Method Article

Gata4, Mef2c 및 Tbx5의 최적 비율을 표현하는 폴리 시스 트론 구조를 사용하여 유도 된 심근의 향상 발전

DOI:

10.3791/53426

⸱

November 13th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, McAllister Heart Institute, University of North Carolina, Chapel Hill

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 폴리시스트로닉 구조에서 Gata4, Tbx5 및 Mef2c의 레트로바이러스 매개 전달을 사용하여 iCM을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 효율성과 품질이 향상된 비교적 균질한 재프로그래밍된 세포 집단을 생성하며 향후 iCM 재프로그래밍에 대한 연구에 유용합니다.

Abstract

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유도 된 심근 세포로 심장 섬유 아세포 (CFS)의 직접 변환 (ICMS)는 심장 질환의 치료를위한 대안 전략을 제공함으로써 재생 의학을위한 큰 잠재력을 보유하고있다. 이 변환은 Gata4 (G), Mef2c (M) 및 Tbx5 (T)로 정의 요인의 강제 식으로 이루어졌다. 전통적으로, ICMS는 이러한 개별 요소를 표현 바이러스의 칵테일에 의해 생성됩니다. 그러나, 효율을 재 프로그래밍하는 것은 상대적으로 낮고 시험관 대부분 G, M, 섬유 아세포가 곤란 리 프로그래밍 메커니즘을 연구 할 수있게, 충분히 재 프로그램되지 않은 T-형질. 우리는 최근 G, M의 화학 양론이, T 효율적 ICM의 프로그래밍에 대한 중요 것으로 나타났습니다. M하고 MGT 폴리 시스 트론 벡터 (이하 MGT라고 함) 상당히 증가 리 프로그래밍 효율을 이용함으로써 달성 G 및 T의 낮은 수준의 상대 수준이 높은 G, M, T 최적의 화학 양론과 시험 관내에서 향상된 품질 ICM. 여기서 우리는 심근 아세포에서 MGT 구성체 ICMS를 생성하기 위해 사용 된 방법의 상세한 설명을 제공한다. 심근 아세포, 프로그래밍 및 리 프로그래밍 프로세스 평가 용 바이러스의 생성은 분리 ICMS의 효율적이고 재생 가능한 생성을위한 플랫폼을 제공하기 위해 포함된다.

Introduction

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심혈관 질환은 전 세계적으로 주요 사망 원인으로 매년 1,730만 명이 사망합니다1. 심근경색(MI) 또는 진행성 심부전으로 인한 심근세포 소실은 이환율과 사망률의 주요 원인이다2. 제한된 재생 능력으로 인해 성인 포유류 심장은 일반적으로 부상3-6 후 펌프 기능 손상과 심부전으로 고통받습니다. 따라서 심장 질환 치료 및 질병 모델링을 위한 생체 내 및 체외 심근세포의 효율적인 (재생)생성은 해결해야 할 중요한 문제입니다.

만능 상태를 거치지 않고 한 분화된 표현형에서 다른 표현형으로 세포를 직접 재프로그래밍하는 직접 재프로그래밍의 최근 개발은 재생 의학을 위한 유망한 대안 접근 방식을 제공합니다. 포유류의 심장에는 심장 세포의 약 절반을 차지하는 풍부한 심장 섬유아세포(CF)가 포함되어 있으며,7-9번 손상 시 대량으로 증식합니다. 따라서 방대한 CF 풀은 기능적 CM으로 직접 재프로그래밍할 수 있는 경우 재생 치료를 위한 새로운 CM의 내인성 공급원 역할을 할 수 있습니다. microRNA 또는 소분자의 유무에 관계없이 Gata4 (G), Mef2c (M) 및 Tbx5 (T)와 같은 전사 인자의 조합은 섬유아세포를 iCM10-26으로 재프로그래밍할 수 있는 것으로 나타났습니다. 중요한 것은, 이러한 전환은 생체 내에서도 유도될 수 있으며, 그 결과 경색된 심장의 심장 기능이 개선되고 흉터 크기가 감소한다는 것입니다16,27-29. 이러한 연구는 직접적인 심장 재프로그래밍이 손상된 심장을 치료할 수 있는 잠재적인 방법이 될 수 있음을 시사합니다. 그러나 iCM 재프로그래밍의 낮은 효율성은 추가 기계론 연구의 주요 장애물이 되었습니다. 또한, 심장 재프로그래밍의 재현성은 이 기술의 또 다른 논란이 되는 문제이다11,30,31.

