방법 논문

독소와 DNA 내용에 대한 공기 샘플링 필터 분석

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⸱

DOI:

10.3791/53444

⸱

2016년 3월 7일

 ,  ,  , 
1Department of Earth and Planetary Sciences, Weizmann Institute of Science, 2Multiphase Chemistry Department, Max Planck Institute

이 논문에서

요약

공기 샘플링 필터에서 대기 중 생물학적 입자에 대한 두 가지 상호 보완적인 분석, 즉 내독소 및 DNA의 추출 및 검출에 대해 설명합니다.

초록

야외 에어로졸 연구는 일반적으로 필터에 샘플링 된 입자상 물질을 사용합니다. 이 절차는 수집 된 입자의 다양한 특성 분석이 병렬로 수행 될 수있다. 여기에 제시된 방법의 목적은 필터로부터 추출한 생체 에어로졸 독소 및 DNA 콘텐츠 매우 정확하고 신뢰성있는 분석을 얻을 수있다. 샘플링 필터와 리포 폴리 사카 라이드와 같은 고 분자량의 유기 분자의 추출은 발열원이없는 수성 매질에서 샘플을 진동하는 것을 포함한다. 후속 분석을 혼탁도 측정을 이용하여 검출 할 수 효소 반응에 기초한다. 샘플링 필터에 대한 높은 유기 함량의 결과로서, 샘플의 DNA의 추출은 원래의 토양에 대한 설계 DNA 수율을 개선하기 위해 수정 된 상업적인 DNA 추출 키트를 사용하여 수행된다. 검출 및 정량 중합 효소 연쇄를 Reacti를 이용하여 특정 종의 미생물 정량(Q-PCR) 분석 기술 및 사용 가능한 다른 방법과 비교된다.

서론

필터에 공기 샘플링 대기 에어로졸 연구에서 기본적인 도구이다. 한 샘플링 필터는 다양한 화학적, 물리적, 및 수집 된 주변 입자의 생물학적 특성화를위한 시작점이다. 2-11이 방법의 장점은 여러 가지 분석 될 수 있다는 동일한 샘플에 오프라인으로 수행. 연구원을 모든 다른 분석에서 데이터를 가능하게 컴파일하면 대기 과학 분야의 복잡한 문제 해결에 수집 된 입자와 보조기구의 특성을 잘 이해를 얻을. 12, 13 예를 들어, 해양 및 내륙 공기 샘플은 같은 기간 동안 촬영 기간이 연구 샘플링 입자 독성 생물 조성물. (14)에 대해 비교 될 수 있으며, 리포 폴리 사카 라이드 (LPS), 또한 내 독소라고도 그람 음성 박테리아 세포 벽의 성분은 육상과 샘플링 필터로부터 추출 된 내륙 사이트 및 사용하여 평가 하였다물러 amebocyte 용 해물 (LAL) 테스트. 병행하여, 박테리아 게놈 콘텐츠 평가 (총 세균, 그램 네거티브 및 시아 노 박테리아) 정량 중합 효소 연쇄 반응 (Q-PCR)을 사용하여 동일한 샘플상에서 수행 하였다. LAL 시험 독소를 함유하는 수용액에, 참게, 물러의 polyphemus에서 amebocytes의 수성 추출물을 첨가 한 다음에 형성 탁도 측정에 기초한다. 샘플에서 높은 내 독소 농도는 빠른 탁도 발생한다. 15 Q-PCR 분석은 특정한 DNA 단편을 증폭으로 방출 형광 신호에 기초한다. (16) 신호의 실시간 모니터링함으로써 PCR의 지수 단계 표준 곡선과의 반응 및 교정은 초기 DNA 량을 정량 할 수있다. 이 두 가지의 조합은 다른 설명 된대로, 14 및 독소의 레벨의 양호한 추정을 제공 할 수있는 다른 사람들과 함께 분석샘플 소스 박테리아의 양.

