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Summary

이 논문은 유 중수 에멀젼에 기초 소수성 안료와 수용성 단백질을 조립하기위한 간단하고 높은 처리량 방법을 설명한다. 우리는 브라 E. 식물에서 발현 재조합 수용성 엽록소 4 변형 결합 단백질 (WSCPs) 네이티브 엽록소의 조립에있어서의 효과를 입증 대장균.

Abstract

엽록소 (Chls) 및 bacteriochlorophylls (BChls)는 광합성 빛 수확 및 전자 수송을 수행하는 기본 보조 인자이다. 이들의 기능은 매우 크고 정교한 multisubunit 막 횡단 단백질 복합체 내에서 특정 조직에 따라 달라집니다. 이러한 복합체는 태양 에너지 변환을 용이하게하는 방법을 분자 수준에서 이해하기 위하여, 단백질 – 안료, 안료와 안료의 상호 작용 및 동력학 여기에 그 효과를 이해하는 것이 필수적이다. 이러한 이해를 얻는 방법 중 하나는 건설 및 단순 수용성 재조합 단백질과 Chls의 단지를 공부하는 것입니다. 그러나, 수용성 단백질에 친 유성 및 Chls BChls를 통합하는 것은 어렵다. 또한, 소수성의 안료와 수용성 단백질의 조립에 사용될 수있는 일반적인 방법이 없다. 여기서는 엉덩이 있도록 유 중수 에멀젼에 기초한 간단한 고 스루풋 시스템을 보여소수성 Chls와 수용성 단백질의 embly. 새로운 방법은 엽록소 A의 십자화과 식물 (WSCP)의 수용성 엽록소 결합 단백질의 재조합 버전을 조립하여 검증 하였다. 우리는 엽록소의 성공적인 조립에게 E.을 표현 WSCP의 사용 조 해물을 보여 신규 수용성 ​​엽록소 결합 단백질 유전자 스크린 시스템을 개발하는데 사용되며, 엽록소 – 단백질 결합 및 조립 공정을 연구 할 수있다 대장균 세포.

Introduction

이러한 엽록소 (Chls), bacteriochlorophylls (BChls) 및 카로티노이드 등의 소수성 안료는 전자 수송 및 빛 에너지 캡처 및 전송을 수행 광합성 반응 센터와 빛 수확 단백질의 기본 보조 인자이다. 반응 센터와 엽록소 결합 광 수확 복합체의 대부분은 막 횡단 단백질이다. 비 산소를 광합성 녹색 유황 세균 ^{1, 2의} Fenna – 매튜스 – 올슨 (FMO) 단백질 및 와편 모 조류 ^(3)의 peridinin – 엽록소 단백질 (PCP)는 수용성 빛 수확 단백질의 뛰어난 예이다. 수용성 엽록소 결합 단백질 (WSCPs) 십자화과, 타테, 명아주과 및 비름 식물 ^{4, 5는} 다른 독특한 예이며, 아직 FMO와 PCP 달리,이 광 수확에서나 차 광합성 반응의 어느 것도 관여 및 그들의 정확한 PHYsiological 기능은 아직 ^5-8 불분명하다. 높은 엽록소 결합 친 화성이 과도 Chls의 사업자와 엽록소 유도체 ^9,10와 같은 제안 기능에지도했다. 또한, 그것은 WSCP이 손상된 세포에 Chls을 청소하는 역할을하고 엽록소에 의한 광산화 손상 ^7,11-13 방지 것을 가정했다. 더 최근에는 프로테아제 억제제로서 그 WSCP 기능을 제시하고 초식 저항 동안 역할뿐만 꽃 발달 동안 ¹⁴ 세포 사멸을 조절 하였다. WSCPs는 광 물리 특성에 따라 두 가지 종류로 구분된다. 첫 번째 클래스 (클래스 I, 예. 명아주에서)는 조명에 광을 거칠 수있다. 광 ^{5,10을받지} 않는 브라 시카 공장에서 클래스 II WSCPs는 더 클래스 인천 공항으로 세분화된다 (예., 브라 시카 올레 라 케아, Raphanus sativus에서) 및 IIB (예., 다닥 냉이의 virginicum에서 </em>). 다닥 냉이의 virginicum에서 클래스 IIB의 WSCP의 구조는 2.0 Å 해상도 ^8에서 X 선 결정학에 의해 해결되었다. 이것은 단백질 하위 단위는 소수성 코어를 형성하는 대칭 homotetramer을 보여준다. 각 서브 유닛은 모든 엽록소의 구성은 엽록소 – 단백질 복합체의 결합 및 조립을 공부 WSCPs에게 잠재적으로 유용한 모델 시스템을 만드는 간단한 core.This 내에서 네 밀접하게 포장 Chls의 꽉 배치 결과 하나의 엽록소 및 Chls 이웃의 효과를 결합 개별 Chls의 스펙트럼 및 전자 특성에 단백질 환경. 또한, 인공 광합성 소자에서 광 수확 모듈에 사용될 수있는 인공 엽록소 결합 성 단백질을 구성하는 템플릿을 제공 할 수있다.

