Method Article

실험 접근법은 미토콘드리아 현지화 및 핵 세포주기 키나제,는 Cdk1의 기능을 연구하는

DOI:

10.3791/53417

⸱

February 25th, 2016

 ,  ,  , 
1Radiation Oncology, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 (세포주기) 키나아제의 미토콘드리아 국소화를 연구하는 방법과 미토콘드리아 아래 위치 및 잠재적인 미토콘드리아 기질/표적을 결정하는 방법을 간략하게 설명합니다. 단백질을 미토콘드리아로 강제 발현하는 것은 관심 단백질의 미토콘드리아 국소화의 기능적 결과를 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

미토콘드리아는 자체 전사 기계를 가지고 있지만, 미토콘드리아 단백질의 1%만이 세포 기관 내에서 합성됩니다. 핵으로 인코딩된 단백질은 미토콘드리아 표적 염기서열(MTS)에 의해 유도되는 미토콘드리아로 운반됩니다. 그러나 대부분의 미토콘드리아 국소 단백질에는 식별 가능한 MTS가 없습니다. 그럼에도 불구하고 MTS가 단백질이 미토콘드리아로 들어가도록 지시할 수 있다는 사실은 일반적으로 핵 및/또는 세포질 단백질의 미토콘드리아 기능을 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 우리는 최근에 미토콘드리아에서 세포주기 키나아제 CyclinB1/Cdk1 복합체를 확인했습니다. 이 복합체의 미토콘드리아 기능을 구체적으로 연구하기 위해서는 핵 또는 세포질 기능을 방해하지 않으면서 이 복합체의 미토콘드리아 과발현과 녹다운이 필수적이었습니다. CyclinB1/Cdk1에 MTS를 태그함으로써 이 복합체의 미토콘드리아 과발현을 달성하여 미토콘드리아 표적과 기능을 연구할 수 있었습니다. 우성-음성 Cdk1에 MTS를 태깅함으로써 특히 미토콘드리아에서 Cdk1 활성을 억제했습니다. CyclinB1/Cdk1 복합체의 잠재적인 미토콘드리아 표적은 겔 기반 단백질체학 접근법을 사용하여 식별되었습니다. 기존의 2D 겔 분석과 달리, 당사는 2차원 차이 겔 전기영동(2D-DIGE) 기술을 사용한 후 인단백질 염색을 수행하여 미토콘드리아 Cdk1 발현 세포에서 차등 인산화 단백질을 형광 라벨링했습니다. 미토콘드리아를 함유한 우성 음성 Cdk1과 야생형에서 변형된 인단백질 반점의 식별은 Cdk1의 미토콘드리아 표적의 정체를 밝혔습니다. 마지막으로, 세포주기 진행에 대한 CyclinB1/Cdk1 미토콘드리아 국소화의 효과를 확인하기 위해 합성 티미딘 유사체 EdU(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)를 사용한 세포 증식 분석을 사용하여 세포가 세포주기를 거치고 DNA를 복제할 때 세포를 모니터링했습니다. 전체적으로 우리는 미토콘드리아 국소화 및 세포주기 키나아제의 활성을 연구하는 데 사용할 수 있는 다양한 접근 방식을 보여주었습니다. 이는 발전되었지만 따라하기 쉬운 방법으로 많은 세포 생물학 연구자에게 도움이 될 것입니다.

Introduction

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포유 동물에서 세포주기의 진행은 cyclins과 cyclin-dependent kinases (Cdks) 1에 의해 제어 높은 순서 이벤트에 따라 달라집니다. 그 세포질, 핵 및 centrosomal 지역화를 통해 CyclinB1 /는 Cdk1는 핵 봉투 고장 및 중심체 분리 2와 유사 분열에서 다양한 이벤트를 동기화 할 수 있습니다. CyclinB1 /는 Cdk1는 세포 사멸 (3)에 대해 유사 분열 세포를 보호하고 미토콘드리아 분열, 새로 형성된 딸 세포 4 미토콘드리아의 평등 한 분배를위한 중요한 단계를 촉진한다.

포유류 세포 증식에​​서 미토콘드리아 ATP 5 멀티 소단위 복합체로 구성되어 산화 적 인산화 (OXPHOS) 기계 (전자 전달계)를 통해 생성된다; 복잡한 I - 복잡한 V (CI-CV). 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드 (NADH) : 유비 퀴논 산화 환원 효소 복잡한 I (CI)는 다섯 단지 (5)의 이해 최대 규모 이상이다. 복잡한 C45 서브 유닛의 14 onsists는 촉매 코어를 형성한다. 일단 복합 한 팔이 매트릭스 내부의 막에 매립 -6,7- 다른 아암에 돌출하여 L 자형 구조를 가정 ....

