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방법 논문

숙주 세포와 혐기성 세균의 상호 작용을 평가하기위한 모델 생물로 포피 진지 발리

25.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53408

⸱

2015년 12월 17일

 , 
1Philips Institute for Oral Health Research, Virginia Commonwealth University, 2Department of Microbiology and Immunology, Virginia Commonwealth University, 3Department of Biochemistry, Virginia Commonwealth University

이 논문에서

요약

이 기사에서는 두 가지 프로토콜을 제시합니다: 하나는 숙주 내에서 성공적으로 침입하여 생존할 수 있는 혐기성 박테리아를 측정하기 위한 것이고, 다른 하나는 숙주 세포와 상호 작용하는 혐기성 박테리아를 시각화하기 위한 것입니다. 이 연구는 모든 배양 가능한 혐기성 및 모든 진핵 세포 유형에 적용할 수 있습니다.

초록

혐기성 박테리아는 지금까지와 같은 창자, 입 및 질만큼 인간의 틈새에서 성균보다 많다. 또한, 혐기성 감염은 일반적이고 자주 원주민 출신이다. 인간의 세포에 침입하는 일부 혐기성 병원균의 능력은 그들에게 선천성 면역을 탈출뿐만 아니라 숙주 세포의 행동을 조절하는 적응 대책을 제공합니다. 그러나, 혐기성 세균이 문제를 일으킬 수 사건 조사 실험 도중 라이브임을 보장. 포피로 모나스 진지의, 그램 음성 혐기성는 진핵 비 식세포 다양한 침입 할 수있다. 이 문서에서는 성공적으로 문화와는 P.의 능력을 평가하는 방법에 대해 설명합니다 진지 발리는 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를)을 침공. 두 개의 프로토콜이 개발되었다 : 하나는 성공적 침입 숙주 내에서 생존 및 다른 숙주 세포와 상호 작용하는 박테리아를 시각화 할 수있는 박테리아를 측정하기 위해. 이러한 기술은 처남의 사용을 필요robic P. 공급 챔버 최적 성장 혐기성 환경 진지 발리.

제 1 프로토콜은 주로 박테리아 숙주 세포의 침윤을 연구하는 데 사용되는 항생제 보호 분석에 기초한다. 그러나, 항생제 보호 분석법은 제한된다; 항생제 치료 및 숙주 세포 용해 다음 배양 세포 내 박테리아 만이 측정된다. 살아있는 및 죽은 모두 숙주 세포와 상호 작용하는 모든 세균을 평가하기 위해, 우리는 호스트 병원체 상호 작용을 조사하기 위해 형광 현미경을 사용하는 프로토콜을 개발했다. 박테리아 형광, 2 '와 7'- 비스 - (2- 카르복시 에틸)에 표시되어 -5- (및 -6) -carboxyfluorescein 아세 톡시 메틸 에스터 (BCECF-AM) 및 혐기성 조건 하에서 진핵 세포를 감염시키기 위해 사용된다. 0.2 % 트리톤 X-100과 파라 포름 알데히드 및​​ 투과성으로 함께 고정 다음, 숙주 세포는 각각 세포 골격과 핵 라벨을 TRITC의 팔로이 딘 및 DAPI로 라벨링된다. 여러 IMA다른 초점 (Z-스택)에서 촬영 GES는 박테리아의 시간적 공간적 시각화를 얻을 수있다. 이 연구에서 사용되는 방법은 경작 혐기성 및 진핵 세포 유형에 적용될 수있다.

서론

혐기성 박테리아는 인체의 거의 모든 표면에 정착. 산소 농도가 낮은 장과 비뇨 생식기 책자의 식물에서 우세하지만, 그들은 또한 피부, 입, 코, 목의 1에 높은 수준으로 존재한다. 혐기성 박테리아는 내인성 감염의 흔한 원인이며, 자주 병에 걸린 사이트에서 격리됩니다. 그러나, 그들의 까다로운 성격, 혐기성 격리하고 문화 어려울 수 있습니다. 혐기성 박테리아를 포함하는 연구는 제한된 조건에서 수행해야합니다. 현대 혐기성 배양 기술은 연구자가 많은 혐기성 실험 균주 또는 임상 분리 2,3을 연구하는 데 필요한 혐기성 설정을 모방 할 수 있습니다.

