초파리의 앞다리와 주둥이는 미각 감각 뉴런의 풍부한 레퍼토리를 포함하고 있습니다. 여기에서는 칼슘 이미징을 사용하여 미각 페로몬의 외인성 적용 시 살아있는 파리의 앞다리와 주둥이에 있는 감각 뉴런의 생리적 반응을 측정하는 방법을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
포유 동물과는 달리, 이러한 초파리와 같은 곤충은 여러 맛 기관이있다. 다리, 코, 날개 초파리의 산란관의 화학 감각 뉴런 미각 수용체 1,2, 이온 채널 3-6, 휘발성 및 비 휘발성 감각 큐의 검출에 참여하는 이온 성 수용체 (7)를 표현한다. 이 신경 세포는 직접 식품, 유해 물질 및 페로몬 등 tastants 문의 따라서 이러한 공급, 달걀 누워와 결합 많은 복잡한 행동에 영향을 미친다. 전극 기록 칼슘 촬상 널리 이러한 tastants 의해 유발 된 신경 세포 반응을 정량화하는 곤충에 사용되어왔다. 그러나, 전기 생리학은 세포 유형, 크기 및 위치에 따라 기술적으로 어려울 수있는 하나의 맛 sensillum 특화된 장비 및 구하는 측정을 필요로한다. 또한, 초파리에서 단일 신경 세포 해상도는 맛 sensilla 허우 때문에 달성하기가 어려울 수 있습니다화학 감각 신경 세포의 자체 이상의 유형입니다. 여기에 설명 된 실시간 칼슘 이미징 법 라이브 파리 단일 미각 뉴런의 반응을 측정 할 수있다. 이 방법은 수성 용매에 대한 낮은 용해도를 지질 페로몬 및 기타 리간드 유형의 연결 반응을 영상화에 특히 적합하다.
서론
동물들은 생존과 재생에 필수적인 의사 결정을 중재하는 후각과 미각 정보에 의존합니다. 감지 신경계에 의해 처리하는 방법을 화학 감각 단서 이해하는 감각 수용체 (들) 및 해당 화학 리간드의 확인이 필요합니다. 초파리는 휘발성 및 비 휘발성 화합물의 엄청난 다양성을 감지하고 생리를 연구하기에 좋은 모델입니다 메커니즘은 chemosensation을 기본. 후각 기관은 휘발성 분자를 감지하는 동안, 미각 기관은 낮은 휘발성 화합물을 검출하는 전문으로하고 있습니다. 여기서는 직접 저 휘발성 친 리간드 초파리 melanogaster의 맛 기관에서 신경 반응을 측정하는 방법을 제시한다.
파리의 미각 기관은 앞다리, 코, 날개 등이 있습니다. S 응답 sensilla 알려진 모발 형 구조는 미각 기관의 표면에 분포ugars, 쓴 맛, 소금, 물, 페로몬 8. sensilla 맛 강모으로 형태 학적으로 분류 된 맛은 9 쐐기. 긴 (L 형)으로 분류 된 labellum에 약 31 맛 강모, 짧은 (S 형) 및 중간 (i 형) 모폴로지가 있습니다. 설탕에 생리 학적 반응하는 'L'과 '의'sensilla 집 4 감각 뉴런 (S 셀), 저염합니다 (L1 ....
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프로토콜
1. 샘플 준비
- (; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40 1,118w) UAS-GCaMP5G (19) 파리에 GAL4 3,22 드라이버 라인을 교차. 십자가가 25 ° C에서 성장 할 수 있습니다.
참고 : 생성은 형광 신호 강도를 향상하는 데 도움이 할 수있는 GAL4 또는 UAS-GCaMP 유전자의 여러 복사본으로 날아갑니다. Gr68a-GAL4 드라이버의 제어하에 발현 될 때 UAS-GCaMP 트랜스 (UAS-GCaMP3)의 이전 버전들은 매우 약한 형광 강도를 나타내었다.- 수집 섹스 새로 eclosed 성인 파리로 구분하고 25 ° C에서 올립니다.