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Protocol

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배양 된 세포에서 미토콘드리아의 1. 분리

  1. 세포 (IBC) 버퍼 단열 버퍼의 준비
    1. 준비 0.1 M 트리스 / MOPS (트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 / 3- (N의 -morpholino) 프로판 술폰산) : 총 증류수를 추가 MOPS 분말을 사용하여 7.4의 pH를 조정 한 증류수 800 ㎖에 트리스 12.1 g을 녹이고 4 오 ℃에서 1 L 및 저장소의 볼륨
    2. 0.1 M EGTA (에틸렌 글리콜 비스 (2- 아미노 에틸 에테르) 테트라 아세트산)를 준비 / 트리스 : 1 L의 총 부피의 증류수를 추가 트리스 분말을 사용하여 7.4의 pH를 조정 한 증류수 800 ㎖에 EGTA 38.1 g을 녹이고 4 오 ℃에서 저장
    3. 1 M 자당 준비 : 100 ml의 증류수에 자당의 34.23 g을 녹이고, C. O를 -20에서 20 ㎖ 분취, 저장을
    4. 버퍼 C 0.1 M 트리스 / MOPS 10 ㎖, 20 ㎖의 0.1 M EGTA / 트리스 1 ㎖를 첨가하여 100 ml의 IB 준비 : IB C 형 버퍼를 준비1 M 자당의. 100 ml의 총 부피의 증류수를 추가한....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CyclinB1과는 Cdk1의 하위 미토콘드리아 현지화

탄산나트륨 추출 단백질이 미토콘드리아의 내부 또는 외부 표면, 즉, 외막에 위치하는지 여부를 결정하는데 사용된다. 단백질이 미토콘드리아 안에 지역화 도시되면 서브 미토콘드리아 지역화 상기 판정 프로테아제 소화 결합 mitoplasting 통해 이루어질 수있다. CyclinB1 또는는 Cdk1의 서브 미토콘드리아 현지화를 지정하려면 mitoplasts 25 밀리미터에 200 밀리미터의 삼투압 자당의 농도를 감소와 저장성 버퍼의 미토콘드리아를 희석하여 분리 하였다. 내막은 자당의 25 mM의 (그림 1A)의 최종 농도가 될 때까지 그대로 유지하면서 외막은 자당 150 밀리미터에서 파열하기 시작합니다. mitoplasting와 조합 프로테아제 보호 t.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