여기에 제시된 방법의 목적은 필터로부터 추출한 생체 에어로졸 독소 및 DNA 콘텐츠 매우 정확하고 신뢰성있는 분석을 얻을 수있다. 에어로졸의 물리적 및 무기 화학 특성을 샘플링하는 방법은,보다 최근에 방법이 그 유기물 성분을 조사하기 위해 개발 된 공지되어 있지만,도 17은 에어로졸의 생물학적 성분에 부족한 연구되고있다. (18)는 현재의 근거 방법은 구체적으로, 추출 분석 및 공기 에어로졸 생물학적 부분을 식별하기위한 강력한 방법을 제공함으로써이 갭을 해결하는 것이다. (14)

여기에 설명 된 방법은 필터의 분석을 포함하는 생물학적 실내 및 실외 에어로졸 연구 프로젝트에 대폭적인 사용을 찾을 것으로 예상된다. 20-24

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프로토콜

참고 : 모든 재료와이 프로토콜에 사용되는 악기의 자세한 목록은 자료 섹션에 표시됩니다.

필터 1. 에어 샘플링

  1. 필터의 제조
    1. 높은 볼륨 샘플링의 경우, 20.3 X 25.4 cm (2) 필터를 사용합니다. 가장 연구 요구에 적합한 필터의 특정 유형뿐만 아니라, 필터 컷오프 크기가 적용되는 경우를 선택한다. (1) 여기서 사용 석영 마이크로 필터.
    2. 유기 및 생물학적 화합물 샘플링위한 사전 베이킹 필터는 유기 잔류 물을 파괴한다. - 사전 베이킹 필터, 알루미늄 호일에 개별적으로 포장 한 후 적어도 5 시간 동안 450 ° C에서 실험실로 그들을 구워합니다.
    3. 샘플링 할 때까지 -20 ° C에서 구운 필터를 저장합니다.
  2. 악기 취급 및 공기 샘플링
    1. 높은 볼륨 샘플러의 머리에서 청소 잔여 먼지. 깨끗한 종이 잎사귀와 부품을 닦고 자연 건조 사이클로 작업하기 전에에 허용샘플러에 다시 연결 다시.
    2. 에탄올로 필터 카세트를 소독, 장갑과 항상 실험실 코트와 함께 작동합니다.
    3. 클린 필터 카세트 내부에 미리 구운 필터를 배치하고 높은 볼륨 샘플러 설명서에 따라 진행합니다.
    4. 및 알루미늄 포장에 적용 (예를 들어, 비, 먼지 폭풍), 샘플링이 완료 될 때까지 깨끗한 장소에 저장하면 날짜와 비정상적인 기상 조건을 표시합니다.
    5. 샘플링 필터를 수집하고 샘플링 된면이 안쪽으로 향하도록, 반으로 접습니다.
    6. 분석 할 때까지 -20 ℃에서 원래 알루미늄 박 및 저장소 필터 감싸.
      주 : 샘플링 및 분석 간의 시간 지연이 길어 2개월 넘으면, 유기 및 생물학적 물질의 열화를 방지하기 위해 -80 ℃에서 샘플을 저장한다.

2. 독소 분석

참고 : 70 % 에탄올로 작업 표면 소독만 발열 물질이없는 튜브, 팁 및 시약 D 작동합니다. 유리를 사용하는 경우, 30 분 동안 250 ° C, 60 분 동안 200 ℃에서 예열이 요구된다. (25) 클래스 II 바이오 캐비닛 모든 시약을 준비하고 장갑 항상 실험실 코트 작업.

