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방법 논문

가변 각도 표면 형광 현미경으로 식물 세포 표면 역학의 실시간 영상

8.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53437

⸱

2015년 12월 12일

1Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo

이 논문에서

요약

이 프로토콜의 목적은 기공 복합체의 세포 피질에, GFP - 태그 PATROL1, 막 인신 매매 단백질의 점을 점멸 표시 가변 각도 표면 형광 현미경으로 식물 세포 표면에 형광 표지 된 단백질의 역학을 모니터링하는 방법을 설명하는 것입니다 애기 장대.

초록

식물의 세포 표면은 환경적 단서를 인식하기 위한 인터페이스입니다; 식물은 막 이동(membrane trafficking)과 세포골격 재배열(cytoskeletal rearrangement)과 같은 세포의 생물학적 변화로 반응합니다. 이러한 세포 내 이벤트에 대한 실시간 및 고해상도 이미지 분석은 분자 수준에서 식물 세포 생물학에 대한 이해를 높일 것입니다. VAEM(Variable angle epifluorescence microscopy)은 식물 세포 표면에서 형광 표지된 단백질의 고품질 타임 랩스 이미지를 제공하는 새로운 기술입니다. 이 기사에서는 VAEM 표본 준비, VAEM 광학 시스템 조정, 동영상 캡처 및 이미지 분석을 위한 실제 절차를 설명합니다. VAEM 관찰의 예로, PATROL1의 역학에 대한 대표적인 결과를 제시합니다. 이것은 기공 운동에 필수적인 단백질로, 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 기공 복합체(stomatal complex)에 있는 원형질막(plasma membrane)으로의 양성자 펌프 전달에 관여하는 것으로 생각됩니다. A. thaliana 자엽의 보호 세포와 보조 세포에 대한 VAEM 실시간 관찰은 형광 태그가 지정된 PATROL1이 원형질막에서 몇 초 동안 점 같은 구조로 나타났다가 사라지는 것을 보여주었습니다. VAEM 영화 데이터의 Kymograph 분석을 통해 점과 같은 구조의 존재('체류 시간'이라고 함)의 시간 분포를 결정했습니다. VAEM의 사용은 이 예제의 맥락에서 설명합니다.

서론

원형질막과 바로 인접한 세포질을 포함한 식물 세포 표면은 식물 세포가 세포 외 환경에서 생체 및 비생물적 신호를 인식하고 통합하는 주요 영역입니다. 이러한 신호에 대한 반응으로 원형질막 단백질과 피질 세포골격을 포함한 세포 표면 구성 요소는 몇 초에서1-4분까지의 시간 척도로 동적 변화를 겪습니다. 따라서 세포 표면의 형광 단백질에 대한 실시간 고해상도 이미징은 분자 수준에서 환경 신호에 대한 식물의 반응을 조명할 수 있습니다.

컨포칼 레이저 스캐닝 현미경은 형광 표지된단백질 국소화를 측정하기 위한 강력한 도구이지만3, 상대적으로 긴 캡처 시간으로 인해 실시간 단백질 역학을 모니터링하기 어려운 경우가 많습니다. 식물 세포의 단백질을 실시간으로 모니터링하기 위한 새로운 기술은 전사 형광(TIRF) 현미경 검사에 일반적으로 사용되는 장비를 개조한 가변 각도 형광 현미경(VAEM)입니다. TIRF 현미경 검사에서 형광-여기 광원은 레이저의 진입 각도가 유리-물 계면에서 빛을 완전히 내부적으로 반사할 수 있을 만큼 얕을 때 생성되는 소멸 광장입니다. 소멸 광장의 투과 깊이는 약 100nm입니다. TIRF 현미경 검사는 동물 세포의 외세포작용(exocytosis) 검출과 같은 단일 분자 이미징을 위한 뛰어난 도구입니다5. 그러나 소멸광은 식물 세포의 원형질막이나 피질 세포질에 도달할 수 없는데, 이는 세포벽이 두껍기 때문입니다. 최근 TIRF 현미경 검사 장비는 식물 세포 생물학자들에 의해 채택되었으며, 레이저가 전체 내부 반사 현상을 유도하는 데 사용되는 경우보다 약간 더 깊은 각도를 취하면 식물 세포 샘플의 표면을 여기시켜 고품질 식물 세포 이미징을 얻을 수 있음을 관찰했습니다6,7. 여기 조명 깊이는 레이저의 진입 각도를 조정하여 변경됩니다. 따라서 이 기술을 VAEM이라고 합니다. 이 광학 시스템은 세포벽-주위 계면7에서 전체 반사가 발생할 가능성이 있기 때문에 가변 각도 TIRF 현미경(VA-TIRFM)이라고도 하지만, 플랜트6의 첫 번째 보고서에 따르면 이 기사에서는 VAEM이라는 용어를 사용합니다.