병원성 혐기성 세균들이 거주하는 숙주 세포와 동적 관계 공진화를 개발했다. 대부분의 혐기성는 infecti에 도달하기 전에 호스트 면역 반응에 의해 살해에 민감하다OU에 수준. 그러나 일부 병원성 박테리아로부터 탈출 또는 숙주 면역 반응을 파괴하는기구를 개발했다. 그들은 이러한 면역 인식, 면역 매개 물질의 중화, 세포 매개 면역의 변경, 숙주 세포의 침윤, 4 신호 면역의 변경의 회피로 메커니즘을 통해이 목표를 달성. 포피 gingivalis에 모두 구강과에 연루 그람 음성 혐기성를 구외 질환, 호스트 5-7 병원성 변화를 일으킬 수있는 매우 적합 세균성 병원체의 일례이다.

생물막 플라크의 포켓은 대기 산소 (8)로부터 보호되는 혐기성 박테리아를 정박 할 수있는 치아와 치은 점막 조직 사이에 형성된 깊은 틈새에서 발생한. 이러한 치주 포켓은 피 등 다양한 혐기성 병원균에 대한 틈새 시장의 역할 진지 발리 (9). P. 진지 발리는 리모델링 할 수있는 키스톤 병원균이다치주 질환 (10)의 발생과 진행을 촉진 방법으로 구강 미생물 커뮤니티를 보내고. 이는 호스트 단백질의 광범위한 스펙트럼에 대해 활성 및 숙주 방어 11 회피 메커니즘을 제공 독성 인자의 대량 생산. 또한, 시험 관내 및 생체 내 12-14 15 상피, 내피, 섬유 아세포, 및 치주 인대 세포에 침입 할 수있다. 효과적으로 피를 숙주 세포에 침입하여 진지 발리는 호스트 면역을 탈출 할 수 있습니다. 숙주 세포의 효과적인 침략뿐만 아니라 박테리아가 숙주 방어를 탈출 할 수 있습니다뿐만 아니라 미래에 다시 감염에 대한 저수지 역할뿐​​만 아니라 숙주 세포를 변경합니다. 숙주 세포에 의해 부착 및 세균 내면화에 관여하는 분자 메커니즘의 연구가 필요하다. 여러 실험실에서 연구 P.의 국제화와 관련된 분자 이벤트를 이해에 초점을 맞추고 숙주 세포에 의해 진지 발리뿐만 아니라 억제하고 면역 반응을 납치하고 적대적인 호스트 방어 메커니즘을 생존하는 데 사용되는 메커니즘으로.

식별 및 숙주 세포에 침입 할 수있는 병원체의 특성을 분석 할 수있는 많은있다. 이 산소없이 부피 악기에 의존 연구를 수행하는 것은 곤란하다 때문에, 혐기성 병원균 관내 연구는 주로 많은 실험적 연구 문제를 제기. 이는 진핵 세포 성장에 산소를 필요로하며, 따라서 조직 배양 인큐베이터에서 별도로 준비되어야한다는 사실에 의해 복잡해진다. 그러한 장애물을 피할 수있는 한 가지 방법은 산소 분위기 하에서 조사를 수행하는 것,하지만 혐기성 박테리아의 성장이 불가능하게된다. 또 다른 방법은 감염 숙주 세포의 상호 작용을 연구하기 위해 열 살해 박테리아를 사용하는 것이다. 그러나 차이는 호스트 병원체 interacti의 관련성을 감소 열 명이 사망하고 실행 가능한 박테리아 사이에 존재16. 그것은 숙주 세포와의 상호 작용 변경되지 않은 표현으로 가능한 박테리아를 연구하는 중심; 피를 배양 따라서 방법 혐기성 환경에서 진지 발리가 제공됩니다. 또한, 간단한 두 비용 효율적인 프로토콜 P.의 능력을 평가하기위한 입증되고 진지 발리는 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를)에 의해 내면화한다. 제 1 프로토콜은 인기 항생제 보호 분석에 기초한다. 분석이 간단하지만, 혐기성 미생물을 이용한 고려 주어진다. 제 2 프로토콜은 상호 작용 시각화 형광 주사 현미경의 사용을 필요로하며, P. 내재화 진지 발리. 각 분석은 한계 및 혐기성 세균의 침입을 연구 연구자에게 개요를 제공하도록 설명되는 장점을 갖는다. 현재 원고는 피를 연구했지만 HUVECs를 진지 발리 및 이러한 프로토콜뿐만 아니라 다른 많은 혐기성 세균에 대해 사용될 수있다숙주 세포의 다른 유형에도.