  1. 시약 준비
    1. 사용 직전에 해물을 재수하는 LAL 키트 제조 업체의 프로토콜을 따르십시오. (26) 탭을 부드럽게 유리 병에 병 벽에 남아있는 LAL을 제거 할 수 있습니다. 진공을 깰 조심스럽게 마개를 들어 올립니다. 니들 주사기를 사용하여, 모든 분해물 함량을 재수 거품 형성을 방지하기 위해 부드럽게 혼합 바이알에 발열 물질없는 물 (PFW) 5 mL를 추가한다.
    2. 플라스틱 파라핀 필름과 유리 병을 밀봉하지 않을 때까지 이틀 동안 4 ° C에서 사용 및 저장에. 최대 세 달 동안 -20 ° C에서 남아있는 해물을 저장합니다.
      참고 :이 시약은 한 번만 고정 할 수 있습니다.
    3. 0.5 μ를 포함하는 제어 표준 독소 (CSE)를, 재수; g E. 콜라이, 제조자의 프로토콜에 따라.도 27은 웹 사이트에 지정된 키트 로트 번호를 입력하여 제조사의 웹 사이트 (28)로부터 CSE 바이알에 첨가되는 물의 양을 결정 특정. E.의 최종 농도 (EU 여기서, (10) 유럽 연합 (EU) = 1 NG) 대장균은 유리 병에, 독소 단위로 측정된다. 이 유리 병 Ed0 레이블.
    4. 플라스틱 파라핀 필름 CSE 유리 병을 밀봉하지 않을 경우 최대 4 주 동안 4 ° C에서 사용 및 저장에.
  2. 표준 곡선과 아군 필터 제조
    1. 표에 나타낸 바와 같이 클래스 II 바이오 캐비닛, 중복 독소 희석 시리즈를 제조 CSE (튜브 ED1-Ed11) 또는 아니오 CSE (빈 튜브 만 PFW 함유)의 저하 량을 함유하는 22 발열원이없는 2 ml의 원심 분리 튜브를 준비 1.
    2. 원형 흐름 생물학적 캐비닛에, 소독 1.1을 사용하여 깨끗하고 사전 구운 필터 (22) 원​​형 조각을 잘라 2cm 직경 코르크 구멍 뚫는.
    3. 멸균 배양 접시에 필터 쌍을 배치합니다.
    4. 필터의 대응하는 쌍에 독소 희석 시리즈 Edc에-Ed11의 각 멤버로부터 빈 튜브에서 50 μl의 스파이크.
    5. 30 분 동안 건조 후드 오픈 스파이크 필터를 포함하는 배양 접시를 남겨주세요.
    6. 발열이없는 2 ML 튜브에 각각의 필터 조각을 놓습니다.
튜브 최종 독소 농도 (EU ml의 1) 표준 독소의 양 (㎖) 발열 무료 물의 양 (㎖) 총 부피 (㎖)
Ed0 2,500 원액 * (5)
ED1 1,000 80 (Ed0에서) (120) (200)
ED2 (100) 20 (ED1에서) (180) (200)
ED3 (50) 10 (ED1에서) (190) (200)
ED4 (25) 5 (ED1에서) 195 (200)
Ed5 12.5 2.5 (ED1에서) 197.5 (200)
Ed6 6.25 1.25 (ED1에서) 198.75 (200)
Ed7 3.125 6.25 (Edc에에서) 193.75 (200)
Ed8 1.563 6.25 (ED3에서) 193.75 (200)
Ed9 0.781 6.25 (ED4에서) 193.75 (200)
Ed10 0.391 6.25 (Ed5에서) 193.75 (200)
Ed11 0.195 6.25 (Ed6에서) 193.75 (200)
공백 0 0 (200) (200)
* 제조업체의 지침에 따라 원액을 준비합니다.
">

표 1. 엔도톡신 표준 곡선 엔도톡신 농도는 표준 독소 및 발열원이없는 물 부피 추가되는, 얻어진 총 부피는 검량선의 각 희석 튜브에 대한 상세이다.

