예 생체 병아리 소뇌 조각의 문화가 공간적으로 Electroporation에 과립 세포 전구체의 표적

요약

소뇌 외부 과립 층은 개발 뇌에서 가장 큰 교통 증폭의 사이트입니다. 여기, 우리는 배아의 날 (14) 병아리 배아에서 생체 전기와 소뇌 조각의 문화를 사용하여 확산의 절정에이 계층에 유전자 변형을 대상으로하는 프로토콜을 제시한다.

초록

소뇌 외부 과립 층 (EGL)이 개발 뇌에서 가장 큰 교통 증폭의 사이트 및 신경 세포의 증식 및 분화 연구를위한 훌륭한 모델입니다. 또한, 자사의 증식 능력의 진화 적 수정은 소뇌 척추 동물의 뇌의 EVO-DEVO 연구를위한 훌륭한 모델을 만들고, 양막 류 (amniotes)에서 소뇌 크기의 극적인 확장을위한 책임이있다. EGL의 구성 세포, 소뇌 과립 전구 세포는 또한, 수 모세포종에 대한 가장 일반적인 소아 종​​양 신경 기원의 상당한 셀을 나타낸다. 교통 증폭 다음, 과립 전구체은 성숙한 포유류의 뇌에서 가장 큰 신경 인구를 대표하는 소뇌의 내부 세분화 된 계층에 반경 방향으로 이동한다. 병아리, EGL 증식의 피크는 임신의 두 번째 주 끝으로 발생합니다. 이 층에서 유전 적 변형을 타겟팅하기 위해서확산의 피크, 우리는 배아의 날 (14) 병아리 배아에서 소뇌 조각의 생체 전기를 통해 유전자 조작하는 방법을 개발했다. 이 방법은 생체 내 과립 신경 발달의 여러 중요한 양상을 되풀이되었습니다 소뇌 과립 세포 증식 및 분화에 대한 철저한 이해를 생성하기에 유용 할 것이며, 따라서 소뇌 개발, 질병의 진화.

서론

소뇌는 후뇌의 앞쪽 끝 부분에 앉아 성숙한 뇌의 감각 및 모터 처리의 통합에 대한 책임뿐만 아니라 더 높은인지 과정 ^(1)을 조절하는 것입니다. 포유류와 조류, 그것은 성인의 뇌에서 신경 세포의 절반 이상을 생산하고 개발하는 동안, 조상의 광범위한 대중 교통 증폭의 제품을 정교한 형태를 보유하고 무겁게 잎 모양입니다. 소뇌는 수세기 동안 신경 생물 학자과 분자 시대 연구의 대상이되어왔다 마찬가지로 상당한 관심을 받고있다. 이는 본질적으로 흥미로운 생물학뿐만 아니라이 많이와 같은 가장 일반적인 소아 두뇌 자폐증 스펙트럼 장애 ⁽²⁾ 가장 눈에 띄게 소뇌 암, 수 모세포종 ^3, 등의 발달 유전 질환을 포함하여 인간의 질병에 연루되어 있다는 사실뿐만 아니라 관련 종양. 중요한 것은 WH 내의 우수한 모델 시스템이며무형 문화 유산은 두뇌 발달 ^4시에 운명 할당 및 신경을 연구한다. 최근에는 또한, 척추 동물 계통 ^5-10 걸쳐 본 소뇌 형태의 다양성으로 인하여 큰, 뇌 발달의 비교 연구를위한 모델 시스템으로 구축되었다.

소뇌는 후뇌 ¹¹ rhombomere 1의 등 반에서 개발하고 발달 두 가지 기본 전구 인구, 마름모꼴 입술과 ....

프로토콜

참고 : 모든 실험은 킹스 칼리지 런던, 영국, 영국 홈 오피스 동물 보호 지침에 따라 수행되었다.

E14 소뇌 1. 해부

1. 배아의 날 (14)에 38 ° C에서 갈색 수정 된 암탉 '계란을 품어.
2. 사용 계란 가위 비켜에서 병아리 배아 목을 벨과 얼음 차가운 PBS (그림 1A)를 포함하는 페트리 접시에 머리를 제거합니다.
3. 표준 집게를 사용하여 눈과 위턱을 제거, 조직을 통해 각각의 눈 뒤에있는 모든 방법을 절개합니다. 모든 방법 아래턱 (그림 1B)를 제거 인두를 통해 두 번째 절개를합니다.
4. 표준 집게를 사용하여 (그림 1C을)를 벗겨하여 두개골의 표면에서 모든 피부를 제거하고 뇌를 공개, 정면 및 정수리 뼈를 제거합니다.
5. 복부 측면에서, 인두 연골 및 보조 중간 엽을 제거합니다.
6. 등의 측면에서,주의LY는 PIA, 별도의 전체 뇌 (그림 1D)를 손상하지 후뇌 돌보는에 간엽 지느러미를 제거합니다.
7. 모든 방법 중뇌와 후뇌와 소뇌 (그림 1E)를....

결과

이 섹션에서는 배아의 날 (14) 병아리에서 슬라이스 전기 및 소뇌의 문화를 사용하여 얻을 수있다 결과의 예를 보여줍니다. 소뇌의 박리는도 1에 도시되어 설정 일렉트로 포 레이션 챔버는도 2에 도시되어있다. 우리가 성공적으로 시험 관내에서 (도 3a)을 그 구조 및 셀룰러 모폴로지를 유지 배양 소뇌 슬라이스, electroporate 및하는 것이 가능하다는 것을 보여준다. 개인 folia을 대상으로 전기 쉽게 (그림 3B) 달성된다. 우리는 성공적으로, II) 소뇌 세포의 기능에 대한 가능한 게놈 영역을 테스트) EGL 세포로 다른 플라스미드의 수를 electroporate와 기자가 자신의 행동 (그림 3C를 관찰하기 위해 구축과 세포 레이블을)이 가능 내가 있음을 보여준다 (그림 3D

토론

여기에보고 된 프로토콜은 해부 electroporating 및 병아리 배아로부터 14 일째 소뇌의 슬라이스를 배양하기위한 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 개별 소뇌 로브의 고립 된 타겟팅을 포함하여 EGL의 작은 초점 지역에 전기의 대상으로 할 수 있습니다. 그것은 높은 해상도와 편의에 따라 유전자 분석 및 이미징을 가능하게하고, 저렴한 비용으로 설치류 ^43-47 년에 설립 된 기술에 비해. 이러한 분석으로 인해 변경이 EGL에 영향을 미칠 수 있음을 의미 확장 ​​개발 기간, 마우스의 EGL 특정 유전자 타겟팅 가능성의 소수와 마름모꼴 입술과 EGL 사이의 분자 메커니즘의 공통성에 생체 내에서하실 수 없습니다 그들은 마름모꼴 립 신경에 영향을 형성 EGL ⁴⁹ 폐지 이후 생물학 자주 분석 될 수 없다. 우리의 시스템은 이에 EGL의 유전 적 변형을 추가로 타겟팅면에서 중요한 진보를 나타낸다pecifically, 그리고 우리가 병아리를 넘어 다른 종에 적용 할 것으로 예상.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
McIlwain 조직 초퍼	Mickle Laboratory Engineering Ltd		300 &mu에서 절단; 최상의 결과를 얻으려면 m을 사용하십시오.
기초 매체 독수리 (Gibco)	생명 기술	41010-026
L-글루타민	시그마	G7513
페니실린/스트렙토마이신	시그마	P4333
0.4 μ m 배양 인서트	Millipore	PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator	Intracel	01-916-02	전기천공을 위해 3 x 10V, 10msec 펄스를 사용하십시오.