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프로토콜

다음 프로토콜은 혐기성 종, 경찰에 의해 침략을 배양하고 연구하는 방법을 설명합니다 진지 발리; 그러나, 이들 프로토콜은 혐기성 병원균에 사용될 수있다. HUVECs를 사용하고 있지만,이 프로토콜은 면역 및 비 면역 다른 진핵 세포 모두에 사용될 수있다.

1. 혐기성 상공 회의소 사용 및 유지 보수

참고 : P. gingivalis에이 주변 공기에서 발생하는 산소의 정상 수준에 민감 혐기성이다. 제어 혐기성 환경은 P.의 재배에 매우 중요합니다 진지 발리.

  1. 여기서, 무산소 혼합 가스 (80 % N 2, 10 % H 2, 2~10 %의 CO) 비닐 혐기 챔버에서 (도 1a)로 지정 인공 분위기를 유지한다. 혐기성 챔버 실험실 환경에서 항목을 전송하기위한 에어 록 (그림 1B)를 사용합니다. 에어 록 수동 TW를 운영혼합 된 혐기성 가스를 도입하기 전에 N2 가스와 얼음 퍼지.
  2. 바람직 황화수소 무보수 제거 황화수소 제거 칼럼 (도 1C)를 사용한다. 촉매에 의해 생성 된 O H 2를 제거하고 오염의 확산을 촉진 에어로졸을 방지하기 위해 챔버 내에서 제습기를 놓습니다.
    주 : 황화수소 많은 혐기성 세균의 천연 대사 부산물 및 축적은 세균에 독성이고 가전 손상되고, 촉매의 수명을 감소시킬 수있다.
  3. 수소의 존재 (그림 1D)에서 산소를 제거하는 팔라듐 촉매를 통해 챔버의 분위기를 순환 팬 상자를 사용합니다.
    참고 : 순환 대기 (HEPA) 필터는 0.22 μm의 또는 더 큰 크기로 공기 중 오염 물질을 제거합니다.
  4. 혐기성의 내부에 위치하는 37 ° C 배양기에서 배양 혐기성 세균방. 혐기성 챔버 내부에서 작업 할 때 표준 무균 기술을 사용합니다.

figure-protocol-1
그림 1. 혐기성 비닐 챔버와 그 구성 요소. (A) 대기 중 산소로부터 완전히 밀봉 된 비닐 혐기성 챔버는 한 번에 (32 X 78 년) 두 개인 작업 공간을 제공합니다. 그것은 (다시 중간) 37 ℃로 설정 인큐베이터가 포함되어 있습니다. (B)는 에어 록 혐기성 챔버로 실험실 환경에서 상품의 전달을 위해 사용된다. 사진은 자동적으로 혐기성 환경을 조성하기 위해 필요한 진공 및 퍼지 절차를 수행하도록 프로그램 될 수있는 제어기를 통해 작동 자동 출입구이다. (C) 황화수소 제거 컬럼은 바람직 황화수소 무보수 고용량 제거를 제공한다. (D)는 두 촉매 팬 박스 아르수소의 존재 하에서, 산소를 제거하고, 팔라듐 촉매를 통해 챔버의 대기를 순환하기 위해 혐기 챔버에 걸쳐 두었다. 혐기성 챔버는 제조업체의 지침에 따라 설정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