아주 최근에, 우리는 단일 mRNA에서 동일한 2A 염기서열로 가능한 모든 스플라이싱 순서로 G,M,T를 인코딩하는 완전한 polycistronic 구조체 세트를 생성했습니다. 이러한 polycistronic 구조체는 다양한 G, M 및 T 단백질 발현 수준을 산출하여 현저하게 다른 재프로그래밍 효율을 나타냈습니다25. 상대적으로 높은 Mef2c와 낮은 Gata4 및 Tbx5 발현을 보인 MGT라는 가장 효율적인 구조체는 재프로그래밍 효율성을 크게 향상시키고 CM 마커 발현, 강력한 칼슘 진동 및 자발적 박동을 가진 많은 양의 iCM을 생성했습니다25. 또한, MGT polycistronic construct를 사용함으로써 본 연구는 여러 벡터의 사용을 피하고 G,M,T의 균일한 발현 비율을 가진 세포를 생성함으로써 심장 재프로그래밍 연구를 위한 향상된 플랫폼을 제공했습니다. 실험적 재현성을 높이기 위해 여기에서는 섬유아세포를 분리하고, MGT 카세트를 운반하는 레트로바이러스를 생성하고, iCM을 생성하고, 재프로그래밍 효율성을 평가하는 방법을 자세히 설명합니다.

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Protocol

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여기에 설명 된 프로토콜은 신생아 마우스를 사용합니다. 동물 관리 및 실험은 노스 캐롤라이나 대학 부문 실험 동물 의학 (DLAM), 채플 힐에 의해 설립 된 지침에 따라 수행된다.

버퍼 및 미디어 1. 준비

  1. 섬유 아세포 (FB) 매체를 준비 : 100 ㎖ 태아 소 혈청 (FBS), 6 ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신 500 ml의에게 IMDM 미디어를 보충합니다.
  2. 100㎖의 M199 배지 및 50ml의 FBS와 400 mL의 DMEM 배지를 보충 : ICM 매체를 준비한다.
  3. B27 매체를 준비 : 10 ML의 B27 매체와 490 ml의 RPMI 1640 미디어를 보충합니다.
  4. 플랫-E 배양 배지를 준비 : 50 ㎖의 FBS, 5 ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신, 5 ml의 비 필수 아미노산과 500 ml의 DMEM 미디어를 보충합니다.
  5. 플랫-E 형질 전환 매체를 준비 : 50 ㎖의 FBS 및 5 ml의 비 필수 아미노산과 500 ml의 DMEM 미디어를 보충합니다.
  6. 홍보epare 젤라틴 24 웰 플레이트를 코팅 : 24 웰 플레이트의 잘 0.5 ml의 0.1 % 젤라틴 용액을 추가, 바로 사용하기 전에 최소 10 분, 흡인 37 ℃에서 배양한다.
  7. 라벨링 FACS 완충액을 제조 : 2 mM의 최종 농도에 도달하는 10 ㎖의 FBS와 2 ml의 EDTA (0.5 M)과 500㎖의 DPBS를 보완. 4 ° C에서 0.22 μm의 필터와 저장소를 통해 전달합니다.
  8. MACS 완충액을 선별을 제조 : 2 mM의 최종 농도에 도달하기 위해 2.5 g의 BSA 및 2 ㎖의 EDTA (0.5 M)과 500㎖의 DPBS를 보완. 4 ° C에서 0.22 μm의 필터와 저장소를 통해 전달합니다.
  9. 형질 전환을 위해 배 HBS 버퍼를 준비 : 280 mM의 염화나트륨 (8.1816 g)을, 10 밀리미터의 KCl (0.37275 G), 1.5 밀리미터 나 2 HPO 4 (0.10647 G), 12 mM의 포도당과 500 ml의에게 HEPES 버퍼 (50 mm)를 보완 (1.08096 g의 ). 7.05-7.12하여 pH를 조정하기 위해 약 650 μL 10 N의 NaOH를 추가합니다. 4 ° C에서 0.22 μm의 기공 필터와 저장소를 통해 필터링합니다.
  10. 형질 2.5 M CaCl2를 솔루션을 준비 : 18.376 g의 칼슘을 추가CL 2-50 ML의 DDH 2 O 4 ° C에서 0.22 μm의 기공 필터와 저장소를 통해 필터링합니다.
  11. ICC (면역 세포) 고정 버퍼를 준비 : 4 %의 최종 농도에 도달하기 위해 35 ML의 DPBS에 5 ml의 파라 포름 알데히드 (PFA, 32 %)를 첨가.
  12. ICC의 투과성으로 버퍼를 준비한다 : 0.1 %의 최종 농도에 도달하는 100 ㎖의 DPBS 0.1 mL의 트리톤 추가.
  13. ICC 블로킹 완충액을 제조 : 5 %의 최종 농도에 도달하는 100 ㎖의 DPBS에 5g 소 혈청 알부민 (BSA)을 추가한다.
  14. ICC 염색 버퍼를 준비 : 1 %의 최종 농도에 도달하는 100 ㎖의 DPBS로 1g의 BSA를 추가한다.