  1. 실험과 아군 필터에서 독소 추출
    1. 원형 흐름 생물학적 캐비닛 무 발열원 2 (단계 2.2)에서 아군 표준 필터와 함께 소독 1.12 cm 직경 코르크 송곳을 사용하여, 그 배치의 원형 조각으로한다 (단계 1.2) 샘플 필터를 잘라 ml의 튜브 (즉, 샘플 튜브).
    2. 튜브에 1 ㎖의 PFW 추가 검사실 쉐이커를 사용하여 실온에서 60 분 동안을 흔들어.
    3. 10 분 동안 375 XG에의 microcentrifuge에서 샘플 튜브를 원심 분리기. (29)
    4. 전송 일새로운 발열원이없는 2 ml의 튜브에, 독소가 포함 E 상등액.
  2. 물러 Amebocyte 해물 (LAL) 테스트
    1. 평평한 바닥 뚜껑 무 발열원 96 웰 마이크로 플레이트에 LAL 시험을 행하여 시료 엔도톡신 농도를 결정한다.
    2. 도 1에 도시 된 바와 같이. 미리 플레이트 배열을 계획마다 실행 플레이트 (100-0.195 EU / ㎖ (2.2 절 참조)의 농도 범위를 포함하므로) 엔도톡신 표준액 Edc에-Ed11로부터 직접 제조 된 표준 곡선을 포함 . 표준 곡선은 우물 행의 1-10과 판의 B를 차지한다. 빈 샘플이 행에 우물 11 ~ 12를 따로 설정 (네 공백 총을).
    3. 마이크로 플레이트 리더를 켜고 37 ° C에서 마이크로의 배양을 포함하는 405 nm에서 흡수 측정 한 다음 5 분마다 진동 운동 반응을 프로그래밍합니다. 1.5 시간 동안 18 번 반복합니다.
    4. efficien를 결정CY가있는 독소를 샘플 필터로부터 추출된다 (예., 아군 표준 필터에서 얻어진 샘플) 원래 양만큼 계산 독소 량이 분할 비아 아군.
    5. 또는 아군 필터 추출물 (2.3 절)에서 그 공백의 (단계 2.4.2에서) 표준 독소 솔루션의 50 μl를 배치하여 분석을 시작하거나 실험 샘플 (또한 2.3 절에서) 그 공백, 커버 계획 판 배열 (그림 1) 당 닫있다.
    6. 각각의 잘, 빨리 LAL 용액 50 μl를 추가하고이 판독기에 올려 전에 테이블에 배치하는 동안 부드럽게 수평으로 판을 흔들어.
    7. 플레이트 판독기에서 접시를 놓고 실험 실행을 시작합니다.

figure-protocol-1
그림 1 :. 독소 배열 판 전96- 웰 마이크로 플레이트에서 독소 분석 어레이 충분한.

3. 게놈 분석

주 : DNA 추출의 경우, 70 % 에탄올로 작업 표면을 소독 만 멸균 튜브, 조언 및 시약와 함께 작동합니다. DNA의 Q-PCR 분석의 경우, 표면에 DNA-오염 제거제 작업 표면 소독. 클래스 II 생물 안전 캐비닛에 모든 시약을 준비하고 장갑과 항상 실험실 코트와 함께 작동합니다.

