축삭 변성과 백질 신경 생물학의 연구를위한 다목적 쥐 모델 피질의 흰색 물질 스트로크

요약

여기에서는 비가역적 내피 산화질소 합성효소(eNOS) 억제제(L-Nio)의 국소 주입에 의해 쥐 백질에서 초점 스트로크를 생성하는 방법론을 제시합니다. 제시된 것은 두 가지 정위 변형, 역행 신경 세포 추적, 그리고 이 기술의 잠재적 응용을 확장하는 새로운 조직 라벨링 및 해부입니다.

초록

뇌졸중 임상 스트로크 프리젠 테이션의 최대 25 %를 백질 계정에 영향을주지는 5 ~ 10 배 더 클 수있다 속도에서 자동으로 발생하고 혈관성 치매의 발전에 크게 기여하고있다. 초점 백질 행정의 몇 가지 모델이 존재하고 적절한 모델이 부족 뇌졸중 이러한 유형의 후 부상 응답 및 수리에 관련된 neurobiologic 메커니즘의 이해를 방해하고있다. 다른 피질 뇌졸중 모델의 주요 제한은 국소 적 백질에 경색을 제한하지 않거나 주로 비 뮤린 종 검증되었다는 것이다. 이것은 백질 행정 신경 생물학을 연구 쥐 연구 도구의 다양한 적용 할 수있는 능력을 제한한다. 여기에서 우리는 돌이킬 수없는 eNOS의 억제제의 지방 주입을 사용하여 쥐의 흰색 문제에 초점 뇌졸중의 안정적인 생산을위한 방법론을 제시한다. 우리는 또한이 독특한 정위를 포함하는 일반적인 프로토콜에 몇 가지 변화를 제시변화, 크게이 기술의 응용 가능성을 확장 역행의 연결을 추적뿐만 아니라 신선한 조직 라벨 및 해부. 여러 방법이 뇌졸중이 일반적이고 파악 하였다 형태의 neurobiologic 효과를 분석하는 이러한 변화 할 수 있습니다.

서론

피질하 백질에 영향을 미치는 뇌졸중은 흔한 임상 실체로, 미국에서 매년 임상 뇌졸중의 최대 25%를 차지합니다 ¹. 백질에 대한 허혈성 손상은 또한 상당히 높은 비율로 조용히 발생하며 혈관성 치매의 발병에 기여합니다 ^2,3. 현재 이러한 형태의 뇌허혈을 앓고 있는 환자들은 치료법이 거의 없습니다. 이 질병의 임상적 중요성에도 불구하고, 임상적으로 타당한 동물 모델은 거의 존재하지 않는다 ^4,5.

이 프로토콜의 목표는 쥐 백질 내에서 국소 허혈성 병변을 생성하는 것입니다. 이 인간 질병의 쥐 모델을 통해 뇌졸중에 대한 축삭 손상 반응과 백질의 세포 요소, 즉 축삭돌기아교세포와 성상세포가 축삭돌기에 어떻게 반응하고 뇌졸중 후 복구되는지에 대한 구체적인 연구를 할 수 있습니다.

이전 보고서에서는 여기에 설명된 것과 유사한 엔도텔린-1(ET-1) ⁶을 사용하여 피질하 백질 뇌졸중 모델을 설명했습니다. 실험 프로토콜에 대한 몇 가지 주요 변경 사항이 이루어졌으므로 이 모델의 잠재적 용도가 확장되었습니다 ^7,8. 이 프로토콜은 마우스 뇌 백질 내에서 초점 스트로크를 생성하기 위한 신뢰할 수 있고 수정 가능한 전략을 제공합니다.