신생아 마우스 심장 섬유 아세포의 2 세대

  1. 절편 배양 방법에서 심장 섬유 아 세포를 생성
    1. 청소 신생아 αMHC-GFP 형질 전환 마우스 75 % 에탄올 (P2에 P1). 멸균 가위로 머리를 잘라. 그런 다음 다른 하나의 겨드랑이 아래에서 수평 절개를합니다. 멸균을 사용하여무딘 구부러진 집게는 심장을 해부하고 얼음처럼 차가운 PBS 버퍼를 포함하는 24 웰 플레이트 잘 하나에 배치합니다.
      1. 또한, 수평 절개 한 후 심장을 짠다.
    2. 형광 현미경으로 마음에 GFP 발현을 확인합니다. GFP 발현이 심장 특이 적 프로모터이다 αMHC 프로모터에 의해 구동되기 때문에 부정적인 마음이 어떤 형광 희미 동안, 형질 전환 마우스의 심장, 녹색 (15)에 있어야합니다.
    3. 60mm 센터 웰 배양 접시에 3 ~ 4 GFP 긍정적 인 마음을 가지고 멸균 가위와 집게로 작은 조각 크기가 1mm 미만 3로를 말하다.
    4. 2 ml의 FB 매체와 한 10cm 접시에 3-4 다진 마음을 놓습니다. 조직을 3 시간 동안 정착하자.
    5. 천천히 심장 조직을 포함하는 요리 8 ml의 예열 FB 미디어를 추가 할 수 있습니다. 사흘 동안 조직을 방해하지 마십시오.
    6. 3 일 미디어를 교체합니다.
    7. 7 일, aspir에문화 매체를 먹고 DPBS로 세포를 씻어. 각 접시에 3 ml의 0.05 % 트립신을 첨가하고 5 분 동안 37 ℃에서 다이제스트.
    8. 트립신을 해소하기 위해 5 ml의 FB 미디어를 추가합니다. 부드럽게 세포 스크레이퍼와 세포를 분리. 위로 더 기계적으로 조직을 떼어 놓다 아래로 미디어를 피펫.
    9. 세포를 수집하고 심장 조직 절편의 오염을 방지하기 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터링 한 후 5 분 동안 200 XG에서 회전하여 세포 펠렛.
    10. 세척 세포는 한 번 맥 버퍼 및 세포 분류에 대한 준비가되어 있습니다.
  2. 효소 분해 방법에서 심장 섬유 아 세포를 생성
    1. 수확 GFP 2.1.1와 같은 긍정적 인 마음입니다. 10 ml의 얼음처럼 차가운 DPBS와 10cm 접시에 모든 마음을 전송합니다.
    2. 혈액을 제거하고 얼음처럼 차가운 DPBS로 한번 씻어 살균 집게와 심실을 짜내.
    3. 다른 조직과 지방의 자유를 마음을 낸다.
    4. 여전히 느슨하게 연결되어 약 4 조각으로 각각의 심장을 잘라.
    5. 20 미만 마음, 8 ml의 따뜻한 0.05 % 트립신 - EDTA와 15 ML 원뿔 튜브에 마음을 전송하고, 15 분 동안 37 ℃에서 배양합니다.
      1. 20-30 마음이있는 경우, 10 ml의 따뜻한 0.05 % 트립신 EDTA로 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 마음을 전송하고, 15 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
    6. 트립신을 취소하고 HBSS 또는 (20 ~ 30 하트) 10 ml의 따뜻한 II 형 콜라겐 (0.5 ㎎ / ㎖) (20 미만 마음이) 5 mL를 추가 할 수 있습니다.
    7. 소용돌이가 4-6 주위에 속도 수준에서 1 분 vortexer를에 튜브 (액체가 뚜껑까지하지 않는 경우, 속도는 괜찮습니다).
    8. 3 ~ 5 분 동안 37 ℃로 물을 욕조에 튜브를 품어.