  1. DNA 프라이머 및 프로브의 제조
    1. DNA 추출, 어느 순서 (가수 분해 프로브 방법이 적용되는 경우) 프라이머 시판 세트 프로브 또는 프라이머 새로운 프라이머 계산 툴 설계를 사용하여 프로브를 설계하기 이전. 30
    2. 중 10 mM 트리스 - 0.1 mM의 에틸렌 디아민 산 (EDTA) (TE 버퍼) 또는 PCR 등급의 물을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 프라이머를 재수.
      참고 : 초기 PCR 프라이머 성을 용해하는 것이 좋습니다긴 시간 동안 유지 때 프라이머 저하를 방지로 낮은 EDTA (0.1 %)과 TE 버퍼 옥토퍼스. PCR 반응을 억제 할 수 EDTA의 양을 줄이기 위해 다음 희석에 대한 PCR 등급 물을 사용합니다.
    3. 분석 할 때까지 -20 ° C에서 50 μL의 분취 또는 멸균 0.5 ml의 튜브 프라이머 및 프로브 100 ㎕ 및 저장을 준비합니다.
  2. 표준 셀 농도 평가 DNA 추출에 앞서
    1. 적절한 크기 원심 튜브에 관심 미생물 종 (튜브 OD0 테이블 2A)의 표준 셀 용액을 준비한다. 작은 구멍과 피펫을 사용하여 튜브에 그것을 피펫 팅에 의해 아래로 7-10 번 세포 현탁액을 섞는다.
    2. 세포 (예를 들어 특정 진균 포자) 컬러 경우 염색 절차를 수행하지 않는다. 세포 염색이 필요한 경우, 관심있는 셀의 검출을위한 미세 적합한 염료의 세포 현탁액을 희석한다. 31
    3. 커버 슬립과 hemocytom를 청소에탄올 라 미터. 적셔과 혈구로 커버 슬립을 부착합니다.
    4. 조심스럽게 피펫 팁 커버 슬립의 가장자리를 터치하고 모세관 작용에 의해 챔버를 충전함으로써 모두 혈구 챔버에 세포 현탁액을 약 8 μL를로드. 이상 / 아래에있는 챔버를 기입하지 마십시오.
    5. 400X 배율 (눈에 객관적이고 10 배에서 40 배)에 현미경을 확인하여 세포의 수를 결정합니다. 나인 사각형 1 개 1 측정 mm의 2, 3 × 3 격자 배열을 볼 수 있습니다. 격자의 네 모서리 사각형 중 하나에 초점 현미경 (배율 이상이 사용될 수있다). 1 × 1mm 2 평방 16 작은 사각형을 포함해야합니다.
    6. 모든 사 1 × 1mm 2 모서리 사각형의 셀뿐만 아니라에서 3 × 3 격자의 중앙 광장을 계산합니다. 카운트가 너무 많거나 너무 적은 셀이있는 경우, 15 (어느 농축 또는 적절한 원래 세포 현탁액을 희석 절차를 반복50 세포) 내서 1mm 2 영역을 오버레이한다.
    7. 다음 셀에서 표준 세포 현탁액 OD0의 셀 (셀 ML-1)의 농도를 계산은 다섯 카운트 제곱 걸쳐 평균화 횟수 : 셀 카운트 용액 -1 = 평균 셀 카운트 제곱 -1 희석 팩터 10 4.
  3. DNA 추출 효율의 평가
    1. 표 2A에 따라 구 멸균 0.5 ml의 튜브를 준비합니다.
    2. 표준 셀 용액 (OD0)을 20 μL (OD1)의 총 부피를 약 10 mL를 107 세포를 포함하도록 희석 -1.
    3. OD2 - Od8와 빈 튜브, Od9 20 μl를 튜브 멸균 뉴 클레아없는 PCR 등급 물 (NFW)의 18 μl를 추가합니다.
    4. 전송로 OD1, OD2에서 세포 용액 2 μL. 피펫 부드럽게 혼합 OD3에 관 OD2에서 2 μl를 전송합니다. O에 Od8을까지 튜브를 따라 동일한 방식으로 세포를 희석 튜브 계속10 7 0 -10 셀 ML의 일련의 희석을 btain -1.
    5. 원형 흐름 생물학적 캐비닛에, 소독 1.12 cm 직경 코르크 구멍 뚫는을 사용하여, 깨끗하고, 사전에 구운 필터 (18) 원형 조각을 잘라. 멸균 배양 접시에 쌍으로 필터를 배치합니다.