이 모델의 주요 장점은 화학적 내피 산화질소 합성효소(eNOS) 억제제 N(5)-(1)-이미노에틸-L-오르니틴 HCl(L-Nio) ⁹를 사용하는 것인데, 이는 엔도텔린-1을 사용하는 모델의 합병증이었던 백질의 세포 요소에 대한 알려진 파라크린 효과가 없습니다 ¹⁰. 또한, 마우스에서 백질의 정위 표적화는 다양한 형질전환 또는 녹아웃 균주를 사용할 수 있게 하여 뇌 백질에 대한 뇌졸중의 영향을 결정하는 데 사용할 수 있는 도구를 크게 확장합니다. 여기에서는 이 기술에 대한 두 가지 변형을 설명하고 뇌졸중 후 축삭 및 백질 손상 및 복구에 대한 이해를 향상시키는 데 사용할 수 있는 몇 가지 추가 변형을 보여줍니다.

프로토콜

이 프로토콜에서 동물의 사용은 캘리포니아 로스 앤젤레스의 동물 보호 및 사용위원회의 대학 승인 절차에 따라 수행되었다.

참고 : 대상 쥐 인구를 식별하여 시작합니다. 이전 연구에서 유일한 수컷 야생형 C57 / BL6 마우스는 다양하지만 유전자 또는 녹아웃 마우스는 또한 사용될 수 있으며, 사용되어왔다. 정위 좌표가 C57 / BL6 해부학을 기반으로합니다. 각 사용자가 처음에 흰색 문제에 스트로크의 현지화를 확인하는 것이 좋습니다.