이 프로토콜의 목표는 VAEM을 사용하여 식물 세포 표면에서 형광 태그가 지정된 단백질 역학을 시각화하는 실용적인 절차를 보여주는 것입니다. 또한 VAEM 영화 분석을 위해 분자의 체류 시간(존재 기간)을 정량화하기 위한 이미지 분석 프로토콜이 설명되어 있습니다. 애기장대(Arabidopsis thaliana cotyledons)의 기공 복합 세포에 대한 GFP-PATROL1 점 깜박임이 예로 사용됩니다. PATROL1는 순유전학적 접근법에 의해 A. thaliana8의 기공 반응 결함 돌연변이의 원인 유전자로 확인되었습니다. PATROL1는 MUNC-13의 식물 상동체로, 시냅스 소포 외포작용8의 프라이밍 인자입니다. 빛이나 습도와 같은 환경적 신호에 대한 반응으로, PATROL1는 기공 복합체의 원형질막으로의 양성자 펌프의 전달을 가역적으로 조절하는 것으로 생각됩니다. 기공 복합체는 각각 한 쌍의 보호 세포(guard cell)8와 보조 세포(subsidiary cell9)9로 구성되며, 기공 이동을 위해 양성자 펌프(proton pump)를 필요로 한다. 이러한 세포에서 GFP 표지 PATROL1는 원형질막에 1분 미만 동안 남아 있는 점 모양의 구조로 국소화됩니다9.

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프로토콜

모종의 1. 준비

  1. 씨앗을 소독.
    1. 1 μL 10 % 트리톤 X-100-500 μL 멸균 : 500 μL 차아 염소산 나트륨 (5.0 % 사용할 수 염소)를 추가하여 살균 솔루션을 준비합니다.
    2. 장소의 약 10 형질 전환 A. 1.5 ML 튜브에 GFP - PATROL1 8을 들고 장대 씨.
    3. 1 ml의 70 % 에탄올 용액을 추가, 5 번 반전 잘 섞는다. 1 분 동안 둡니다.
    4. 씨앗은 튜브의 바닥에 가라 관찰한다. 깨끗한 층류 캐비닛 부드럽게 마이크로 피펫을 사용하여 70 % 에탄올을 제거하고 1 mL의 멸균 용액을 추가. 다섯 번 반전 잘 혼합하고 5 분 동안 둡니다.
    5. 씨앗을 씻으십시오. 또 클린 벤치에 무균 상태에서 작업, 부드럽게 마이크로 피펫을 사용하여 용액을 제거하고, 1 ml의를 멸균 물을 추가합니다. 이 다섯 번 반복합니다. 살균 된 종자를 2 일 동안 4 ℃에서 멸균에 저장 될 수있다.
  2. 그래서0.5 % 젤란 검 화 1/2 무라 시게과 스쿡 중간 판 (PH 5.8) 9 살균 씨앗 승. 외과 테이프의 두 레이어를 사용하여 접시에 뚜껑을 테이프입니다.
  3. 냉장 챔버, O / N과 4 ° C에서 어둠 속에서 접시를 품어.
  4. 100 μmol m -2 초 -1 흰색 조명을 사용하여 12 시간 / 12 시간의 명암주기와 23.5 ° C로 설정 성장 챔버로 접시를 전송하고, 7 일간 배양한다. 길이 약 1mm의 자엽과 모종은 수확 할 수있다.

2. 스카이 드롭 떡잎 표본의 설치

주 : VAEM 관찰 용 시료 제조에 중요한 요소는 표본과 커버 유리 사이에 기포의 혼입을 피할 수있다. 거품이 크게 굴절률 차이시킴으로써 VAEM의 화질을 감소시킨다. 우리가 장착 '하늘 드롭'라고 한 간단한 방법은, 거품을 방지하기 위해 사용될 수있다A. 사이 장대 자엽과 커버 유리. 이 관찰 직전에 수행해야합니다.