    9. 1 분 동안 튜브를 소용돌이.
    10. 조직 조각이 정착 될 때까지 중력에 의해 1 분 동안 퇴적물은 5 ml의 차가운 FB 매체를 포함하는 새로운 튜브에 액체를 수집합니다.
    11. 반복 2.2.6-2.2.10 3-5 번 단계를 반복합니다.
    12. 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터링하여 모든 모음을 결합단일 세포 현탁액을 확인합니다.
    13. 4 ℃에서 5 분 200 XG에 원심 분리기.
    14. 재현 탁 (10) ML의 맥 버퍼에있는 세포, 4 ℃에서 5 분 200 XG에 원심 분리기.
    15. 선택적 : 1 ml의 RBC 용해 완충액 (150 mM의 NH 4 CL, 10 mM의 KHCO 3, 0.1 mM의 EDTA)과 혈액 세포에 resuspend 세포가 많이 존재한다면, 10 ㎖의 MACS로 희석시키고, 1 분간 얼음 위에 유지 버퍼 및 5 분 200 XG에 원심 분리기. MACS 버퍼와 한 번 더 씻는다.
  3. 맥에 의해 Thy1.2 + 섬유 아 세포의 분리 (자기 활성화 된 셀 정렬)
    1. 트리 판 블루 염색을 통해 생존 세포 수를 결정합니다.
      1. 단계 2.2.14에 10 ml의 세포 현탁액 10 μL 세포를 꺼냅니다. 10 μL 0.4 % 트리 판 블루 용액을 섞는다.
      2. 혈구에 혼합물을 추가합니다. 이 3 ~ 5 분간 방치 한 후 현미경으로 즉시 검사 할 수 있습니다. 파란색과 생존 세포에 염색 된 죽은 세포는 흠이다.
        3. 혈구의 네 1mm 코너 사각형의 모든 가능한 세포를 계산합니다. 생존 세포 수를 결정 광장 × 2 (희석 배수) 당 평균 횟수가 4 × 10 10 (세포 현탁액의 전체 볼륨을) ×.
    2. 이하 1 × 10 7 세포의 경우, 90 μL 10 μL의 Thy1.2 마이크로 비드와 재현 탁 세포는 맥 버퍼를 냉각. 이상 1 × 10 7 세포가 비례하는 경우 더 많은 구슬을 추가합니다. 잘 혼합하고 30 분 동안 냉장고 (2-8)에 품어.
    3. 10 ml의 맥이 버퍼와 스핀 샘플 5 분 200 XG에 추가; 다시 10 ml의 맥 버퍼와 원심 분리기로 한 번 씻는다.
    4. MACS 버퍼에 2 ml의 부피를 가져와.
    5. 맥 구분 후드에서 설정합니다. 분리기에 LS 열을 삽입합니다. 맥 컬럼에 버퍼 3 ㎖ 그것을 평형에 적용됩니다.
    6. 평형 LS의 칼럼을 통해 세포 현탁액을 전달합니다.
    7. 마다 버퍼 2 ML의 맥 3 회 반복한다.
    8. T 오프 LS 열을 가라그 세퍼레이터는 MACS 새로운 50 ㎖ 튜브에 버퍼 2 ㎖로 3 회 용출.
    9. 5 분 동안 200 XG 스핀.
    10. 10 ㎖의 FB 배지에서 재현 탁 세포는 세포를 계산하고 적당한 농도로 플레이트에 시드. 이식편 배양 방법에서 생성 된 섬유 아세포를 들어, 시드 세포 밀도는 약 2-3 × 104 세포 / 웰로 24 웰 플레이트 일 수있다. 효소 분해 방법에서 발생하는 섬유 아세포를 들어, 세포 밀도는 약 4 ~ 5 × 10 4 세포 / 웰 24 웰 플레이트 될 수 있습니다.

ICM 재 프로그래밍을위한 레트로 바이러스의 3 세대

참고 : 무균 조건 하에서 BSL2 생물 안전 캐비닛에서 다음 단계를 수행합니다. 형질 감염된 세포, 피펫 팁 및 튜브의 적절한 폐기는 환경과 건강 위험의 위험을 방지하는 것이 좋습니다.

