이 기사에서는 두 가지 프로토콜을 제시합니다: 하나는 숙주 내에서 성공적으로 침입하여 생존할 수 있는 혐기성 박테리아를 측정하기 위한 것이고, 다른 하나는 숙주 세포와 상호 작용하는 혐기성 박테리아를 시각화하기 위한 것입니다. 이 연구는 모든 배양 가능한 혐기성 및 모든 진핵 세포 유형에 적용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
혐기성 박테리아는 지금까지와 같은 창자, 입 및 질만큼 인간의 틈새에서 성균보다 많다. 또한, 혐기성 감염은 일반적이고 자주 원주민 출신이다. 인간의 세포에 침입하는 일부 혐기성 병원균의 능력은 그들에게 선천성 면역을 탈출뿐만 아니라 숙주 세포의 행동을 조절하는 적응 대책을 제공합니다. 그러나, 혐기성 세균이 문제를 일으킬 수 사건 조사 실험 도중 라이브임을 보장. 포피로 모나스 진지의, 그램 음성 혐기성는 진핵 비 식세포 다양한 침입 할 수있다. 이 문서에서는 성공적으로 문화와는 P.의 능력을 평가하는 방법에 대해 설명합니다 진지 발리는 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를)을 침공. 두 개의 프로토콜이 개발되었다 : 하나는 성공적 침입 숙주 내에서 생존 및 다른 숙주 세포와 상호 작용하는 박테리아를 시각화 할 수있는 박테리아를 측정하기 위해. 이러한 기술은 처남의 사용을 필요robic P. 공급 챔버 최적 성장 혐기성 환경 진지 발리.
제 1 프로토콜은 주로 박테리아 숙주 세포의 침윤을 연구하는 데 사용되는 항생제 보호 분석에 기초한다. 그러나, 항생제 보호 분석법은 제한된다; 항생제 치료 및 숙주 세포 용해 다음 배양 세포 내 박테리아 만이 측정된다. 살아있는 및 죽은 모두 숙주 세포와 상호 작용하는 모든 세균을 평가하기 위해, 우리는 호스트 병원체 상호 작용을 조사하기 위해 형광 현미경을 사용하는 프로토콜을 개발했다. 박테리아 형광, 2 '와 7'- 비스 - (2- 카르복시 에틸)에 표시되어 -5- (및 -6) -carboxyfluorescein 아세 톡시 메틸 에스터 (BCECF-AM) 및 혐기성 조건 하에서 진핵 세포를 감염시키기 위해 사용된다. 0.2 % 트리톤 X-100과 파라 포름 알데히드 및 투과성으로 함께 고정 다음, 숙주 세포는 각각 세포 골격과 핵 라벨을 TRITC의 팔로이 딘 및 DAPI로 라벨링된다. 여러 IMA다른 초점 (Z-스택)에서 촬영 GES는 박테리아의 시간적 공간적 시각화를 얻을 수있다. 이 연구에서 사용되는 방법은 경작 혐기성 및 진핵 세포 유형에 적용될 수있다.
서론
혐기성 박테리아는 인체의 거의 모든 표면에 정착. 산소 농도가 낮은 장과 비뇨 생식기 책자의 식물에서 우세하지만, 그들은 또한 피부, 입, 코, 목의 1에 높은 수준으로 존재한다. 혐기성 박테리아는 내인성 감염의 흔한 원인이며, 자주 병에 걸린 사이트에서 격리됩니다. 그러나, 그들의 까다로운 성격, 혐기성 격리하고 문화 어려울 수 있습니다. 혐기성 박테리아를 포함하는 연구는 제한된 조건에서 수행해야합니다. 현대 혐기성 배양 기술은 연구자가 많은 혐기성 실험 균주 또는 임상 분리 2,3을 연구하는 데 필요한 혐기성 설정을 모방 할 수 있습니다.
병원성 혐기성 세균들이 거주하는 숙주 세포와 동적 관계 공진화를 개발했다. 대부분의 혐기성는 infecti에 도달하기 전에 호스트 면역 반응에 의해 살해에 민감하다OU에 수준. 그러나 일부 병원성 박테리아로부터 탈출 또는 숙주 면역 반응을 파괴하는기구를 개발했다. 그들은 이러한 면역 인식, 면역 매개 물질의 중화, 세포 매개 면역의 변경, 숙주 세포의 침윤, 4 신호 면역의 변경의 회피로 메커니즘을 통해이 목표를 달성. 포피 gingivalis에 모두 구강과에 연루 그람 음성 혐기성를 구외 질환, 호스트 <....
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프로토콜
다음 프로토콜은 혐기성 종, 경찰에 의해 침략을 배양하고 연구하는 방법을 설명합니다 진지 발리; 그러나, 이들 프로토콜은 혐기성 병원균에 사용될 수있다. HUVECs를 사용하고 있지만,이 프로토콜은 면역 및 비 면역 다른 진핵 세포 모두에 사용될 수있다.