    6. 각 표준 세포 농도에 해당하는 하나의 필터 쌍가되도록, 한 쌍의 필터들 각각에 Od8와 빈 튜브에서 희석 Od9 OD1 10 μL 스파이크.
    7. 후드 오픈 페트리 접시를두고 30 분 동안 그들을 건조 할 수 있습니다.
    8. 멸균 나사 상위 2 ML 튜브에 각각의 필터 조각을 놓고 3.4 절에 설명 된 절차에 따라 DNA를 추출한다.
  4. 실험과 아군 필터에서 DNA 추출
    참고 : 필터로부터 DNA 추출을 위해, 다음의 수정을 제조자의 프로토콜에 따라 토양 DNA 추출을 위해 설계된 상업용 키트를 사용한다.
    1. 각 FIL에 대한터 샘플 (OD1 - Od8)를 0.5 ml의 멸균 튜브에 산 세척 유리 구슬의 혼합물을 준비합니다. ≤106 ㎛의 직경이 425-600 ㎛ 내지 0.3 g 비드 직경 0.1 g 비드를 사용한다.
    2. 원형 흐름 생물학적 캐비닛에, 소독 1.12 cm 직경 코르크 구멍 뚫는를 사용하여 각 필터 샘플에 대한 무작위로 선택된 위치에서 세 개의 원형 조각을 절단하고 나사 상위 2 ml의 튜브에 배치합니다.
    3. 튜브에 유리 구슬 혼합물을 추가합니다.
    4. 제조사의 프로토콜에 표시된 양의 생물학적 캐비닛 각 튜브에 추출 키트와 함께 제공 세포 용해 완충액을 추가한다.
    5. 얼음 양동이를 준비하고 기계적으로 비드 비터를 사용하여 세포를 파괴.
    6. 1 분 동안 구슬을 구타 한 후 1 분 동안 얼음에 배치합니다. 다섯 번 반복합니다.
    7. 후 용해 단계에서 키트 공급 업체의 프로토콜을 진행합니다.
    8. 공급 용출 버퍼 용출 후 (10 mM 트리스 B에 포함uffer) 또는 NFW는 DNA 수율을 개선하기 위해 다시 컬럼을 통해 용출 샘플을 다시로드합니다.
      주 : DNA 추출과 동일한 날에 분석되지 않은 경우, 샘플을 분석 할 때까지 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
표준 셀 희석 시리즈의 A- 준비
튜브 최종 세포 농도 (셀 ML의 -1) 표준 세포 부피 (mL) 중 클레아 무료 물의 양 (㎖) 총 부피 (㎖)
OD0 밑단 결정계산 챔버 ocytometer
OD1 107 셀 ML의 범위로 용출한다 -1 (20)
OD2 10 -1 OD1 OD1 2 (18) (20)
OD3 10-2 OD1 OD2의 2 (18) (20)
Od4 10-3 OD1 OD3 2 (18) (20)
Od5 10-4 OD1 Od4 2 (18) (20)
Od6 10-5 OD1 Od5 2 (18) (20)
Od7 10-6 OD1 Od6 2 (18) (20)
Od8 10-7 OD1 Od7 2 (18) (20)
공백 0 0 (20) (20)
DNA 표준 곡선의 B- 준비
튜브 최종 DNA 농도 (mg의 ml의 1) 표준 DNA 양 (㎖) 클레아 무료 물의 양 (㎖) 총 부피 (㎖)
NanoDrop로 결정
DD1 10 1 밀리그램 (M1)의 범위로 용출한다 -1 (20)
DD2 10 -1 DD1 DD1 2 (18) (20)
DD3 10-2 DD1 DD2 2 (18) (20)
DD4 10-3 DD1 DD3 2 (18) (20)
DD5 10-4 DD1 DD4 2 (18) (20)
Dd6 10-5 DD1 DD5 2 (18) (20)
Dd7 10-6 DD1 Dd6 2 (18) (20)
DD8 10-7 DD1 Dd7 2 (18) (20)
공백 0 0 (20) (20)
1 "스타일 ="높이 : 21px; "> DD0