  1. 1 μg의 / ㎖의 퓨로 마이신과 10 μg의 / ㎖의 B 보충 플랫-E 미디어에서 플랫 - E 세포를 유지5 % CO 2, 37 ℃에서 lasticidin.
  2. 하루에 2 일, 퓨로 마이신과 블라스트가없는 플랫-E 배양 배지로 매체를 교체합니다.
  3. 0 일에서 10cm 요리 약 형질 전날 플레이트 당 4 ~ 5 × 10 6 세포로 플랫 - E 세포를 분리. 세포는 ~ 형질의 날에 80~90% 합류해야한다.
  4. 1 일에, 이전에 형질 전환에 1 시간 내에서 세포에 형질 미디어로 변경 문화 미디어. 다음과 같은 형질의 절차는 다음과 같습니다
    1. 상업 키트를 사용하여 형질
      1. 20 ㎕를 형질 감염 시약 (리포 펙 타민 등) 500 μL를 혼합 감소 된 혈청 배지 (예를 들어,의 Opti-MEM). 혈청 미디어 감소 다른 500 μL에 레트로 바이러스 플라스미드의 10 μg의 추가. 5 분 동안 실온 (RT)에서 각각의 혼합물을 배양한다.
      2. 천천히 형질 전환 혼합물에 플라스미드 혼합물을 추가합니다. 이 단계는 15 ~ 30 초 정도 걸릴 수 있습니다. (솔루션은 흐린 나타날 수 있습니다) 실온에서 20 분 동안 혼합물을 품어.
      3. 세포 현명한 혼합물 드롭을 추가합니다.
      4. 37 ° C 배양기에서 하룻밤 품어.
    2. 인산 칼슘을 사용하여 형질 감염.
      1. 40 ㎕의 2.5 M CaCl2를 440 μL가 DDH 2 O 후 레트로 바이러스 플라스미드의 20 μg의 (총 부피 500 μL가되도록 DDH 2 O의 양을 조절)를 추가 혼합한다.
      2. 15 ML 원뿔 튜브에 HBS 배 500 μl를 추가합니다.
      3. HBS 와동과 한편 HBS에 칼슘-DNA 혼합물을 적가 추가 할 수 있습니다. 이 단계는 각 샘플에 대해 30 초 주위에 걸립니다. 그래서 최대한 동시에 3-4 샘플을한다.
      4. 더 이상 시간이 침전물을 차지하게됩니다 큰 침전물 적은 세포로 연결을위한 3 분의 보육 RT에서 품어.
      5. 혼합물이 세포에 적가하고 20 배 현미경으로 관찰 추가합니다. 미세 침전물 (작은 것들의 많은 좋은하지만 몇 가지 큰 사람이 잘되지 않습니다) 볼 수 있어야합니다.
      6. 37 ° C 배양기에서 밤새 품어.
  5. 하루에 2 일, 문화 미디어 데워진 8 mL를 세포에 미디어를 변경합니다. 24 시간 동안 품어.
  6. 3 일 및 4 일째, 0.45 ㎛의 공극 크기의 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통해 여과, 10 mL의 멸균 일회용 주사기를 사용하고 50 ㎖ 튜브에 전사함으로써 접시에서 배양 상등액을 모은다. 매 8 mL의 바이러스 함유 뜨는에 레트로 바이러스 침전 용액 2 ㎖를 추가합니다. 부드럽게 섞어 4 ℃에서 밤새 품어.
  7. 5 일에, 30 분 동안 4 ℃에서 1,500 × g에서 바이러스 액을 스핀. 바이러스 입자는 튜브의 바닥에 흰색 펠렛에 나타납니다.
  8. 상층 액을 버린다. 5 분 동안 1,500 × g에서 원심 분리하여, 잔류 용액을 스핀 다운. 펠렛에 침전 된 레트로 바이러스 입자를 방해하지 큰 관심을 가지고, 흡인에 의해 유체의 모든 흔적을 제거합니다.
  9. 매 8 mL의 바이러스 상층 액 100 μL의 DPBS 버퍼와 레트로 바이러스 펠렛을 재현 탁. 나누어지는얼음에 바이러스. 즉시 사용 또는 -80 ° C에서 저장합니다.