혐기성 박테리아 2. 준비

참고 : P.을 진지 발리는 aerotolerant이고 호기성 조건에서 저장 될 수 있지만, 6 % (17, 18)보다 높은 수준의 산소의 존재하에 성장하지 않을 것이다. 혐기성 챔버의 P. 적절한 배양에 필요한 진지 발리와 다른 혐기성 종 (그림 1). 혐기성 실 사용에 대한 적절한 훈련과 교육은 microanaerobes 19을 사용하기 전에 필요합니다.

  1. 혐기성 CONDIT 모든 액체 매체와 판 평형적어도 12 시간 이전에 실험에 이온이 잔류 산소를 제거합니다.
  2. P. 이동 혐기성 챔버 -80 ° C의 냉동고에서 진지 발리는 해동을 할 수 있습니다.
  3. 킬 P. (TSA II 5 % 양 혈액) 트립 티카 간장 혈액 한천 플레이트에 진지 발리. 4~7일에 대한 혐기성 배양기에서 37 ℃에서 파라 필름과 가게에서 판을 바꿈.
  4. P. 접종 3 ㎖ 뇌 심장 주입에 진지 발리는 (BHI) 국물은 멸균 루프를 사용하여, 헤민와 메나 디온, 혐기성과 까다로운 미생물의 분리 및 문화에 대한 풍부한 비 선택적 액체 매체와 보충.
    주 : 장기 저장을 위해, -80 ° C의 냉동고에 글리세롤 또는 DMSO (10 내지 20 %의 최종 농도) 및 장소 BHI 준비 박테리아 문화를 섞는다.
  5. P.의 스타터 문화를 준비 1:10 희석을하고 박테리아가 중반 로그 단계까지 성장 할 수 있도록하여 진지 발리.

참고 : 혈중 알코올 농도의 광학 밀도를박테 리아 현탁액을 판정하고 피검 각 균주 박테리아 농도를 조정한다. 피하십시오 진지 발리 미드 로그 상 및 7 ~ 8 × 106 세포 / mL를 0.7 OD (660)의 대응에 현탁. 프로토콜에 설명 된 성장 조건은 위의 피에 대한 특정 진지 발리와는 다른 균주에 적응해야 할 수도 있습니다.

3. 내피 세포 배양

주 : 매입은 제조업체의 지시에 따라 5 % CO 2에서 37 ° C에서 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 포함하는 기본 배지에서 일차 배양 된 HUVECs 및 풀링.

  1. 15 ml의 VEGF 미디어 2.5 × 10 5 세포 / 플라스크에 T-75 플라스크에 씨앗 된 HUVEC.
    참고 : 4.0 % 트리 판 블루 (1) 희석 : 1을 통해 가능성을 확인합니다. 양안 광 현미경으로 볼 때 트리 판 블루를 유지합니다 손상된 세포막과 세포, 양막 건강한 세포는 흰색 나타납니다. COUN세포의 80 % 이상이 20 가능한 지 확인, 100 세포를 톤.
  2. 세포가 ~ 80 % 포화 상태에 도달 할 때까지 예열 신선한 VEGF 매체와 미디어를 2 일마다 교체합니다.
  3. 미리 예열 PBS로 한 번 세포를 씻으십시오. 2 ㎖의 트립신 중화 솔루션 다음 5 분 동안 2 ㎖의 트립신 EDTA (0.25 %)와 함께 배양하여 T75 플라스크에서 세포를 해방.
  4. 50 ML 원뿔 튜브 중단 된 HUVEC를 수집합니다. PBS로 T-75 플라스크에서 여분의 세포를 씻어 내고 50 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다.
  5. 10 분 동안 200 XG에 원심 분리기 세포.
  6. , 뜨는을 제거 10ml를 미리 예열 VEGF 미디어에서 세포 펠렛을 일시 중지합니다.
  7. 혈구 세포 또는 유사한 계산 장치를 이용하여 세포 농도를 결정.
  8. (50,000 / 웰) 된 커버와 6 웰 플레이트 (400,000 / 웰) 또는 12 웰 플레이트 중 하나에 추가 세포 현탁액의 양을 계산합니다. HUVECs를 다음날 실험을위한 준비가 될 것입니다.