  1. 76 : 기초 버퍼 [5 mM의 2- (N의 -morpholino) -ethanesulfonic의 pH 6.5에서 산 트리스 (MES 트리스), 50 mM의 KCl을, 100 μm의 염화칼슘 2] 유리 슬라이드의 중심에 (크기의 30 μl를 배치 × 26mm, 두께 : 1.0 ~ 1.2 mm).
  2. 해부 가위를 사용하여 7 일짜리 묘목에서 자엽을 제거합니다. 관찰 측이 기초 버퍼 드롭 (그림 1, 1 단계)에 위를 향하게 자엽 플로트.
  3. 커버 유리의 중심에 기초 버퍼의 30 μl를 놓습니다 (크기 : 18 × 18mm, 두께 : 0.12-0.17 mm) (그림 1, 2 단계). 거꾸로 부드럽게 커버 유리를 돌립니다. 표면 장력은 탈락에서 버퍼 저하를 방지 할 수 있습니다. 하나의 가장자리에 핀셋과 커버 유리를 잡고. 버퍼 강하가 약 떡잎 위에 있도록 유리 슬라이드에 반대 가장자리를 놓습니다.
  4. 이 자엽 샘플 (도 1, 단계 3) 바로 위에 있도록 슬라이드 여전히 커버 유리의 가장자리, 여전히 핀셋 반대쪽 가장자리 들고, 커버 유리 아래 버퍼 강하 위치를 조정한다. 커버 유리 가자. 기포없이 준비의 결과로 샘플에 드롭을 탑재합니다.
  5. 보풀이없는 조직을 사용하여 과도한 버퍼를 닦아냅니다. 바로 준비를 관찰 (3 단계 참조).
    참고 : 샘플을 밀봉 할 필요가 없습니다.

3. VAEM 관측 및 영화 취득

도립 현미경 TIRF 유닛과 1.49의 개구 수를 가지는 대물 렌즈 TIRF 장착되어 참고 : 다음과 같이, 본 연구에 사용 TIRF 현미경 시스템 (9)에 대하여 설명한다. 레이저 진입 각도의 컴퓨터 제어를 들어, 컨트롤 박스가 사용된다. 녹색 형광 단백질 (GFP)는 488 nm의 광 펌핑 반도체 레이저 및 T와 흥분그 형광은 엽록체에서자가 형광을 방지 5백10부터 5백50까지 nm의 대역 통과 필터로 검출된다. 광 출력 전력의 측정 된 최대 값은 13.0에서 13.5까지 mW였다. 검출을 위해, 전자가 사용된다 (EM-CCD) 카메라 헤드 시스템 및 C 마운트 카메라 배율 변경 단위 전하 결합 소자를 승산.

  1. 레이저는 제조자의 지시에 따라 중심 및 포커스 캘리브레이션.
    참고 :이 단계는 정확한 VAEM 관측을 위해 중요하다. 그것은 강력 레이저 경로 조정 절차의 정기적 인 검사, 현미경에 적합한, 수행하는 것이 좋습니다.
    1. 현미경 실의 천장에 대물 렌즈가없는 광경으로 조명 중심 위치를 결정합니다. 중앙 위치를 표시하기 위해 천장에 색칠 된 원 씰을 넣어 (그림 2, 1 단계, 2).
    2. 대물 렌즈 (그림 2, 3 단계, 4)와 천장 조명. 나는 이동중심 위치 (그림 2, 5 단계)로 영역을 lluminated. 레이저 (그림 2, 6 단계)에 초점을 맞 춥니 다. 미세 조정 센터 (그림 2, 7 단계)에 초점을 맞춘 레이저의 위치.
  2. 현미경의 무대에서 표본을 설정하고 시야 조명을 사용하여 관찰 셀을 선택합니다.
  3. 형광 단백질이 세포에서 관찰 될 수 있다는 것을 확인하고, 표면 형광 조명을 (도 3a)을 사용하여 세포 표면의 Z 위치를 설정시킴으로써 행한다.
  4. VAEM 관측을 수행합니다.
    1. 제어기 상자 서서히 레이저 빔의 진입 각도 경사지게. 동시에, 신중하게 라이브 영상을 모니터링 할 수 있습니다. 초기에, 이미지는 (도 3b)을 흐리게한다.
    2. 레이저 각도가 증가함에 따라, 화상 VAEM 결국 선명한 화상 (도 3c 및 D)의 제조, 이하 희미해질 것이다. 이 시점에서, increa을 중지레이저 각도를 노래. 형광 신호가 손실되는 경우, 더 얕은 각도로 감소한다.
    3. 미세 조정 레이저 진입 각도는 더 나은 이미지를 얻을 수있다. 미세 조정 Z시킴으로써 행한다 위치는 이미지를 향상시킬 수 있습니다. 필요한 경우, 광학 파라미터 (레이저 파워, 파장 필터 집합)과 이미지 센서 파라미터 [화상 사이즈, 노출 시간, 게인, 디지타이저와 승산 전자 (EM)의 이득]을 조정한다.
      주 : TIRF 현미경 장비의 경우 전술 한 바와 같이 다음에, 대표적인 파라미터이다. 그냥 카메라 앞에 렌즈의 배율 : 2 배; 레이저 출력 : 1.0 mW의; 이미지 크기 : 512 × 512 픽셀; 노출 시간 : 100 밀리 초; 게인 : 5 ×를; 디지타이저 : 11 MHz의; 및 EM 이득 : 100.
  5. 현미경 상용 소프트웨어를 사용하여 멀티 페이지 TIFF 이미지 파일로서 영화를 취득. 여기서, 영화 기공 세포의 표면 상에 점멸 GFP 표지 된 점이다.
    주 : 대표 화상 취득 조건 FOL 같다최저. 획득 모드 : 스트림 RAM에; 프레임 수 : 600; 멀티 페이지 TIFF 파일 크기 : ~ 302메가바이트