심장 섬유 아세포 4. 재 프로그래밍

  1. 10 ml의 ICM 매체에 10 ㎎ / ㎖ 폴리 브렌 솔루션의 4 μL를 추가로 pipetting 아래로 부드럽게 섞는다. 폴리 브렌의 최종 농도는 4 μg의 / ㎖이다.
  2. 섬유 아 세포와 시드 24 웰 플레이트의 각 웰에 500 μL ICM 미디어 포함 폴리 브렌를 추가합니다.
  3. 이식편 문화 또는 효소 절단 방법에서 4-5 × 10 4 세포에서 각 웰 포함 중 2 ~ 3 × 104 세포에 10 μL의 레트로 바이러스를 추가합니다. 바이러스의 양에 비례 다른 배양 플레이트 또는 접시에서 세포 수 증가와 함께 증가한다. 바이러스 감염을 허용하는 24 ~ 48 시간 동안 37 ° C를 배양기에서 접시를 넣습니다. 심장 리 프로그래밍에 대한 타임 라인은도 1에 도시된다.
  4. 바이러스 성 전달 후, 500 μL 일반 ICM 매체와 바이러스를 포함하는 미디어를 교체합니다.
  5. 2-3 일마다 미디어를 변경합니다. 바이러스 성 형질 도입 세포의 긍정적 인 선택을위한 세포를 대상으로 2 μg의 / ㎖에서 퓨로 마이신 보충 ICM 미디어를 추가 할 수 있습니다. 사흘 동안을 유지합니다. 그 후, 1 μg의 / ㎖의 농도로 배지에서 ICM 퓨로 마이신을 유지한다.
  6. 사흘 바이러스 감염 후, 인큐베이터에서 밖으로 판을 가지고 GFP 발현을 관찰하기 위해 거꾸로 형광 현미경 (20X) 아래에 배치합니다.
    주 : 열흘 바이러스 감염 후에, 세포를 FACS 분석 및 리 프로그래밍의 효율을 결정하는 ICC 분석을 위해 채취 될 수있다 (단계 5 및 6).
  7. 열네 일 바이러스 감염 후, B27 미디어와 ICM 미디어를 교체합니다. 3 일 미디어를 변경합니다. 자발적인 박동 세포 궤적 세 (효소 분해 방법과 세포) 또는 바이러스 성 전달 후 네 (절편 배양 방법과 세포) 주에서 나타날 수 있습니다.

재 프로그래밍 효율 5. 면역 세포 화학 분석

  1. 린스 세포세 번 PBS 차가운 얼음; 여분의 용액을 제거.
  2. 24 웰 플레이트의 각 웰에 0.5 ml의 ICC 고정 버퍼를 추가합니다. 15 ~ 20 분 동안 실온에서 세포를 수정.
  3. PBS로 3 회 세포를 씻어.
  4. 24 웰 플레이트의 각 웰에 0.5 ml의 ICC의 투과성으로 버퍼를 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 세포를 Permeabilize 하시려면.
  5. PBS로 3 회 세포를 씻어.
  6. 24 웰 플레이트의 각 웰에 버퍼를 차단 0.5 ml의 ICC 추가, 1 시간 동안 실온에서 품어.
  7. ICC 염색 버퍼로 희석 일차 항체. 잘 200 μL 각 항체 솔루션을 추가하고 밤새 4 ° C를 품어. 항체 희석 요인은 재료에 나열되어 있습니다.
  8. 다음날, PBS로 3 회 세포를 씻으십시오.
  9. 세포에 200 μL 차 항체 솔루션을 추가하고 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
  10. 3 회 PBS로 세포를 씻으십시오.
  11. 솔루션 각 웰에 DAPI를 포함하는 설치 150 μl를 추가합니다. 1 분 동안 핵을 염색 할 수 있습니다. 그때둥근 유리 커버 슬립과 잘 각각을 커버하고 부드럽게 공기 방울을 제거하기 위해 집게로 바닥면에 미끄럼을 누릅니다.
  12. 과잉 솔루션을 기음과 샘플 이미징을위한 준비가되어 있습니다. D14에서 표현 재 프로그램 세포 심장 마커 cTnT를하고 αActinin을 보여주는 대표 이미지는 그림 2B에 표시됩니다.