식물로부터 정제 복합체는 항상 엽록소 (a)의 서로 다른 조합으로 사량의 이종 혼합물을 포함하기 때문에 기본 WSCPs의 엄격한 연구는 가능하지 않습니다와 엽록소 B ^(9). 따라서, 시험 관내 재조합 발현과 Chls WSCPs를 조립하는 방법이 요구된다. 이것은 ^(15)가 입증되었다 틸라코이드 막과 아포 단백질을 혼합하여. 불가능 단순히 수용액에 안료와 수용성 아포 단백질을 혼합하여 시험 관내 복잡한 조립하게 Chls의 무시할 수용성 의해 시험관 조립체 도전되지만 이 방법은 틸라코이드의 기본 Chls 존재로 제한됩니다. 슈미트는 등. 재조합 E.에 히스티딘 – 태그 단백질을 발현하여 콜리 플라워 (CaWSCP)에서 WSCP 여러 엽록소와 BChl 파생 상품을 조립보고 대장균은 니켈 친 화성 칼럼에 그것을 고정 및 세제 ^(11)에 용해 엽록소 유도체를 도입. 성공적으로 A.에서 재조합 WSCPs의 재구성 장대 ^6, 브뤼셀 콩나물 (BoWSCP), 일본어 야생 무 (RshWSCP)를비슷한 방법으로 D 버지니아 pepperweed (LvWSCP)도보고되었다.

여기, 우리는 소설 단백질을 태그가 필요하지 않습니다 WSCP와 Chls 조립 또는 고정 일반, 간단한 방법을 제시한다. 이 광유 수용성 아포 단백질들의 수용액에서 에멀젼의 제조에 의존한다. 단백질 따라서 부피 비율 ¹⁶ 유 중수 (W / O) 매우 높은 표면 미세 방울에 캡슐화됩니다. 소수성 공동 인자는 오일에 용해하고 용이 유상로부터 액적 내로 도입된다. 우리는 재조합 E. 표현 WSCP의 아포 단백질의 여러 변형의 조립 방법을 이용하여보고 엽록소 A의 대장균. 우리는 엽록소 신규 한 결합 단백질을 개발하기위한 스크리닝 시스템으로 사용될 수있다 WSCP 과발현 세균 조질 용 해물에서 어셈블리를 보여준다.

