대장균에서 봉입체로 발현되는 재조합 Shadoo 단백질의 정제와 정제된 Shadoo를 아밀로이드 구조로 섬유화하는 프로토콜을 위한 2단계 크로마토그래피 방법이 설명되어 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
대장균 발현 시스템은 재조합 진핵 단백질의 생산을위한 강력한 도구이다. 우리는 Shadoo, 프리온 가족에 속하는 단백질을 생산하기 위해 사용합니다. 봉입체 설명 된 바와 같이 (그의) 6 -tagged 재조합 Shadoo의 정제를위한 크로마토 그래피 방법을 표현했다. 봉입체는 8 M 유레아에 용해하고 이온 친 화성 크로마토 그래피를 수행하는 니켈 2+ -charged 칼럼에 결합된다. 결합 된 단백질은 이미 다졸 구배로 용출된다. Shadoo 단백질을 함유하는 분획을 고도로 정제 된 단백질을 수득하는 크기 배제 크로마토 그래피를 실시한다. 마지막 단계 정제 Shadoo에서 염, 우레아 및 이미 다졸을 제거하는 탈염된다. 재조합 Shadoo 단백질 프리온 질환에서 발생하는 단백질의 입체 장애의 생물 물리학 및 생화학 연구를위한 중요한 시약이다. 대부분의 보고서는 프리온 신경 퇴행성 질환이 자상의 증착에서 발생한 것을 증명제작은 아밀로이드 원 섬유를 주문했다. 산성 및 중성에서 아밀로이드 원 섬유로 Shadoo을 피 브릴하는 방법을 설명하는 샘플 프로토콜 / 기본 pH 값이 표시됩니다. 생산하고 신속하고 저렴한 비용으로 단백질의 대량 생산이 가능하기 때문에 Shadoo은, 프리온 질환에 작업 실험실에서 연구를 용이하게 할 수있다 피 브릴하는 방법에 대한 방법.
서론
인간의 양 및 크로이츠 펠트 - 야콥병에서 소 해면상 소에서 뇌, 스크래피를 포함 프리온 신경 퇴행성 질환은 치명적 및 불치이다. 프리온 질병은 주로 가교 β 시트로, α-나선 이루어지는 세포 프리온 단백질의 형태 적 변화에 의해 특징 1,2- 콘 포머 (conformer) 아밀로이드 농후. 크로스 - β-구조는 조밀 포함 높은 순서 결정과 같은 β-시트는 수소 결합 3,4 안정화. 프리온 아밀로이드 모집에 대한 템플릿을 제공하고 단량체 단백질 변환 부 성장 가장자리에 β-가닥에 의한 자기 복제를 할 수 있습니다.
"단백질 만"가설에 따르면, 프리온 단백질 아밀로이드 콘 포머 (conformer)가 단독 감염원이다. 그러나, 일부 다른 생체 분자 프리온 질환에 필수적인 것으로 제안되어있다. 예를 들어, 세포막 곳 어디 conversi 것으로 생각되고켜짐 일어나며 일부 음으로 하전 된 지질은 변환 처리 5,6-을 강화하는 것으로 나타났다. 또한, 일부 단백질은 또한 프리온 병리에 관여 할 수있다. Doppel 및 Shadoo 7,8 : 특히, 프리온 단백질 가족의 다른 두 멤버가있다. Doppel는 디 황화 다리와 안정 상대적으로 견고한 구조를 가지고 있으며, 아....
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프로토콜
플라스미드 및 Shadoo 식의 1 세대
주 : 유전자 부호화 뮤린 Shadoo 단백질 (Shadoo 25부터 1백22까지)를 발현 벡터를 pET-28 (11)에 서브 클로닝 하였다. 이 클론은 E.으로 변화되었다 앞서 설명한 바와 같이 11 대장균 N 말단 헥사 히스티딘 태그 (HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG)와 Shadoo 단백질을 발현하는 균주를 SoluBL21. 플라스미드는 저자에서 요청하실 수 있습니다. 그 아미노산 서열로부터 계산 Shadoo의 분자량은 12,243.2 다이다.
참고 : laminal 흐름 후드 아래에 또는 가까운 분젠 화염에 세균 모든 조작을 수행합니다.