1. 혐기성 상공 회의소 사용 및 유지 보수
참고 : P. gingivalis에이 주변 공기에서 발생하는 산소의 정상 수준에 민감 혐기성이다. 제어 혐기성 환경은 P.의 재배에 매우 중요합니다 진지 발리.
- 여기서, 무산소 혼합 가스 (80 % N 2, 10 % H 2, 2~10 %의 CO) 비닐 혐기 챔버에서 (도 1a)로 지정 인공 분위기를 유지한다. 혐기성 챔버 실험실 환경에서 항목을 전송하기위한 에어 록 (그림 1B)를 사용합니다. 에어 록 수동 TW를 운영혼합 된 혐기성 가스를 도입하기 전에 N2 가스와 얼음 퍼지.
- 바람직 황화수소 무보수 제거 황화수소 제거 칼럼
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결과
위에서 설명한 프로토콜 (P) 사이에 호스트 병원체 상호 작용을 연구에 사용 된 진지 발리와 내피 세포. P. 진지 발리 W83 및 P. PG0228의 삭제를 수행 진지 발리 V3150이 연구에 사용 하였다. PG0228 궁극적 P.의 상호 작용에 영향을 미칠 수있는 RNA와 단백질의 레벨을 변경할 수 단백질을 인코딩하도록 예측되고 숙주 세포와 진지 발리. 경찰에 PG0228의 효과를 알아보고자 진지 발리의 숙주 세포와 상호 작용하는 능력 된 HUVEC와 상호 작용하는 부모 및 돌연변이 균주의 능력을 비교 하였다. 생존 프로토콜 (도 2) 본 연구에 적용 하였다. 두 균주 따라서 비슷한 성장 곡선 및 감염 이전에 발생 된 세포 수의 정상화와 더 큰 문제가 있었다 2 단계에 설명 된대로 따라서, 두 균주는 대수 단계로 성장시켰다. 배양 7 일 후, CFUs.......
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토론
위의 모든 방법들은 진핵 세포와 혐기성 세균의 상호 작용을 평가하기위한 특정 분석법을 설계하는데 사용될 수있다. 그러나 성공적으로 실험을 수행 할 수있는 몇 가지 고려 사항이 있습니다. 먼저 실험에 사용되는 균주이다.
그것은 그들이 유사한 성장 단계에 있으며 침입 효율 (13)에 영향을 미칠 수있는 전술의 차이와 유사한 세포 농도를 달성한다는 생존 분석 모두 두 균주의 비교뿐만 아니라 현미경 분석에 의해 결정적이다. 성장 곡선은 두 균주 서로 다른 경우, 조정은 궁극적으로 일관된 농도 21 공유 유사한 성장 패턴을 달성하기 위해 만들어 져야한다. 또한, 박테리아 세포 응집을 피하기 위해 균일하게 분산되어야한다. 또한, 박테리아 세포를 효과적으로 제거하는 항생제를 선택하는 것이 중요하다. 항생제 선택은 숙주 세포에 악영향을 가지고 있다면다른 항생제 또는 용균 효소 (24, 25)을 사용할 수있다. 마지막으로, 변형 이질.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
미야자키 히로시 박사님, 스콧 헨더슨 박사님, 토드 키튼 박사님, 저스틴 허처슨 박사님, 캐서린 자우레구이 박사님, 콜린 R. 베리 선생님께 감사드립니다. 이 작업은 NIH NIDCR 보조금 R01DE016124, R01DE018039 및 J.P. Lewis에 대한 R01DE023304의 지원을 받았습니다.
현미경 검사는 VCU Department of Anatomy and Neurobiology Microscopy Facility에서 수행되었으며, NIH-NINDS Center 핵심 보조금(5P30NS047463)의 자금 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 비닐 혐기성 챔버-타입 B | 코이 실험실 제품 | 모델 2000 인큐베이터 | |
| TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | BBL | 221261 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool | LifeLine Technology | FC-0044 | |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Technology | LL-0003 | |
| TrypKit | LifeLine | LL-0013 | |
| Saponin | Riedel-de Haen | 16109 | |
| 겐타마이신 황산염 소금 | 시그마-알드리치 | G-1264 | |
| 메트로니다졸 | 시그마-알드리치 | M-3761 | |
| BCECF-AM | LifeTechnologies | B1150 | |
| TRITC 팔로이딘 | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 18mm 원형 커버슬립 | 전자 현미경 과학 | 72222-01 | |
| Vector Laboratories | H-1200 | 이 있는 VectaShield 장착 매체 |
참고문헌
- Hentges, D. J. The Anaerobic Microflora of the Human Body. Clin. Infect. Dis. 16 (4), S175-S180 (1993).
- Willis, A. T. Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice. , (2014).
- Wren, M. W., Baldwin, A. W., Eldon, C. P., Sanderson, P. J.
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재인쇄 및 허가