Protocol

1. 엽록소에게 주식 솔루션을 준비 중요한 단계는 : 광 손상을 최소화하기 위해, 녹색 광 (520 ㎚) 또는 어두운 하에서 화학적 후드 엽록소 제조의 모든 단계를 수행한다. 항상 저장을 위해 안료를 동결하기 전에 질소 나 아르곤을 추가합니다. 모든 용매 분석 학년 있는지 확인합니다. 틸라코이드 막 만 엽록소 a를 포함하는 동결 건조 스피루리나 platensis 세포 또는 다른 cyanobacterium 세포의 약 5 mg의 무게 박격포와 유 봉을 사용하여 분쇄. 유리 컬럼에 짓 눌린 세포를로드 및 카로티노이드를 제거하기 위해 약 50 ~ 100 ml의 100 % 아세톤으로 세척한다. 용출 된 오렌지 / 그린 부분을 폐기하십시오. 주 : 오렌지 분획을 아세톤 100 ㎖로 용출되지 않으면 녹색 분획이 용출되기 시작할 때까지 아세톤으로 세포를 세척 계속한다. 과거 100 % 메탄올, 아세톤 및 엽록소 함유 녹색 분획을 수집한다. 용출 fract의 부피이온은 50 ~ 100 ml의 사이에 다를 수 있습니다. 초기에 용출 된 분획을 용출 끝에 옅은 녹색으로 변화되는 짙은 녹색을 갖는다. 용출 된 부분의 색이 옅은 녹색으로 바뀌면 용출를 중지합니다. 추출물을 완전히 건조 될 때까지 회전 증발기를 사용하여 메탄올을 증발시켰다. 솔루션에 열을 가하지 마십시오; 증발기의 수조 온도가 30 ° C를 초과하지 않는 것을 보장한다. 참고 : 증발의 시간이 증발되는 메탄올 분획의 양에 따라 달라지며 10 ~ 60 분 사이에 다를 수 있습니다. 완전히 추출물을 건조하는 것이 중요하다. 디 에틸 에테르 (약 5 ~ 10 ㎖)의 작은 볼륨에서 건조 추출물에서 색소를 용해하고, 탈지면을 통해 필터링합니다. 안료가 완전히 필터링 전에 에테르에 용해되어 있는지 확인합니다. 안료가 (10-30 분)이 완전히 건조 될 때까지 디 에틸 에테르를 증발시켰다. 주 : 건조 안료는 치환 및 질소 또는 아르곤하에 유지 될 수 -20 ° C, 추가 처리 될 때까지 어둠한다. 하지 모두가 완전히 정지되는 경우에도 100 %의 메탄올 (약 1 ㎖)의 가능한 가장 작은 양의 건조 안료를 녹인다. 이 용액에 아세톤 4 mL를 넣고 완전히 안료를 용해하기 위해 부드럽게 유리를 쓸어. 파스퇴르 피펫을 사용하여, DEAE의 열이 100 % 아세톤에 평형 세 파로스에 부드럽게 샘플을로드합니다. 100 % 아세톤으로 용출 카로티노이드 (오렌지색 – 노란 밴드). 1 v / V를 아세톤 / 메탄올 혼합물 : 다음, 3 엽록소 A (녹색 밴드) 용출. 주 : 아세톤, 아세톤 / 메탄올 혼합물의 부피가 컬럼에 로딩 DEAE 세 파로스의 용적과 거의 동등하다. 용리액 (17)이 디클로로 메탄 / n- 헥산 / 이소프로판올 / 메탄올 (v / v)의 혼합물을 25 : 5 엽록소에게 68을 사용하여 박층 크로마토 그래피에 의해 순도를 확인한다. 엽록소 a가 완전히 건조 될 때까지 (a 회전 증발기를 사용하여 용매를 증발시켜 1060 분). 주 : 건조 엽록소는 질소 또는 아르곤으로 퍼징하고, 어둠 속에서 -20 ℃에서 아르곤 대기 하에서 저장 될 수있다. 100 % 에탄올 2-4 ml의 건조 엽록소 a를 다시 용해시켜 엽록소를 원액을 준비한다. 주 : 663 nm에서 엽록소 A의 흡광 계수는 74,400cm M -1 -1 (83.3 cm -1 (㎎ / ㎖) 1) 에탄올이다. 전형적인 스톡 용액을 25 mM의 (23 ㎎ / ㎖)의 농도에 대응하여 1860의 OD를 가져야한다. 엽록소의 10 배 몰 과량 대와 혼합 유기상을 5 ㎖ 및 수성 상 결과를 1ml WSCP 1 ㎎을 함유하는 에멀젼이 주식의 20 μL를 추가 WSCP. 2. 에멀젼의 유기 단계 준비 에멀젼의 유기상 (v / v)의 스팬 (80) 4.5 %를 함유하는 미네랄 오일로 구성되고, 0.4 % (v / v)의 트윈 80 참고. T의 50 ㎖ 튜브 0.2 g에 무게80 스판 80 1.8 g, 미네랄 오일 38 g을 싸우는. 물론 모든 구성 요소를 혼합하고 얼음에 냉각. 참고 유기상을 1 주일까지 4 ℃에서 저장 될 수있다. 3. 에멀젼의 수성 상을 준비 주 : 에멀젼의 수성 상 정제 WSCP 또는 WSCP 과발현 균의 조 추출물 중 구성 될 수있다. 