어

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. Drug-target network. Nat Biotechnol. 25, 1119(2007).
  2. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free me....

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