4. 생존 분석 침략 / 상호 작용(도금)

참고 :이 분석을 수행 할 때, / 잘 400,000 세포에 접종 내피 세포의 두 6 웰 플레이트를 준비합니다. 하나의 판에 부착 된 박테리아 및 숙주 세포에 의해 내재화를 평가하기 위해 사용될 것이다. 다른 판은 세포 내 세균을 설명합니다. 두 샘플의 삼중 한 실험에서 수행하는 6- 웰 플레이트는 허용한다. 이 프로토콜의 개요는 생존 분석 흐름도 (그림 2)를 참조하시기 바랍니다.

  1. 그들이 중반 로그 성장 (OD 660 0.5-0.7)에 도달 할 때까지 (제 1 참조) 상기 한 바와 같이 혐기성 박테리아를 준비합니다.
  2. 원심 분리기 박테리아 10 분 동안 5,000 XG에.
    원심 분리기는 챔버 외부 혐기성 인 경우, 15 mL의 밀봉 된 튜브에서 세균 시료를 운반 산소 누출을 방지하기 위해 파라 필름으로 뚜껑을 감싸는 참고.
  3. 펠렛 P. 배치 gingivalis에 다시 실, 상층 액을 버린다. VEGF 나에 재현 탁 전에 다시 PBS로 펠렛 박테리아를 씻어디아. 모든 균주가 중반 로그 단계 (~ 7 × 10 8 세포 / ml)에 해당하는 0.7의 OD 660에서 테스트 할 수 있도록 현탁액을 준비합니다. 박테리아는 현재 감염에 대한 준비가되어 있습니다.
  4. 혐기성 챔버로 조직 문화 인큐베이터에서 된 HUVEC를 포함하는 전송 6 웰 플레이트. 용지를 제거하고 혐기성 PBS로 3 회 세척한다. 각 웰에 혐기성 VEGF 미디어 2 ㎖를 추가하고 감염에 대한 온도를 평형 20 분 동안 혐기성 배양기에서 37 ° C에서 접시를 놓습니다.
    참고 : 감염에 사용되는 것을 보장하기 위해 혈액 한천 플레이트에 플레이트 박테리아가 균일 감염에 오염되지 않습니다.
  5. 100 : 감염 다중의 박테리아 숙주 세포 (숙주 박테리아 MOI) 감염 1.
    주 : HUVEC 세포 수는 감염 전에 단일 웰에 트리 판 제외 테스트를 수행하여 결정된다. 박테리아 세포의 수는 (0.5 = 5 × 10 8 세포 / ㎖의 OD, 예) 광학 밀도를 통해 결정된다. 비acterial 농도는 HUVEC를 농도 (21)에 기초하여 적절한 방어로 조정된다.
  6. 혐기성 배양기에 감염된 HUVECs를 6 웰 플레이트를 놓고 세균이 30 분 동안 숙주 세포와 상호 작용 할 수 있습니다.
  7. 비에이치 아이에 사포닌 혐기성 챔버 내부와 0.2 μm의 필터를 통해 필터링 (/ V W 1.0 %)을 준비합니다.
  8. 모두 부착 내면화 박테리아의 생존.
    1. , 인큐베이터, 흡 매체에서 플레이트를 제거 혐기성 PBS로 3 회 세척하고 2 ㎖를 (단계 4.8에 기재된 바와 같이 제조) 1.0 %의 사포닌을 추가 여과. 숙주 세포 용해를 허용하도록 15 분 동안 배양한다.
    2. 세포 스크레이퍼 잘 각각의 바닥을 쳤어요. 각 웰의 세포 혼합물을 수집하고는 1 : 비에이치 아이 1 희석.
    3. 샘플의 일련 희석을 진행합니다. 박테리아 종과 농도에 따라, 연속 희석을 조정합니다. (1) 시작 : 100 또는 1 : 1,000 희석.
    4. 혈액 한천 플레이트에 원하는 희석 200 μl를 접시. 랩 T37 ° C에서 혐기성 배양기에서 파라 필름과 장소에서 그가 판.
    5. 37 ° C에서 배양 7 일 후, 플레이트를 제거하고 수동으로 식민지를 계산하는 라이트 박스를 이용하여 콜로니 형성 단위 (CFUs)를 계산합니다.
      참고 : CFUs이 열거되어있다. CFUs의 대량 들어, 화상이 촬영 될 수 있고, 컴퓨터 소프트웨어 CFUs의 열거를 용이하게하기 위해 사용될 수있다.
  9. 내면화 된 박테리아의 생존.
    1. 인큐베이터에서 접시를 제거합니다. 혐기성 PBS로 3 회 세척하고 보충 항생제 (겐타 마이신 300 μg의 / ㎖과 메트로니다졸 400 ㎍ / ml)로 2 ml의 VEGF 미디어를 추가 할 수 있습니다.
    2. 1 시간 동안 품어. 그들이 원하는 균주를 죽이는 100 % 효과가 있으므로 항생제를 테스트하고 그들이 숙주 세포 (22, 23)을 관통하지 않는 것이 있는지 확인해야합니다.
    3. 대기음 매체는 필터링 1.0 % 사포닌 2 ㎖를 추가합니다. 숙주 세포 용해를 허용하도록 15 분 동안 배양한다.
    4. 각 아의 바닥을 쳤어요세포 스크레이퍼와 L. 각 우물에서 세포 혼합물을 수집하고는 1 : 비에이치 아이 1 희석.
    5. 샘플 (: 100, 1 : 1,000 1)의 연속 희석을 준비합니다.
    6. 혈액 한천 플레이트에 원하는 희석 200 μl를 접시. 혐기성 배양기에서 파라 필름과 장소에 판을 바꿈.
    7. 37 °에서 배양 7 일 후 판을 제거하고 CFUs를 계산 C.