정제 WSCP을 함유하는 수성 상을 준비. 0.3-0.6의 OD까지 37 ℃ LB 배지 1 L로 WSCP 플라스미드 12을 함유하는 대장균 BL21 박테리아 성장. 1 mM의 IPTG를 첨가하여 단​​백질 발현을 유도한다. 유도 후 12 ~ 16 시간 동안 30 ° C에서 박테리아를 성장. 4 ℃에서 10 분 동안 5,000 XG에 원심 분리하여 수확 박테리아. 얼음에 버퍼와 초음파 처리를 결합에서 펠렛 (30​​ 초, 15 초 오프 5 회)을 녹인다. 250㎖를 원심 분리로 얻어진 펠렛을 완충액 10 ㎖를 사용하여단백질을 과발현하는 세포 LB 배지. 주 : 정제 방법에 따라 상기 결합 완충액은 100 mM의 포스페이트 완충액, pH가 7.2, 50 mM 트리스, pH가 7.5, 500 mM의 염화나트륨, 5 mM의 EDTA로 구성 될 수있다. 39 ° C에서 30 분 동안 12,000 XG에서 세포 용 해물을 스핀. 친화도 크로마토 그래피에 의해 WSCP을 정화. WSCP 융합 태그에 따라 제조사의 지시에 따라 단백질 정제에 적합한 시판되는 친 화성 크로마토 그래피 시스템을 사용하여 재조합 단백질을 정제. 에멀젼 제제를 들어, 50 밀리미터의 정제 WSCP 인산염 완충액, pH가 7.8을 사용합니다. 재구성에 사용되는 최종 단백질 양이 버퍼 1 ㎖ 당 0.5 ~ 1.0 mg을 확인하십시오. WSCP 원유 박테리아 용 해물을 함유하는 수성 상을 준비. OD 0.3-0.6 될 때까지 37 ℃ LB 배지 250 ㎖ 중의 플라스미드 발현 WSCP를 포함한 대장균 BL21 세포를 성장한다. 과 단백질 발현을 유도1 mM의 IPTG는 30 ℃에서 밤새 박테리아를 성장. 원심 분리하여 수확 박테리아 세포를 4 ℃에서 10 분 동안 5,000 XG에. 4 ℃에서 30 분 동안 12,000 XG에 1-2 ml를 50 mM의 인산 나트륨 완충액 pH 7.8, 초음파 처리 (30 초, 15 초 오프, 3 회) 및 원심 분리기에서 펠렛을 녹인다. 50 mM의 인산 나트륨 완충액 pH 7.8 0.875 ml의 상등액 0.125 mL를 혼합하여 에멀젼의 수성 상을 준비한다. 에멀젼의 엽록소 a를 가진 WSCP 4. 조립 유리 바이알에 넣고 오일 – 계면 활성제 혼합물을 5 ㎖를 얼음에 냉각. 피펫 전에, 유기상의 모든 성분이 완전히 혼합되는 것을 확인한 후 계면 활성제 및 광유 사이에는 상 분리가 없다. 유기 상을 5 ml의 섹션 3에서와 같이 제조 얼음처럼 차가운 수상의 1 ML을 추가합니다. 얼음에 9,500 rpm에서 2 분간 조직 균질를 사용하여 두 단계를 섞는다. 중요한 단계 :에이 단계에서, 광 손상을 최소화하기 위해 녹색 빛 (520 ㎚)에서 모든 추가 단계를 수행합니다. 25 mM의 엽록소 주식 용액 20 μl를 추가 에멀젼에 (섹션 1.13 참조). 튕기 유리 바이알을 반전시킴으로써 분산. 엽록소가 균등하게 유화에 분산되어 있는지 확인합니다. 어둠 속에서 얼음에 1 ~ 2 시간 동안 에멀젼을 품어. 실온에서 5 분 동안 14,000 × g으로 1.5 ㎖의 플라스틱 튜브에서 원심 분리에 에멀젼을 전송 유기상으로부터 분리 에멀젼 물방울을 분해하기 위하여. 주 : 조립이 완료되면, 하부 수 성상은 녹색을 가져야한다. 상부 오 일상을 폐기하고 광유 1 ㎖를 추가한다. 소용돌이하거나 철저하게 튜브를 틀지하여 펠렛 에멀젼으로 잘 미네랄 오일을 섞는다. 실온에서 5 분 동안 14,000 XG에서 샘플을 스핀. 수성과 광부를 구분하는 명확한 메 니스 커스 때까지이 단계를 반복합니다중간 에멀젼없이 알 오일 상을 구한다. 화학 후드에서이 단계를 수행합니다. 수성 미네랄 오일 상 명확하게 분리 된 후, 미네랄 오일을 제거하고 물, 포화 디 에틸 에테르를 가하여 1. 볼텍스하고, 실온에서 5 분 동안 14,000 XG에서 샘플을 스핀 다운. 두 번이 단계를 반복합니다. 두 번째 원심 분리 한 후, 디 에틸 에테르를 제거하고 후드에서 5 ~ 20 분 동안 열린 튜브를 둡니다. 마지막으로, 탈염 칼럼 상 WSCP / 엽록소에게 복합체를 함유하는 수성 상을로드하고 상기 실험에 적합한 완충액으로 용출시킨다. 주 : 단백질의 pH (6.0-7.5)의 넓은 범위에서 인산염 트리스 완충액에서 안정하다. 샘플은 1 개월까지 빛으로부터 보호 4 ° C에 저장할 수 있습니다.