1. 흰색 물질 스트로크 유도 - 내측 각도 접근

1. 선단 직경이 15 내지 25 ㎛의 ⁽¹¹⁾ 사이가되도록 0.5 mm 모세관을 이용하여 뽑아 유리 피펫을 제조함으로써 시작한다.
2. 멸균 0.9 % 생리 식염수에 27.4 ㎎ / ㎖ (130 μM)에서 - L-니오의 멸균 10 μL 나누어지는 ((1) -iminoethyl-L - 오르니 틴 염산 N (5))를 준비합니다.
3. 인출 된 유리 피펫을 사전 작성유리 피펫을 부착하여 L-니오 (2-5 μL)의 작은 부피를 진공 라인에 접속 튜빙. 벤치 위에 피펫 평면을 배치하고, L-니오 용액에 끌어 끝을 삽입합니다.
   1. 피펫의 0.5 mm 부의 최소 2 mm가 채워질 때까지 진공을 적용한다. 진공을 끄고 피펫을 철회. 단계 1.12까지 따로 보관 해 둡니다.
4. 유도 챔버에 마우스를 위치시키고 표준 32 % 이소 플루 란을 이용하여 마우스를 마취 유도 증발기를 통해 유동 (5 L / 분 5 L / 분으로 산소를 0.5 L / 분으로 흡입 N ₂₎ 1 분 또는 깊이 anesthesized까지. 정위 현미경이 장착 된 정위 장치에 마우스를 전송합니다. 기화기를 통해 흘러 32 % 이소 플루 란을 사용하여 유지 보수 마취를 제공하고 코 콘 (2 L / 분 5 L / 분의 산소와 0.5 L / min의 N ₂ 흡입). 발가락 핀치와 마취의 깊이를 확인합니다.
5. 36 °에 주입 팔을 조정합니다.
6. AffiXA 낮은 볼륨 압력 분사 시스템의 말단에 유리 피펫 홀더를 뽑아 정위 설정의 분사 아암에 부착.
7. 코트 두 눈을 통해 석유 젤리와 장소 인공 눈물 연고와 마취 된 동물의 수염. 머리 위에 5~10cm 개방과 동물의 머리 위에 멸균 드레이프를 배치하여 무균 수술 부위를 준비합니다. 두개골을 덮는 털을 면도하여 aspetic 수술 표면을 준비합니다. 교대 betadine 70 % 알코올 면봉으로 두피를 청소합니다.
8. 두개골 표면을 노출 멸균 미세 가위로 1.5 cm 중간 선 두피 절개를합니다. 멸균 면봉으로 두개골을 건조하고 1-3X 확대에 정위 현미경을 사용하여, 멸균 마이크로 포인트 도구를 사용하여 상부 골막 조직을 제거합니다.
9. 미세한 포인트 마커를 이용하여 기준점으로 브레 그마 표시.
10. 멸균 미세 STIP 외과 드릴 비트를 사용하여 2mm ellipitical 개두술을 드릴0; 브레 그마에서 후방 시작하여 전방 단지 중간 선 왼쪽으로 연장. 뼈 조각을 제거하고 대뇌 피질을 가시화 할 수 있도록 부드러운 조직 위에 놓인.
11. 간헐적으로 멸균 식염수 방울을 적용하여 수술 필드와 촉촉한 대뇌 피질의 표면을 유지합니다.
12. 정위 장치의 인젝터 팔에 뽑아 유리 피펫을 붙입니다. 브레 그마와 피펫의 선단을 맞추고 정위 좌표를 제로.
13. 첫 번째 전방 / 후방 (A / P)에 피펫을 발전 / 표 1에서 제공하는 좌표 (M / L) 측면을 내측.
14. 대뇌 피질의 표면에 피펫을 발전 지느러미 / 복부 (D / V) 측정을 제로.
15. 천천히 최초의 D / V 표 1에 좌표에 도달 할 때까지 뇌에 피펫을 전달합니다.
16. 뇌에 L-니오 100 NL 주입 환류 방지 5 분을 기다린 20 msec의 펄스를 20 psi에서 설정된 낮은 압력 볼륨 주입 시스템을 사용하여피펫 트랙입니다.
    1. 정위 현미경의 접안 렌즈와 3 배의 배율에서 교정 레티클을 사용합니다.
    2. 따라서, 좌표들의 각각의 세트에 대한 뽑아 유리 피펫으로부터 (100 NL에 대응하는 0.5 mm 직경 피펫 0.5 mm 길이) 0.100 mm ^(3)의 총 변위. 십자선을 사용하여 측정하고 각각의 사용 확대 및 규모에 따라 달라집니다 설정 때문에 표준화.
    3. 공기 유체 메 니스 커스가 시상을 갖도록 각 분사시 정확한 량 측정을 위해, 측으로부터 현미경으로 각진 피펫 접근. 메 니스 커스는 피펫의 내부 및 외부 벽 모두 같은 초점면에 표시됩니다.
17. 천천히 피펫을 철회하고 단계를 반복 1.13-1.16.3 표 1에서 제공하는 좌표의 두 번째와 세 번째 세트에서.
18. 최종 주입 후, 피펫을 제거하고 개두술 사이트를 채우기에 충분한 뼈 왁스를 배치합니다. 에이두피 상처의 가장자리 pproximate 및 피부 접착제로 결합한다.
19. 두피 절개와 연관된 로컬 통증을 방지하는 방지 멸균 30 G 바늘을 이용하여 상처 마진으로 0.5 %에 마르케 0.1㎖를 주입한다.
20. 5 일간 마시는 물에 주택 공급 수술 후 항생제 동물 (0.48 ㎎ / ㎖ 트리 메소 프림 - 설파, 0.5 ㎎ / ㎖ 레보플록사신)를 돌려줍니다.

2. 흰색 물질 스트로크 유도 - 후방 각도 접근

1. 전치부 배향 45 도로 설정 정위의​​ 분사 암을 조정 제외한 중간 각도 접근 프로토콜과 1.1-1.12 단계를 수행한다.
2. 첫 번째 A / P에 피펫을 사전 및 M / L 표 2에 제공 좌표.
3. 전체 나머지 단계 측면 각도 접근 프로토콜과 같은 1.14-1.20.