재 프로그래밍 효율의 6 FACS 분석

  1. 철저히 DPBS 한 번 세포를 씻으십시오. 각 웰에 0.3 ml의 트립신 (0.05 %)를 첨가하고, 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
  2. 부드럽게 세포를 해제 용이하게하기 위해 판을 누릅니다. 현미경으로 세포의 분리를 확인합니다. 대부분의 세포가 분해 될 때 각 웰에 1 ml의 외과 버퍼를 추가합니다. 피펫까지 추가로 기계적으로 세포를 떼어 놓다에 이르기까지.
  3. 잘 잘 96 웰 깊은 우물 판에 24 웰 플레이트에 세포를 전송합니다. 4 ℃에서 5 분 200 XG에 스핀 세포를 수집합니다.
  4. 한 번 씻을 세포FACS 버퍼입니다.
  5. 4 ℃에서 20 분 동안 세포를 재현 탁 100 μL 고정 / 투과성으로 솔루션을 추가합니다.
  6. 1X 세척 솔루션, 펠렛로 두 번 세포를 씻으하고, 상층 액을 제거합니다.
  7. 1X 세척 버퍼에 GFP 및 cTnT에 대한 일차 항체 솔루션을 준비합니다. 철저히 50 μL 항체 솔루션으로 각 샘플을 재현 탁하고 30 분 동안 4 ° C에서 품어.
  8. 1X 세척 솔루션, 펠렛에 한 번 세포를 씻으하고, 상층 액을 제거합니다.
  9. 각 샘플에 알렉사 플 루어 488 복합 당나귀 항 - 토끼 IgG의 알렉사 플 루어 647 복합 당나귀 안티 - 마우스 IgG를 포함하는 50 μL 차 항체 솔루션을 추가합니다. 어둠 속에서 30 분 동안 4 ° C에서 품어.
  10. 1X 세척 솔루션, 펠렛에 한 번 세포를 씻으하고, 상층 액을 제거합니다.
  11. 400 μL 고정 버퍼 (1 % PFA와 DPBS)에 재현 탁 세포. 셀 스트레이너 캡 외과 튜브에 세포를 전송합니다. 샘플 외과 검출을위한 준비가되어 있습니다. 재 프로그래밍 efficienc의 대표 FACS 분석Y는 pMxs - 퓨로 마이신-MGT는도 2a에 도시 또는 퓨로 마이신 선택하지 않고 구성 사용.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

프로그래밍 단계는. 그림 1에 개략적으로 요약된다 MGT 전달 후, 세포를 재 프로그램에서 GFP 발현은 초기 형질 세포의 3 퓨로 마이신 선택이 3 일에서 시작하고 2 주 동안 유지되는 날이 검출 될 수 있다면 PMX-순수하지 않아 -MGT 구조가 사용됩니다. 14 일에 10 일까지, cTnT를하고 αActinin 같은 심장 마커의 발현이 시작 섬유 아 세포가 심장 세포를 향해 재 프로그래밍을 겪고 있음을 나타내는 두 ICC (그림 2B, 5 단계) 및 외과 (그림 2A, 6 단계)에 의해 검출 될 수있다 운명.

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그림 1. 각 시점에서 직접 심장 재 프로그래밍 ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜을 사용하는 경우 성공적인 ICM 생성을위한, 전체 효율에 영향을 미치는 중요한 요인은 몇 가지가있다. 특히 섬유 아세포의 개시 조건으로 레트로 바이러스 부호화 MGT의 품질이 크게 리 프로그래밍의 효율에 영향을 미칠 수있다.