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그림 2. 진핵 세포와 혐기성 세균의 생존을 위해 사용되는 프로토콜의 도식 표현. 총 세균의 생존과 내면화 박테리아의 생존을위한 두 가지 분석을 동시에 수행 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

호스트 세륨에 박테리아의 5 내면화LLS (형광 현미경)

참고 : P.을 gingivalis에, 2 '로 7'- 비스 -로 표시되는 (2- 카복시 에틸) -5- (및 -6) -Carboxyfluorescein, 아세 에스터 (BCECF-AM). BCECF-AM은 비 형광 막 투과성 염료이다; 세포 내 에스 테라 제의 작용을 통해 형광 BCECF에의 변환은 세포 생존 능력을 표시 할 수 있습니다. 피를 진지 발리는 BCECF-AM 염료로 표지 한 후 진핵 세포를 감염하는 데 사용됩니다. 감염 후, 세포를 고정하고 DAPI와 TRITC-팔로이 딘으로 표시. 진핵 세포의 핵을 염색하는데 사용 DAPI 염색은 또한 대사되지 쪼개짐 BCECF-AM 수 비 생존 박테리아를 식별 할 대응책을 제공하는 박테리아 세포 핵을 레이블링한다. 호스트 세포 TRITC-팔로이 딘, 빨간색 굴지 염료로 강조 표시됩니다.

