가변 각도 표면 형광 현미경으로 식물 세포 표면 역학의 실시간 영상

Summary

이 프로토콜의 목적은 기공 복합체의 세포 피질에, GFP - 태그 PATROL1, 막 인신 매매 단백질의 점을 점멸 표시 가변 각도 표면 형광 현미경으로 식물 세포 표면에 형광 표지 된 단백질의 역학을 모니터링하는 방법을 설명하는 것입니다 애기 장대.

Abstract

식물의 세포 표면은 환경적 단서를 인식하기 위한 인터페이스입니다; 식물은 막 이동(membrane trafficking)과 세포골격 재배열(cytoskeletal rearrangement)과 같은 세포의 생물학적 변화로 반응합니다. 이러한 세포 내 이벤트에 대한 실시간 및 고해상도 이미지 분석은 분자 수준에서 식물 세포 생물학에 대한 이해를 높일 것입니다. VAEM(Variable angle epifluorescence microscopy)은 식물 세포 표면에서 형광 표지된 단백질의 고품질 타임 랩스 이미지를 제공하는 새로운 기술입니다. 이 기사에서는 VAEM 표본 준비, VAEM 광학 시스템 조정, 동영상 캡처 및 이미지 분석을 위한 실제 절차를 설명합니다. VAEM 관찰의 예로, PATROL1의 역학에 대한 대표적인 결과를 제시합니다. 이것은 기공 운동에 필수적인 단백질로, 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 기공 복합체(stomatal complex)에 있는 원형질막(plasma membrane)으로의 양성자 펌프 전달에 관여하는 것으로 생각됩니다. A. thaliana 자엽의 보호 세포와 보조 세포에 대한 VAEM 실시간 관찰은 형광 태그가 지정된 PATROL1이 원형질막에서 몇 초 동안 점 같은 구조로 나타났다가 사라지는 것을 보여주었습니다. VAEM 영화 데이터의 Kymograph 분석을 통해 점과 같은 구조의 존재('체류 시간'이라고 함)의 시간 분포를 결정했습니다. VAEM의 사용은 이 예제의 맥락에서 설명합니다.

Introduction

원형질막과 바로 인접한 세포질을 포함한 식물 세포 표면은 식물 세포가 세포 외 환경에서 생체 및 비생물적 신호를 인식하고 통합하는 주요 영역입니다. 이러한 신호에 대한 반응으로 원형질막 단백질과 피질 세포골격을 포함한 세포 표면 구성 요소는 몇 초에서^1-4분까지의 시간 척도로 동적 변화를 겪습니다. 따라서 세포 표면의 형광 단백질에 대한 실시간 고해상도 이미징은 분자 수준에서 환경 신호에 대한 식물의 반응을 조명할 수 있습니다.

컨포칼 레이저 스캐닝 현미경은 형광 표지된^{단백질 국소화}를 측정하기 위한 강력한 도구이지만3, 상대적으로 긴 캡처 시간으로 인해 실시간 단백질 역학을 모니터링하기 어려운 경우가 많습니다. 식물 세포의 단백질을 실시간으로 모니터링하기 위한 새로운 기술은 전사 형광(TIRF) 현미경 검사에 일반적으로 사용되는 장비를 개조한 가변 각도 형광 현미경(VAEM)입니다. TIRF 현미경 검사에서 형광-여기 광원은 레이저의 진입 각도가 유리-물 계면에서 빛을 완전히 내부적으로 반사할 수 있을 만큼 얕을 때 생성되는 소멸 광장입니다. 소멸 광장의 투과 깊이는 약 100nm입니다. TIRF 현미경 검사는 동물 세포의 외세포작용(exocytosis) 검출과 같은 단일 분자 이미징을 위한 뛰어난 도구....