- 표준 열 쇼크 프로토콜을 사용하여 pET-28-그의 6 -Shadoo 플라스미드 유능한 SoluBL21 박테리아 변환. 플라스미드 1~5 μL이 믹스 (전형적으로 10 내지 100 PG튜브에서 박테....
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결과
정제 Shadoo 단백질의 5-10 mg의 세균 배양 리터당 얻어진다. 두 단계의 정제는 고순도의 재조합 Shadoo을 구하는데 필요하다. 첫 번째 단계는 그의 - 태그 - 단백질을 유지하는 니켈 2 + -charged 컬럼 친 화성 크로마토 그래피에 의해 수행된다. 용출 분획을 SDS-PAGE를 실시하고 쿠마 브릴리언트 블루 (그림 5A)로 염색한다. Shadoo 단백질을 함유하는 분획을 모으고 또한 그 크기에 따라 분리하여 단백질을 크기 배제 크로마토 그래피 (Shadoo 분자량이 약 12 kDa의 경우)에 의해 정제된다. 용출에 수집 된 분획을 SDS-PAGE / 쿠마 분석 (그림 5B)에 의해 시각입니다. 또한 Shadoo은 단백질 C 말단 영역 (도 5C)로부터 76에서 1백5까지 아미노산 사이에 민감한 에피토프에 결합하는 특정 항 Shadoo 항체를 사용 SPRN 웨스턴 블롯에 의해 입증된다.
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토론
발현 및 재조합 마우스 Shadoo 단백질의 다량의 정제 모두에 대한 쉽고 효율적인 프로토콜이 제시된다. 기재된 방법은 성공적인 가용화 및 (그의 6) -tagged Shadoo 재조합 단백질을 정제 할 수있다. 제목에서 지적했듯이 그것은 중요하다 원핵 박테리아 E. 표현하는 경우 대장균 Shadoo은 봉입체에 축적. Shadoo 정제에 앞서, 박테리아는 트리톤 X-100을 함유하는 완충액에 용해하여 초음파 처리되어야한다. 이어서 봉입체는 8 M 우레아 변성 용액에 용해 될 수있다. 또한, 전체 정제 과정 Shadoo가 중합 및 응집 경향 때문에 8 M 우레아 완충액에서 수행되어야한다. 친 화성 크로마토 그래피 및 크기 배제 크로마토 그래피 : 가용화 및 봉입체 정화 후 변성 단백질을 함유하는 상등액을 두 단계의 정제 과정에 적용된다. 선호도 chromatog그래피 단계는 니켈 2 +는 킬레이트 열을 -charged에 (그의 6) -ta.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 Sho cDNA를 제공해 준 Natalie Doude와 David Westerway(앨버타 대학), 플라스미드 구축을 위해 Christophe Chevalier(INRA), BL21Sol 박테리아를 제공한 Michel Brémont(INRA)에게 감사를 표합니다. TEM 지원은 Christine Longin(INRA)이고 의견 및 교정은 Edith Pajot-Augy(INRA)입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| AKTA FPLC | GE, Amersham | # 1363 | |
| HiLoad 16/60 Superdex | GE Healthcare | 17-1069-01 | |
| HiTrap IMAC | GE Healthcare | GE17-0920-05 | |
| HiPrep26/10 탈염 컬럼 | GE Healthcare | GE17-5087-01 | |
| SoluBL21 유능한 대장균 | Genlantis | C700200 | |
| pET-28b+ | Novogen | 69865-3 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LB-Broth 매체 | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Eppendorf Biophotometar | Eppendorf | 550507804 | |
| Trito X-100 | Life Technologies | 85111 | |
| NiSO4 | Sigma-Aldrich | 656895 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T | |
| 프로테아제 억제제 칵테일 정제 | Roche | 4693116001 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Gdn-HCl | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| 단백질 크기 마커 | 써모 피셔 사이언티픽 | 26620 |
참고문헌
- Biasini, E., Turnbaugh, J. A., Unterberger, U., Harris, D. A. Prion protein at the crossroads of physiology and disease. Trends in Neurosciences. 35, 92-103 (2012).
- Colby, D. W., Prusiner, S. B. De novo generation of prion strains. Nature Reviews. Microbiology. 9, 771....
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재인쇄 및 허가