  1. 오토 클레이브 된 커버. 무균 / 웰 5 × 10 4 세포에서 내피 세포를 파종하기 전에 12 웰 플레이트로 된 커버를 추가합니다. (실험 전 준비 일)
    2. 상기 한 바와 같이 12 웰 플레이트에서 18mm (# 1.5 두께) 원형 된 커버에 준비 내피 세포 되세요.
  2. 제 1 절에 설명 된대로 중반 로그 단계로 성장 혐기성 세균 (= 0.5-0.7 OD 660)를 준비합니다.
  3. 워시 박테리아는 5,000 XG에 원심 분리 및 5-7 × 10 8 세포 / ml에서 PBS에 펠렛을 일시 중단하여 혐기성 PBS로 2 배.
  4. 2 μM의 BCECF-AM의 최종 농도 세균 현탁액 (5-7 X 108 세포 / ml) 2 ㎖에 0.2 mM의 BCECF-AM의 20 μL를 추가한다.
  5. 어둠 속에서 30 분 동안 37 ° C에서 품어.
  6. 혐기성 챔버로 조직 문화 인큐베이터에서 18mm (# 1.5 두께) 원형 된 커버에 시드 내피 세포와 전송 플레이트. PBS 및 혐기성 VEGF 매체과의 교류로 씻으십시오.
    참고 : HUVECs를 가벼운 현미경 건강 있는지 확인합니다. HUVEC를 80 %의 합류는, 형태는 제조 업체와 비교해야한다 ~해야한다.
  7. 원심 분리기 표시 박테리아10 분 동안 5,000 XG 잔류 BCECF-AM 염료를 제거합니다. 2 ml의 혐기성 VEGF 매체에서 일시 중단합니다.
  8. 1 (세균 : 호스트) (100)의 MOI에서 표지 된 박테리아 숙주 세포를 감염시킨다.
  9. 30 분 동안 37 ℃의 혐기성 챔버에서 배양한다.
  10. 및 PBS로 3 회 감염 세척 세포 후 10 분 동안 새로 제조 4.0 % 파라 포름 알데히드에 고정합니다.
    주 : 세포를 고정 후, 실험을 혐기 챔버 밖에서 실시 할 수있다.
  11. 워시는 PBS로 3 회 된 커버.
  12. 10 분 동안 0.2 % 트리톤 X-100 1 ㎖를 추가한다.
  13. 워시는 PBS로 3 회 된 커버.
  14. 45 분 동안 커버 슬립에 TRITC의 팔로이 딘 (50 μg의 / ㎖)의 50 μl를 추가합니다.
  15. 워시는 DAPI를 포함하는 소프트 세트 장착 매체와 슬라이드에 12 웰 플레이트와 장소에서 제거, 세 번 된 커버. 매니큐어 측면을 밀봉합니다.
    참고 : 슬라이드 어둠 속에서 몇 달 동안 저장 될 수있다. 사진 표백을 방지하기 위해 빛의 노출을 피하십시오.
  16. 보기 슬라이드공 초점 현미경을 사용.
    1. 여기서, (반전) AxioObserver 주위 구성된 34 채널 분광 시스템 (32 채널 어레이 검출기와 두 개의 측면 PMT 검출기, 플러스 전송 된 광 검출기) 전동 XY 스테이지 스탠드를 사용합니다. 파란색 다이오드 (405 ㎚), 멀티 라인 아르곤 (458, 488, 514 ㎚), 녹색 다이오드 (561 ㎚), 빨간색 헬륨 네온 (633 ㎚) 및 440 nm의 펄스 레이저 :이 시스템은 다섯 레이저를 보유하고 있습니다. (FRET-FLIM 용) 2 하이브리드 하나로 이루어질 탐지기 형광 수명 이미징 시스템을 착용.
    2. 3백40부터 3백80까지 nm 내지 5백40에서 5백60까지 nm의 각각 4백35부터 4백85까지 nm 내지 5백70에서 5백90까지 nm 인 발광 필터의 여기 파장을 가진 듀얼 - 밴드 필터를 사용하여 하나의 채널에 DAPI와 TRITC에서 형광을 검출한다. 4백40에서 5백까지 나노 미터의 여기 파장 및 5백10에서 5백90까지 nm 인 발광 필터와 필터를 사용 BCECF-AM에서 형광을 검출한다.
      참고 : 모든 균주에 수행해야 BCECF-AM에 대한 제어하는​​ 실행 가능한 박테리아의 적절한 라벨을 보장하기 위해 연구되고있다. 먼저 nonviab을 확인제작 박테리아는 DAPI 양성 및 BCECF 음성이다. 둘째, 살아있는 박테리아가 형광 BCECF에 BCECF-AM을 대사 할 수 있는지 확인합니다. 세균이나 BCECF-AM 염료의 변수 농도는 최적의 라벨 검사를해야 할 수도 있습니다.