표 2. DNA 표준 곡선 표준 셀 볼륨 NFW 부피, 각 희석 튜브에 전량에 대한 구체적인 표준 미생물 세포의 일련의 희석 (A). 표준 DNA 용적 NFW 부피, 각 희석 튜브에 전량에 대한 상세한 DNA 표준 곡선 제제 (B).

  1. DNA 표준 곡선 준비
    1. 단계 3.4 실험 필터에 대해 설명한 것과 동일한 절차를 이용하여 관심있는 미생물 (DD0)의 표준 시료로부터 DNA를 추출한다.
    2. 260 nm에서의 표준 DNA 샘플 (DD0)의 DNA 농도를 측정하는 분광 광도계를 사용한다.
    3. 표 2b에 나타낸 바와 같이, DNA의 표준 곡선을 제조하는 아홉 멸균 0.5 ㎖의 튜브를 준비한다.
    4. 필요한 경우, 20 ㎕의 총 부피의 1-10 μg의 용액 -1 1 튜브 (DD1)의 농도 범위 내에서 표준 DNA 용액 DD0 희석.
    5. DD2-DD8와 빈 튜브에 20 μl를 튜브 NFW 18 μl를 추가합니다.
    6. 전송 DD2에 DD1의 표준 DNA 용액 2 μL. 피펫 부드럽게 섞어 다음 DD3에 DD2에서 2 μl를 전송합니다. 튜브 빈 튜브 containi 함께 10 0 -10 일련의 희석 -7 튜브 DD2-DD8을 달성하기 위해 함께 동일한 방법으로 DNA를 희석 계속NG 만 있을수없는 일이야.
      주 : 분석까지 -20 ° C에서 추출 당일 스토어 샘플을 분석하지 않으면.
  2. -PCR 정량 분석
    1. 따뜻하게 사전에 Q-PCR 기기에 전환합니다.
    2. 표 3에 설명 된대로 새 프로그램 파일에서 악기 운영 소프트웨어에서 실행되는 Q-PCR에 대한 세부 정보를 삽입합니다.
      참고 : 다른 장비는 각각의 열 사이클 단계에 대해 서로 다른 최적의 타이밍을 가지고있다. 이 입력은 기기의 설명서에 지정됩니다.
    3. 표면 DNA-오염 제거제와 작업 표면을 소독 만 멸균 튜브, 팁 및 시약와 함께 작동합니다.
    4. 다음 작업 벤치에 얼음 양동이를 준비합니다. 얼음 저장소의 Taq 중합 효소 믹스.
    5. 플레이트 점유 될 반응 웰의 총 수를 계산한다. 추가 반응에 대한 이론적 인 여유 (5 %)를 확인하고 reactio 합계를 계산하는 반응 부피 당 반응의 확대 개수를 곱n 개의 볼륨입니다.
    6. 있을수없는 일이야, 프라이머, 프로브, 그리고 마지막으로 Taq 중합 효소 믹스에서 시작, 반응 혼합 풀을 준비합니다. 표 4의 혼합 풀 볼륨 계산 예를 참조하십시오.
    7. 사용할 때까지 반응 어둠 속에서 혼합하고 얼음에 보관하십시오.
    8. 삼중의 Q-PCR 마이크로의 우물 내부 (음성 대조군)을 표준 DNA 샘플의 DNA, 또는 NFW 1 μl를 놓습니다.
    9. 플레이트 작업 표면에 접촉을 방지하고 청결을 유지하기 위해 접시 홀더에 있는지 확인하십시오.
    10. 물론 각각의 반응으로 혼합 풀 (표 4)의 9 μl를 추가합니다.
    11. 광학 접착 필름과 판을 덮고 모든면에서 단단히 밀봉.
    12. Q-PCR 장치에 배치하기 전에 1,000 XG에서 1 분 동안 판 버킷과 원심 분리기에 접시를 스핀 다운.
    13. 악기에 접시를 놓고 실행중인 프로그램을 활성화합니다.
매개 변수 세부 코멘트
검출 방법 양이 가수 분해 프로브
열 사이클링 조건
초기 변성 및 효소 활성화 10 분 동안 95 ° C
변성 15 초 동안 95 ° C 45 번 반복
어닐링 및 연장 60 초 동안 60 ° C
플레이트 배열
표준 곡선 DD1 - DD8 상위 3 행에서 1-8 우물에 희석 당 3 반복
비 템플릿 컨트롤 (NTC) 뉴 클레아없는 물 (NFW) 3 9의 반복 일 잘에 가기3 행.
분석 샘플 DNA 필터에서 추출 나머지 우물에서 샘플 당 3 반복.
프라이머 세트 각 웰 당
샘플 량 10 ml의

표 3 :. Q-PCR 운영 소프트웨어에 대한 자세한 분석 매개 변수의 세부 사항은 Q-PCR 프로그램 파일에 입력합니다.

시약 반응 당 양 (㎖) 반응의 수 오류에 대한 수당(5 %) 전체 볼륨 믹스 (㎖)
Taq 중합 효소 믹스 (5) (50) 52.5 262.5
F 프라이머 (10 밀리미터) 0.5 (50) 52.5 26.25
R 프라이머 (10 밀리미터) 0.5 (50) 52.5 26.25
뉴 클레아없는 물 삼 (50) 52.5 157.5
DNA - 1 ml를 96 판의 대상 우물에 직접 추가됩니다.

표 4 :. 양적-PCR 반응 혼합 계산 반응에 따라 볼륨, 반응의 수, 허용 오차, 그리고 총 계산 볼륨 시약 당 반응 혼합물에 첨가 될 상세한이다.

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결과

그것은 "오프라인"샘플링 필터를 분석을 사용하여 대기 에어로졸을 학습하는 것이 일반적이다 (도 2 참조). (32) 화학 샘플링없이 유기 (예 : 단백질, 탄화수소 분자 당) 및 무기 (예를 들어 금속 염)을 포함하는 콘텐츠 분석 . 생물학적 분석 가능한 비 생존 미생물 함량 DNA 방법 또는 현미경을 사용하여 종 식별뿐만 아니라 기반 DNA 정량을 포함한다.

figure-results-1
도 2 : 파일러 시료 분석 흐름도 공기 샘플링 (A) 후 필터...