참고 : GCaMP5G의 개화의 기준 레벨이 14~28일 세 사이 파리에 최적입니다. 섹스에 의해 파리를 분리하면 신경 반응에 영향을 미칠 수있는 사회적 상호 작용의 가능성을 배제.
- 수집 섹스 새로 eclosed 성인 파리로 구분하고 25 ° C에서 올립니다.
- CO 2의 온화한 기류 하에서 비행을 마취.
- f를를 부착LY 먼저 0.17 mm의 커버 슬립의 중심 매니큐어의 작은 방울을....
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결과
GCaMP 칼슘 표시기는 유 전적으로 Gr68a-GAL4 또는 ppk23-GAL4 드라이버를 사용하여 표현 하였다. 앞다리 신경 세포와 비 신경 지원 세포의 고유 한 인구는 각 드라이버 (그림 3A-C)에 의해 표시된다. 친 유성 페로몬 CH503 리간드에 특이 적 반응 Gr68a-GAL4 관찰하고 ppk23-GAL4 세포 GCaMP (도 3D)을 표현. 상대적인 GCaMP5G 신호 (ΔF / F)의 형광 강도의 변화는 CH503 (그림 3E)의 높은 농도로 증가했다. 흥미롭게 CH503의 5 NG 도즈는 신경 반응을 억제 할 수있다.
Gr68a 및 ppk23 뉴런 다른 응답 패턴을 나타냈다. ppk23 신경 세포는 phasic, 진동 응답 (그림 3G)를 보여 반면 Gr68a.......
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토론
우리는 여기에 2 개의 다른 감각 기관에 초파리 주변 신경 세포의 라이브 칼슘 이미징을 수행하는 방법을 설명합니다. 칼슘 2 +는 CH503은 용량 의존적 양적했다 페로몬 리간드에 의해 유도 Gr68a - 뉴런에서 GCaMP 형광 반응을 -evoked. 이 같은 phasic와 토닉 응답 등의 다른 신경 응답 패턴을 식별하는 것이 가능했다.
phasic 반응을 나타내는 신경 연속 자극에 빠른 적응을 할 수 있도록 믿어진다. 이러한 형태의 응답이 냄새 검출 (25) 및 리듬 운동 활동 패턴 (26)의 생성과 관련되어있다. 대조적으로, 다양한 감각 기관에 기술 된 신경 진동은 단일 시냅스 사이트에 다수의 입력을 동기화하고, 자극 (27)에 대해 고유의 기능을 전달하는 것으로 생각된다. ppk23 뉴런과 관련된 진동의 분자 적 기초는 아직 우리 KN에보고되지 않은owledge. 진동 응답을.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 싱가포르 국립 연구 재단(Singapore National Research Foundation)의 지원을 받았습니다(J.Y.Y.에 NRF-RF2010-06 보조금).
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재료
et al.
Z377821 세472301 프로토콜 섹션 Mori , 2010
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Gr68a-gal4 | H. Amrein(텍사스 A&)의 선물 M Health Science Center, TX, USA)와 J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA)의 선물 | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | 블루밍턴 초파리 주식 센터 | |
| 0.17 mm 커버슬립 (Gold-Seal 커버슬립) | 전자 현미경 서비스 | 63790-10 | |
| 네일 폴리시, "Hard as Nails Clear" | 샐리 한센 | ||
| PAP 펜 | 시그마-알드리치 | ||
| 페인트 브러시 | 밀한 브러시 | ||
| 테이프 | 스카치 브랜드 | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| 에탄올, 실험실 등급 | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC 등급 | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | 시그마-알드리치 | ||
| CH503 | Synthesis에 설명된 PBST | ||
| 레시피 | |||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| 현미경 (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| 회전 디스크 스캔 헤드 | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
참고문헌
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287, 1830-1834 (2000).
- Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system. Curr. Biol.
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