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결과

위에서 설명한 프로토콜 (P) 사이에 호스트 병원체 상호 작용을 연구에 사용 된 진지 발리와 내피 세포. P. 진지 발리 W83 및 P. PG0228의 삭제를 수행 진지 발리 V3150이 연구에 사용 하였다. PG0228 궁극적 P.의 상호 작용에 영향을 미칠 수있는 RNA와 단백질의 레벨을 변경할 수 단백질을 인코딩하도록 예측되고 숙주 세포와 진지 발리. 경찰에 PG0228의 효과를 알아보고자 진지 발리의 숙주 세포와 상호 작용하는 능력 된 HUVEC와 상호 작용하는 부모 및 돌연변이 균주의 능력을 비교 하였다. 생존 프로토콜 (도 2) 본 연구에 적용 하였다. 두 균주 따라서 비슷한 성장 곡선 및 감염 이전에 발생 된 세포 수의 정상화와 더 큰 문제가 있었다 2 단계에 설명 된대로 따라서, 두 균주는 대수 단계로 성장시켰다. 배양 7 일 후, CFUs...

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토론

위의 모든 방법들은 진핵 세포와 혐기성 세균의 상호 작용을 평가하기위한 특정 분석법을 설계하는데 사용될 수있다. 그러나 성공적으로 실험을 수행 할 수있는 몇 가지 고려 사항이 있습니다. 먼저 실험에 사용되는 균주이다.

그것은 그들이 유사한 성장 단계에 있으며 침입 효율 (13)에 영향을 미칠 수있는 전술의 차이와 유사한 세포 농도를 달성한다는 생존 분석 모두 두 균주의 비교뿐만 아니라 현미경 분석에 의해 결정적이다. 성장 곡선은 두 균주 서로 다른 경우, 조정은 궁극적으로 일관된 농도 21 공유 유사한 성장 패턴을 달성하기 위해 만들어 져야한다. 또한, 박테리아 세포 응집을 피하기 위해 균일하게 분산되어야한다. 또한, 박테리아 세포를 효과적으로 제거하는 항생제를 선택하는 것이 중요하다. 항생제 선택은 숙주 세포에 악영향을 가지고 있다면다른 항생제 또는 용균 효소 (24, 25)을 사용할 수있다. 마지막으로, 변형 이질...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

미야자키 히로시 박사님, 스콧 헨더슨 박사님, 토드 키튼 박사님, 저스틴 허처슨 박사님, 캐서린 자우레구이 박사님, 콜린 R. 베리 선생님께 감사드립니다. 이 작업은 NIH NIDCR 보조금 R01DE016124, R01DE018039 및 J.P. Lewis에 대한 R01DE023304의 지원을 받았습니다.

현미경 검사는 VCU Department of Anatomy and Neurobiology Microscopy Facility에서 수행되었으며, NIH-NINDS Center 핵심 보조금(5P30NS047463)의 자금 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
비닐 혐기성 챔버-타입 B코이 실험실 제품모델 2000 인큐베이터 
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep BloodBBL221261
Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor PoolLifeLine TechnologyFC-0044
VascuLife VEGF Medium Complete KitLifeLine TechnologyLL-0003
TrypKitLifeLineLL-0013
SaponinRiedel-de Haen16109
겐타마이신 황산염 소금시그마-알드리치G-1264
메트로니다졸시그마-알드리치M-3761
BCECF-AMLifeTechnologiesB1150
TRITC 팔로이딘 Sigma-AldrichP1951
18mm 원형 커버슬립전자 현미경 과학72222-01
Vector LaboratoriesH-1200이 있는 VectaShield 장착 매체
DAPI

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