4. Kymograph 분석 정량 GFP 표지 점 레지던스 시간의 피지 소프트웨어를 사용하여

  1. 피지를 설치 저자의 지침을 사용하여 소프트웨어 (10) ( '피지 그냥 ImageJ에입니다') (http://fiji.sc/Fiji).
  2. 피지를 실행하고 피지 메뉴 "파일 - 열기"를 사용하여 획득 한 멀티 페이지 TIFF 파일을 엽니 다.
  3. 피지 도구 모음 메뉴 "직선 선택 도구"를 사용하여, 관심있는 사이트에 줄을 놓습니다. 선택적으로, "분단 선 선택 도구"또는 "자유 곡선 선택 도구"를 사용합니다. 여기에 제시된 결과에서 (8.0 μm의 상당) 100 픽셀의 직선 자회사 세포 (도 4a)에 위치시켰다.
  4. 피지 메뉴 "이미지 - 스택 - 동적 다시 분할을 사용하여 kymograph 이미지를 확인 "(http://fiji.sc/Dynamic_Reslice) (그림 4B). 선택적으로, 체크 박스 창 및 「90도 회전」 「세로 플립 "도 (100 픽셀에 대응하는 (여기에 제시된 결과에서 사용되지 않음) kymograph 이미지. X 축 및 Y 축 라인의 위치를 나타내는 사용할 8.0 μm의) 및 관찰 시간은 (600 픽셀 각각) 60 초에 대응. kymograph 이미지가 만족스럽지 않으면, 위치 및 유형 (직선, 분할 및 다중 페이지 이미지 라인의 자유형)있다. 변화 될 수있다 라인 변경, kymograph 이미지가 동적으로 변경됩니다. 피지 메뉴 "파일 - 다른 이름으로 저장 - 티파니"를 사용하여 TIFF 파일로 kymograph 이미지를 저장합니다.
  5. 시간축 방향에서 블롭의 길이를 측정한다.
    1. 노이즈 감소를 수행하려면, 피지 메뉴 "프로세스 - 필터 - 가우시안 블러"를 사용하여 kymograph 이미지에 가우시안 필터를 적용합니다. "시그마 (라드IUS)은 "조정 가능한 파라미터는 (1 화소 반경 제시된 결과에 이용된다)이다.
    2. 세그먼트 피지 메뉴를 사용하여 임계 값에 의한 신호 영역, "이미지 - 조정 - 임계 값".
      주 : 선택할 수있는 여러 임계 알고리즘이 있습니다. 발표 결과에서 "엔"알고리즘은 (그림 4C) 선택되었다.
    3. 메뉴를 이용하여 이동시킴으로써 행한다 블롭의 시간 길이 (y)를 측정하도록 준비 "분석 설정된 측정". "세트 측정"창에서 "경계의 구형"을 확인하십시오. 이상적 영역 세트는 노이즈를 배제하는, 가능한 한 작아야한다. 여기서, 극소 영역의 화소는 50으로 설정 하였다. 시간 (Y)를 사용하여 메뉴시킴으로써 행한다 블롭의 길이를 측정 "분석 - 입자 분석". 관리자에 추가 "결과 값을 구하여 측정 영역의 신뢰성을 입증,"결과 표시 "를 확인하려면 </ EM> "상자.
    4. "높이"열의 값 (Y)를 측정 BLOB (그림 4D)에 대한 길이를 이동시킴으로써 행한다 시간입니다. 결과 테이블 메뉴 "파일 - 다른 이름으로 저장"을 사용하여 값을 저장하고 계산 및 통계 패키지 및 / 또는 스프레드 시트 소프트웨어 (그림 4E)를 사용하여 BLOB 이미지 기간의 데이터 세트를 처리합니다.