Protocol

모종의 1. 준비

1. 씨앗을 소독.
   1. 1 μL 10 % 트리톤 X-100-500 μL 멸균 : 500 μL 차아 염소산 나트륨 (5.0 % 사용할 수 염소)를 추가하여 살균 솔루션을 준비합니다.
   2. 장소의 약 10 형질 전환 A. 1.5 ML 튜브에 GFP - PATROL1 ^8을 들고 장대 씨.
   3. 1 ml의 70 % 에탄올 용액을 추가, 5 번 반전 잘 섞는다. 1 분 동안 둡니다.
   4. 씨앗은 튜브의 바닥에 가라 관찰한다. 깨끗한 층류 캐비닛 부드럽게 마이크로 피펫을 사용하여 70 % 에탄올을 제거하고 1 mL의 멸균 용액을 추가. 다섯 번 반전 잘 혼합하고 5 분 동안 둡니다.
   5. 씨앗을 씻으십시오. 또 클린 벤치에 무균 상태에서 작업, 부드럽게 마이크로 피펫을 사용하여 용액을 제거하고, 1 ml의를 멸균 물을 추가합니다. 이 다섯 번 반복합니다. 살균 된 종자를 2 일 동안 4 ℃에서 멸균에 저장 될 수있다.
2. 그래서0.5 % 젤란 검 화 1/2 무라 시게과 스쿡 중간 판 (PH 5.8) ⁹ 살균 씨앗 승. 외과 테이프의 두 레이어를 사용하여 접시에 뚜껑을 테이프입니다.

Results

이 비디오 기사, A에 GFP - PATROL1의 VAEM 관찰을위한 프로토콜에서 장대 떡잎 기공 복잡한 세포가 제공됩니다. 하늘 강하 실장은 A. VAEM 제제의 기포의 발생을 감소시킬 수있는 간단한 제조 방법 장대 자엽 (그림 1). 엔트리 레이저 및 / 또는 VAEM에 대한 표본의 Z-위치의 과도하게 기울 것은 분명 이미지를 제공합니다. 그렇게되면, 그것은 표면 형광 조명에 의해 판단으로 즉시 샘플 위의 위치부터 다시 시작하는 것이 좋습니다. VAEM 관찰 며칠 경험 한 결과, 이러한 점멸 도트 GFP-PATROL1의 여기에 도시 한 바와 같이, 성공적으로 일상적 VAEM 동영상을 취득 할 수 있어야한다. 도 4, A. 12 독립 법인 세포에서 GFP-185 PATROL1 도트의 체류 시간에서 제시 kymograph 분석을 이용하여 장대 자엽을 측정 하였다. 장착 밀.......

Discussion

이 비디오 기사에서는 프로토콜 모니터링 및 애기 장대의 기공 단지에 GFP - PATROL1 점의 동적 거동을 측정하기 위해 제공됩니다. 여기에 도시 된 바와 같이, VAEM 관찰 식물 세포 표면의 라이브 영상을위한 강력한 도구입니다. 고감도 EM-CCD는 VAEM 광학계에 비교적 약한 여기 레이저의 사용을 허용하기 때문에 GFP-PATROL1 모니터링 여기 사용 된 실험 조건 하에서, 비디오 캡쳐의 1 분에 사용 시료 거의 형광 광표백가 있었다. 레이저 센터링 및 각 실험의 시작하기 전에, 포커스, 성공적인 VAEM 관찰을 위해 중요하다. 사용자는 VAEM를 사용하기 전에 선택한 현미경 회사에서 전문 직원에 의해 훈련해야한다.

VAEM는 GFP - PATROL1는 세포막에 깜박이는 움직이지 점 같은 구획 동적 현지화를 가지고 있음을 알 수있다. 형광 표지 된 세포막 프로톤 펌프 AHA1 오 -1-, 공변 세포와 보조 세포 patrol1 돌연변.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
반전 현미경	Olympus	IX-73
TIRF 유닛	Olympus	IX3-RFAEVAW
TIRF 대물 렌즈	올림푸스	UAPON 100 × 오티르프	해당 없음 = 1.49
레이저 각도 제어 상자	Chuo Seiki	QT-AK
광학 펌핑 반도체 레이저	Coherent	SapphireTM LP USB 488-20 CDRH 레이저
510– 550 nm 밴드 패스 필터	Olympus	U-FBNA
EM CCD 카메라	Hamamatsu Photonics	ImagEM C9100-13
C-마운트 카메라 배율 변경 장치	Olympus	U-TVCAC
MetaMorph 소프트웨어	Molecular Devices	MetaMorph 버전 7.7.11.0
TIRF 현미경 검사 매뉴얼	Olympus	AX7385	지침: 전반사 조명 시스템(2012년 8월 24일 일본에서 인쇄)
이멀젼 오일	올림푸	이멀젼 오일 Typr-F	ne = 1.518(23도)