다른 세포 내 소기관으로 향하는 단백질 마찬가지로 미토콘드리아 표적 단백질은 정교한 단백질 전좌 접지기 (21, 22)의 도움 소기관에 직접 일차 또는 이차 구조 내의 표적 신호를 갖는다. 이러한 COX8 같은 독점적으로 미토콘드리아 상주 단백질에서 얻은 시퀀스 (MTS)을 대상으로 미토콘드리아는 미토콘드리아 11,23,24에 특정 단백질을 대상으로하는 유전자 서열의 N 말단에 추가 할 수 있습니다. 여기에, CyclinB1과는 Cdk1 유전자 벡터를 포함 COX8의 MTS에 표현에 복제하고, 재조합 CyclinB1과는 Cdk1는 미토콘드리아로 현지화되었다. 이 방법의 장점은 전체 유전자의 발현을 변경하지 않고,이 경우 미토콘드리아에, 특정 서브 - 세포 구획에서 유전자 발현의 변형을 가능하게한다는 것이다. 이 전략으로, 미토콘드리아 특정 핵 키나제의 기능은는 Cdk1는 해제되었다termined. 마찬가지로 우성 네가티브는 Cdk1에 MTS를 추가하여, 아래는 Cdk1의 미토콘드리아 특정.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 NIH 보조금 CA133402, CA152313 및 에너지부 과학 사무소 DE-SC0001271의 지원을 받았습니다. NCI P30 CA0933730, NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 및 S10 RR 026825 보조금의 자금 지원과 유세포 분석 실험에 도움을 준 Bridget McLaughlin 및 Jonathan Van Dyke의 기술 지원을 받은 University of California Davis 유세포 분석 공유 자원 실험실에 감사드립니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
32P ATP 퍼킨엘머BLU002001MC 
항-마우스 2차 항체Invitrogen A-11003Alexa-546 결합
항토끼 2차 항체Invitrogen A11029Alexa-488 conjugated
ATPResearch Organics1166A시험관 내 키나아제 분석
Cdk1 항체세포 신호 기술9112
Cdk1 키나아제 완충액New England BiolabsP6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 이미징 키트Life TechnologiesC10337EdU 라벨링
을 사용한 세포주기 분석COX IV 항체세포 신호 전달 기술4844S미토콘드리아 면역 염색
Cyclin B1 항체Santa Cruz Biotechsc-752
CyclinB1 / Cdk1 효소 복합체New England BiolabsP6020S동결 / 해동 방지
CyDye DIGE 형광 라벨링 키트GE Healthcare Life Sciences25-8009-83
DIGE 젤 및 DIGE 버퍼 키트GE 헬스케어 생명 과학28-9480-26 AA
디메틸포름아미드 Sigma Aldrich319937DMF
DithiothreitolBio-Rad161-0611DTT
dNTP EMD Millipore71004부위 지시 돌연변이 유발
Dpn I 효소Stratagene200519-53부위 지시 돌연변이 유발
드라이 스트립 커버 유체GE Healthcare Life Sciences17-1335-01미네랄 오일로 사용
EDTAJ.T. Baker4040-03
EGTAAcros Organics409910250
Eppendorf Vacufuge ConcentratorFisher Scientific07-748-13진공 원심 분리기 농축기로 사용
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01Anti-fade mounting solution
Fortessa Flow CytometerBD Biosciences649908For cell cycle EdU 라벨링을 사용한 분석
Histone H1Calbiochem382150시험관 내 키나아제 분석,
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704아가로스 젤의 DNA 단편 정제,
Immobiline, DryStrip Gel,GE Healthcare, Life Sciences18-1016-61IEF(등전체 포커싱) 스트립,
Immobilized Glutathione, Thermo Scientific15160글루타티온-아가로스 비즈
요오도아세트아미드시그마 알드리치I1149IAA
IPGphor 3 이소전기 포커싱 유닛GE 헬스케어 라이프 사이언스11-0033-64IPGphor 스트립 홀더
이소프로필-b-D-thio-갈락토피라노사이드 RPI Corp156000-5.0IPTG
LeupeptinSigma AldrichL9783세포 용해 완충액
Lipofectamine 2000Life Technologies11668027Transfection 시약
LysineAldrichL5501CyDye 라벨링
LysozymeEMD Chemicals5960
Mitoctracker Red/GreenInvitrogen M7512/M7514미토콘드리아 형광 염료
MOPSEMD 화학물질6310
pEGFP-N1Clonetech6085-1GFP 발현 벡터
PfuStratagene600-255-52
pGEX-5X-1 GE Healthcare Life Sciences28-9545-53GST 발현 벡터
Phenylmethylsulfonyl fluorideShelton ScientificIB01090PMSF
Phosphate buffered salineLife Technologies14040PBS
Spectra/Por 4 투석 튜빙Spectrum Labs132700투석용 다공성 멤브레인 튜빙
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel StainLife TechnologiesP-333002D 겔의 인단백질 염색용
억제제 칵테일Calbiochem539134세포 용해 완충액
QuikChange 부위 지정 돌연변이 유발 키트Stratagene200519-5
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104MiniPrep Plasmid Isolation Kit
RO-3306Alexis Biochemicals270-463-M001Cdk1 억제제
RotenoneMP Biomedicals150154Complex I 억제제
탄산나트륨Fisher ScientificS93359
염화나트륨EMD 화학SX0420-5세포 용해 완충액용
오르토바나데이트나트륨 MP 생물의학159664세포 용해 완충액용
피로인산나트륨 decahydrateAlfa Aesar33385세포 용해 완충액
나트륨 β-글리세로인산Alfa AesarL03425세포 용해 완충액
SpectraMax M2e 분자 장치M2E마이크로플레이트 리더
SucroseFisher Scientific57-50-1
조직 분쇄기 유봉Kimble Chase885301-0007미토콘드리아 분리용
조직 분쇄기 튜브Kimble Chase885303-0007미토콘드리아 분리용
트리클로로아세트산 용액Sigma AldrichT0699TCA
TrisMP Biomedicals103133
Triton-x-100TeknovaT1105
TrypsinCalbiochem650211
Typhoon ImagerGE Healthcare Life Sciences28-9558-09레이저 젤 스캐너 2D-DIGE
유비퀴논시그마 AldrichC7956
: , , , , , 단백질분해효소 염

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
  2. Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C.

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Mitochondrial LocalizationCdk1 KinaseMitochondrial Overexpression2D DIGE AnalysisEdU Labeling AssayFlow CytometrySodium Carbonate ExtractionSubmitochondrial FractionationMitochondrial Targeting SequenceCell Proliferation Assay

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