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결과

이 비디오 기사, A에 GFP - PATROL1의 VAEM 관찰을위한 프로토콜에서 장대 떡잎 기공 복잡한 세포가 제공됩니다. 하늘 강하 실장은 A. VAEM 제제의 기포의 발생을 감소시킬 수있는 간단한 제조 방법 장대 자엽 (그림 1). 엔트리 레이저 및 / 또는 VAEM에 대한 표본의 Z-위치의 과도하게 기울 것은 분명 이미지를 제공합니다. 그렇게되면, 그것은 표면 형광 조명에 의해 판단으로 즉시 샘플 위의 위치부터 다시 시작하는 것이 좋습니다. VAEM 관찰 며칠 경험 한 결과, 이러한 점멸 도트 GFP-PATROL1의 여기에 도시 한 바와 같이, 성공적으로 일상적 VAEM 동영상을 취득 할 수 있어야한다. 도 4, A. 12 독립 법인 세포에서 GFP-185 PATROL1 도트의 체류 시간에서 제시 kymograph 분석을 이용하여 장대 자엽을 측정 하였다. 장착 밀...

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토론

이 비디오 기사에서는 프로토콜 모니터링 및 애기 장대의 기공 단지에 GFP - PATROL1 점의 동적 거동을 측정하기 위해 제공됩니다. 여기에 도시 된 바와 같이, VAEM 관찰 식물 세포 표면의 라이브 영상을위한 강력한 도구입니다. 고감도 EM-CCD는 VAEM 광학계에 비교적 약한 여기 레이저의 사용을 허용하기 때문에 GFP-PATROL1 모니터링 여기 사용 된 실험 조건 하에서, 비디오 캡쳐의 1 분에 사용 시료 거의 형광 광표백가 있었다. 레이저 센터링 및 각 실험의 시작하기 전에, 포커스, 성공적인 VAEM 관찰을 위해 중요하다. 사용자는 VAEM를 사용하기 전에 선택한 현미경 회사에서 전문 직원에 의해 훈련해야한다.

VAEM는 GFP - PATROL1는 세포막에 깜박이는 움직이지 점 같은 구획 동적 현지화를 가지고 있음을 알 수있다. 형광 표지 된 세포막 프로톤 펌프 AHA1 오 -1-, 공변 세포와 보조 세포 patrol1 돌연변...

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공개 사항

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감사의 글

VAEM에 대한 기술적 제안을 해주신 Masaru Fujimoto 박사님께 감사드립니다. 또한 GFP-PATROL1 형질전환 식물을 제공하고 PATROL1에 대해 논의해 주신 Koh Iba 교수님과 Mimi Hashimoto-Sugimoto 박사님께도 감사드립니다. 하세자와 세이이치로(Seiichiro Hasezawa) 교수님께, 저의 연구를 지속적으로 지원해 주신 것에 대해 감사드립니다. 이 연구는 일본 과학 진흥회(JSPS) KAKENHI 보조금 번호 25711017의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
반전 현미경OlympusIX-73
TIRF 유닛OlympusIX3-RFAEVAW
TIRF 대물 렌즈 올림푸스UAPON 100 × 오티르프 해당 없음 = 1.49
레이저 각도 제어 상자Chuo SeikiQT-AK
광학 펌핑 반도체 레이저CoherentSapphireTM LP USB 488-20 CDRH 레이저
510– 550 nm 밴드 패스 필터OlympusU-FBNA
EM CCD 카메라Hamamatsu PhotonicsImagEM C9100-13
C-마운트 카메라 배율 변경 장치 OlympusU-TVCAC
MetaMorph 소프트웨어Molecular DevicesMetaMorph 버전 7.7.11.0
TIRF 현미경 검사 매뉴얼OlympusAX7385지침: 전반사 조명 시스템(2012년 8월 24일 일본에서 인쇄)
이멀젼 오일올림푸이멀젼 오일 Typr-Fne = 1.518(23도)
스

참고문헌

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  16. Ueda, H., et al. Myosin-dependent endoplasmic reticulum motility and F-actin organization in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (15), 6894-6899 (2010).

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