3. 역행의 연결 라벨

1. 10 멸균 준비0.9 % 생리 식염수에 54.8 ㎎ / ㎖에서 L-니오의 μL 나누어지는.
2. 0.9 % 생리 식염수에 20 % Fluororuby (20 % 바이오틴 덱스 트란 아민 또는 2 % Fluorogold)의 멸균 나누어지는을 준비합니다.
3. 27.4 ㎎ / ㎖ L-니오 10 % Fluororuby의 최종 농도 1 : 함께 1 희석.
4. 단계 1.3-1.23에 위와 같이 스트로크 프로토콜을 수행합니다.
5. 이전 ⁸ 설명한대로 관류 고정, 냉동 절편 및 현미경으로 조직 섹션에서 기본적으로 형광 추적을 시각화합니다.

면역 형광 4. 조직 처리

1. 3 시간에서 스트로크 후 14 일까지 적절한 사후 행정 간격으로, 이소 플루 란 과다 복용 또는 로컬 IACUC를 통해 마우스 절차를 승인 안락사.
2. 각도 가위를 사용하여 흉강을 열고 좌심실로 23 G 나비 바늘을 삽입합니다.
3. 관류 액에 대한 유출을 추적 할 수 있도록 미세 가위를 사용하여 우심방에있는 작은 상처를 놓습니다.
4. 로 transcardially RT에서 10 ㎖ / 분의 속도로 차가운 4 % 파라 포름 알데히드의 30 내지 40 ml로 이어 차가운 인산 완충 식염수 용액으로 관류 30-40.
5. 마우스를 목을 벨과 후방 두개골을 열 멸균 가위를 사용하여 두뇌를 제거하고 부드럽게 24 시간 동안 차가운 4 % PFA로 뇌를 주걱으로 위에있는 두개골을 제거 배치하고 48 시간 동안 PBS의 30 % 자당로 전송 .
6. 그라 이오 스탯을 사용하여 마흔 미크론 부동 섹션을 준비하고 이전에 ^6-8 바와 같이 항체 처리를 수행합니다. 이 연구에서, 아래의 항체를 사용하여 토끼 항 - 신경 미세 섬유 (200) (1 : 500 희석); 토끼 항 멘틴 (1 : 500); 염소 항 GFAP (1 : 500); 토끼 항 년 Iba-1 (1 : 1000).

단백질이나 RNA 분석 5. 조직 처리

1. 3 시간에서 스트로크 후 14 일까지 적절한 사후 행정 간격으로, 이소 플루 란 과다 복용을 통해 안락사 또는 로컬 IACUC는 절차를 승인했다.
2. 목을 베다마우스 뒤쪽 두개골을 열 멸균 가위를 사용하여 뇌를 제거하고 부드럽게 주걱으로 위에있는 두개골을 제거합니다.
3. 후각 망울과 시신경을 절단하는 뇌의 전면에 멸균 4mm 주걱을 삽입합니다. 조심스럽게 두 개관에서 뇌를 들어 올려 (1 배 행크의 균형 소금 솔루션, 25 mM의 HEPES-KOH, pH를 7.4, 35 mM의 포도당, 4 mM의 중탄산 나트륨, 0.01 ㎎ / ㎖ 시클로 헥시 미드) 얼음처럼 차가운 해부 버퍼에 배치합니다.
4. 뇌 블록과 멸균 새 면도날을 사용하여 차가운 해부 버퍼 스트로크와 장소를 포함 2-3mm 석판을 준비합니다.
5. 해부 현미경에서 주입 된 반구의 백질 기본 운동 피질을 식별합니다. 이상 졸중 간격으로 상기 영역은 시각적 초점 괴사 미엘린 창백 의해 식별 될 수있다.
   (이전 후 뇌졸중 간격, 10 %의 1 μL와 혼합 L-니오의 주입에 빠른 그린은 뇌졸중의 시각적 식별을 허용 할 수 있습니다 참고 : 도 4a).
6. 해부 현미경의지도와 신선한 메스를 사용에서 신중하게 빠른 그린 라벨 또는 조직 손실 중 하나에 의해 식별 스트로크를 포함하는 흰색 물질의 영역을 해부하다. 원하는대로 상부 피질 및 기본 줄무늬를 제거합니다.