그것은 가능한 한 신선하고 건강한 섬유 아 세포를 생성하는 것이 중요하다. 이식편 후 7 일이 접시에 플레이 팅 하였다 전에 이식편 배양 방법, 섬유 아세포가 사용될 수있다. 효소 분해 방법의 경우, 섬유 아세포의 격리 빠르면 다음날로서 사용될 수있다. 냉동 또는 재 프로그래밍의 섬유 아 세포를 계대하지 않는 것이 좋습니다. 섬유 아 세포의 이러한 추가 치료는 크게 프로그래밍의 효율성을 감소합니다. 시딩 밀도 리 프로그래밍의 효율에 영향을 미치는 또 다른 중요한 인자이다. 세포가 띄엄 띄엄 시딩 경우, 불규칙한 세포 형태와 크기에 큰 해로운지는 경향. 좀처럼 공동 없습니다ULD 그 균체 ICMS로 변환 될 수있다. 세포가 너무 조밀하게 파종하...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UNC 유세포 분석 코어 및 UNC 현미경 코어의 전문적인 기술 지원에 감사드립니다. 원고에 대한 유용한 토론과 비판적 검토를 해주신 Qian 연구실과 Liu 연구실 구성원들에게 감사드립니다. 이 연구는 Liu 박사에 대한 NIH/NHLBI R00 HL109079 보조금, 미국심장협회(AHA) 과학자 개발 보조금 13SDG17060010 및 Qian 박사에 대한 Ellison Medical Foundation(EMF) New Scholar Grant AG-NS-1064-13의 지원을 받았습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
항-심장 트로포닌 TThermo ScientificMS-295-PO1:200 FACS 및 ICC
anti-GFPLife TechnologiesA111221:500 FACS 및 ICC
항-아액티닌Sigma-AldrichA78111:500 FACS와 ICC
항-Connexin43Sigma-AldrichC62191:500 for  ICC
anit-Mef2cAbcamab646441:1,000 ICC 
anti-Gata4Santa Cruz Biotechnologysc-12371:200 ICC
anti-Tbx5Santa Cruz Biotechnologysc-178661:200 ICC
Alexa Fluor 488– 결합 당나귀 항토끼 IgGJackson ImmunoResearch Inc711-545-1521:500 FACS와 ICC
Alexa Fluor 647– 세포Jackson ImmunoResearch Inc715-605-1501:500
BD Biosciences554722
Rhod-3 Calcium Imaging KitLife TechnologiesR10145
Thy1.2 마이크로비즈Miltenyi Biotec130-049-101
DAPI가 포함된 Vectashield 솔루션Vector labsH-1500
FBSSigma-AldrichF-2442
Trypsin-EDTA (0.05%)Corning25-052
PRMI1640 mediumLife Technologies11875-093
B27 supplementLife Technologies17504-044
IMDMLife Technologies12440-053
Opti-MEM 저감 혈청 MediumLife Technologies31985-070
M199 MediumLife Technologies10-060
DMEM, 고포도Life Technologies10-013
페니실린-스트렙토마이신Corning30-002
비필수 아미노산Life Technologies11130-050
리포펙타민 2000라이프 테크놀로지11668500
blasticidin라이프 테크놀A11139-03
퓨로마이신라이프 테크놀로지A11138-03
콜라겐 분해 효소 II워딩턴LS004176
폴리브레인밀리포어TR-1003-G
트리톤 X-100피셔BP151-100
CaCl< sub>2시그마-알드리치C7902
HEPES시그마-알드리치H4034
NaCl시그마-알드리치BP358-212
KCl시그마-알드리치PX1405
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
포도당시그마-알드리치G6152
소 혈청 알부민피셔9048-46-8
파라포름알데히드EMS15714
레트로바이러스 침전 용액ALSTEMVC-200
0.4% 트리판 블루 용액시그마-알드리치T8154
젤라틴시그마-알드리치G1393
CaCl2 및 MgCl2 없는 Dulbecco의 PBS (D-PBS, 1x)Sigma-AldrichD8537
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)Corning21022
LS columnMiltenyi Biotec130-042-401
0.45 μ M 셀룰로오스 아세테이트 필터 Thermo Scientific190-2545
24-웰 플레이트Corning3524
10 cm 조직 배양 접시 Thermo Scientific172958
60mm 센터 웰 컬처 디쉬   Corning3260
96 Well Clear V-Bottom 2 ml 폴리프로필렌 딥 웰 플레이트Denville ScientificP9639
폴리스티렌 라운드-바텀 튜브와 셀-스트레이너 캡;BD Biosciences352235
원심분리기Eppendorf5810R
Vortexer MINIVWR58816-121
EVOS FL 자동 세포 이미징 시스템생명 기술AMAFD1000
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MidiMACS 분리기Miltenyi Biotec130-042-302
원형 유리 커버 슬립전자 현미경 과학72195-15
모두에 대해 내 염색을 위한 FACS 및 ICC Cytofix/Cytoperm 키트용 복합 당나귀 안티 마우스 IgG 당 스 로지스 스

References

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Induced CardiomyocytesCardiac FibroblastsPolycistronic ConstructGata4 Mef2c Tbx5Retroviral ReprogrammingCell IsolationFlow Cytometry AnalysisImmunochemistry DetectionPurmycin SelectionGFP Expression

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