Representative Results

재조합 WSCP의 아포 단백질은 이전 섹션에 설명 된 프로토콜에 따라 W / O 에멀젼의 엽록소 a를 조립했다. 프로토콜은 순수한 WSCPs 또는 대장균 세포 용 해물 WSCP 과발현 (도 1)를 함유하는 수성 상을 이용하여 구현 하였다. 이 프로토콜은 빠르고, 간단하고 조직 균질 제외하고는 특별한 장비를 필요로하지 않습니다. <p class="jove_content" fo:keep-together….

Discussion

우리의 목표는 소수성 안료와 수용성 클로로필 결합 단백질의 조립을위한 새로운 일반 시스템을 개발 하였다. 여기가 W의 /의 O 에멀젼을 기반으로 새로운 재구성 시스템은 재조합 E. 표현 브뤼셀 콩나물, 콜리 플라워, 와사비와 버지니아 pepperweed에서 WSCP의 아포 단백질의 조립 작업을 입증 일반적인 방법입니다 것을 알 수있다 대장균. 다음 결과는 엽록소 (A)의 10 배 몰 과량 WSC…

Materials

Mineral oil	Sigma	M5904
Span80	Sigma	85548
Tween80	Sigma	P8074
Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges	Bio Rad	10011164	Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence.
His Trap HF column	GE Healthcare Life Science	17-5248-02	Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag
DEAE Sepharose Fast Flow	GE Healthcare Life Science	17-0709-01	Chromatography medium for chlorophyll purification