결과

제시된 모델을 사용하여, 백질 기본 앞다리 감각 피질 확실 타겟팅 될 수있다. 일반적으로 인간의 열공 경색에서 알 수 있듯이이 화학적으로 유도 된 뇌졸중 모델은 초점 축삭과 수초 손실, astrocytosis 및 microgliosis (그림 1)을 생성한다. 세 주사를 이용하여 임상 적으로 유용한 모델 앞다리 모터 태스크 ^7에 이른 장애 및 뇌 조직 경험 작지만 상당한 부분 확립 면역 조직 화학, 면역 형광 및 생화학 기술이 양적 레벨에서 가능하고 신뢰할 수 있다는 허혈. 뇌졸중 유도 후 이른 시점 (HR)에서 축삭 분자 조직 변경 (도 2)을 검출 할 수있다. 칠일에서, 스트로크는 축삭 손실 (그림 1a)의 외접 영역의 성숙을 완료합니다. 우리의 손,이 방법은 초점 백질 병변 approxima을 생산tely 800 μm의 수평 직경과 뇌량의 전후방 축 방향...

토론

피질 행정 이전 모델 번호 ^12-14 래트 및 마우스에서 내부 ^-6,15- 캡슐에 엔도 텔린 -1의 국소 주입, 피질 및 선조체 백질 포함 설명되었다. 작은 초점 스트로크의 최근 모델은 콜레스테롤 microemboli의 경동맥 ^(16)에 주입 한 번의 침투 세동맥 ^(17)의 photothrombotic 폐쇄를 활용하고있다. 이러한 모델은 각각 장단점 ^5를 모두 갖는다. 현재 기술 모델은 축삭 이상 손실, 수초 저하, 초점 괴사 코어와 최소이며, ⁷ 세에 따라 상당히 빠른 회복을 보여 임상 적자를 포함하여 인간의 열공 경색을 모방 특성을 가지고 있습니다 병변을 생산하고 있습니다. 쥐의 흰색 물질을 표적으로하는 것은 기계적인 연구를 지원할 수있는 유전자 조작의 다양한 있습니다.

임계프로토콜의 단계에서는 정확한 정위 좌표를 이용 포함한다. 쥐의 흰색 물질의 크기가 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
L-N5-(1-이미노에틸)오르니틴, 디하이드로클로라이드	Calbiochem	400600-20MG
이소플루란	피닉스 제약, Inc.	NDC 57319-559-06
모세관	세계 정밀 기기	50-821-807
Picospritzer	Parker 계측	Picospritzer II
입체 설정	Kent Scientific	KSC51725
피펫 풀러	KOPF	모델 720
실체 현미경 SZ51	Olympus	88-124
파인 가위	파인 사이언티픽 툴	14084-08
포셉스	하버드 장치	PY2 72-8547
곡선 포위	하버드 장치	PY2 72-8598
무딘 해부 도구	파인 사이언티픽 툴	10066-15
드릴	드레멜	8220-1/28
드릴 비트	파인 과학 도구	19007-05
Vetbond	3M	1469SB
Marcaine	HOSPIRA	NDC 0409-1610-50
Trimethoprim-Sulfamethaxole	STI 약국	NDC 54879-007-16
Fluororuby	Fluorochrome Inc	30 mg
파라포름알데히드	Fisher	O4042-500
자당	Fisher	BP220-10
저온 유지 장치	Leica CM3050 S
유리 슬라이드	Fisher	12-544-7
Fast Green	Sigma	F7252-5G
해부 현미경	Nikon	SMZ1500
23G 나비 바늘	Fisher	14-840-35
10x Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14065056
1M HEPES-KOH, pH 7.4	Affymetrix	16924
D-Glucose	Sigma	G8270
중탄산 나트륨	시그마	S5761
시클로 헥사 미드	시그마	01810