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토론

이 작품은 필터에 수집 된 에어로졸 샘플에서 독소와 DNA의 존재를 모두 정량 추출 및 검출 방법을 설명합니다. 정확한 방법은 루틴을 필요로 한 실험자 여기서 설명한 몇몇 필수적인 중요한 점 접착 쉽게 수행 될 수있다.

독소 검출 단계, 파쇄 용액은 매우 점성과 피펫에 버블을 생성하는 경향이 있습니다. 너를 거품 제거하기 곤란하며, 이들은 마이크로 플레이트 리더 값의 변화로 이어질. 따라서, 먼저, 플레이트에만 모든 기포가 사라진 것을 확인한 뒤, 시료를 배치 분해물 용액의 첨가를 계속하는 것이 중요하다. 이 단계에서 기포 형성을 방지하는 유용한 기술 피펫 느리게 작동하고, 웰에 파쇄물을 배출 할 때 모든 방법을 눌러 아니다. 해물이 endoto에 추가되면 반응으로 즉시 시작신화는 가능한 빨리 판독을 시작하는 것이 필수적이며, 추출한다. 분해물 첨가 공정을 단축하기 위해, 멀티 채널 피펫이 사용될 수있다. 이 마이크로 킥킥 웃음 플레이트에 배치 한 후 일부 키트 프로토콜에 1...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 Weizmann Institute 화학부의 Yoav Barak 박사에게 지원과 조언을 아끼지 않은 것에 대해 감사를 표합니다. 이 연구는 이스라엘 과학 재단(보조금 # 913/12)과 미네르바 재단의 지원을 받았으며 독일 연방 교육 연구부의 자금 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Filter Sampling
HiVol 3000 - 대용량 공기 샘플러Ecotech
석영 극세사 필터Whatman1851-865203 mm x 254 mm
ELF - 실험실 챔버 용광로CarboliteELF 11series
알루미늄 호일오팔
< strong>NameCompany카탈로그 번호Comments
Endotoxin
EthanolSigma Aldrich16368 실험실 시약, 96%
Airstream Class II 생물 안전 캐비닛 AC-4E1ESCO10011712
Pyrotell -TAssociates of Cape Cod, Inc.T0051
제어 표준 Cape Cod, Inc.의내독소E0005-1대장균  O113 : H10, 0.5 &마이크로; g/바이알 1
LAL 시약 WaterAssociates of Cape Cod, Inc.W0051
Becton-Dickinson & Co.가 있는 10ml 멸균 주사기
BD Precisionglide 주사기 바늘Becton-Dickinson & Co.305129멸균 
Parafilm-M 밀봉 테이프ParafilmP7543Sigma 카탈로그 번호
MicrotubesAxigenMCT-200-C2 ml, 발열원
무료 1.12 cm 직경 Cork BorerBoekel Scientific1601 BD 시리즈 - 스틸다양한 직경의 보어를 포함하는 코르크 보어 세트의 일부입니다.
50mm 페트리 디쉬미니플라스트 아인-쉐머72050-01무균
소용돌이 지니 2 과학 산업, inc.SI-0297
마이크로 원심분리기 5415 DEppendorf22621408
TC MicroWell 96 F SI 뚜껑 포함Nunc167008Flat bottom wells (뚜껑 포함(개별 포장)), sterile, pyrogen free
Synergy HT Multi-Detection Microplate ReaderBiotek7091000
NameCompany카탈로그 번호코멘트
DNA
DNA awaySigma Aldrich7010
관심 미생물 종의 표준 DNAATCC 또는 기타 배양 수집DNA 추출에 적합한 미생물 균주 또는 추출된 DNA
Neubauer-ImprovedMarienfeld640030혈구계
TE 버퍼, Low EDTALife Technologies12090-01510 mM Tris-HCl (pH 8.0)  0.1mM EDTA 
뉴클레아제가 없는 PCR 등급 물 Sigma Aldrich3315959001
PCR 프라이머Sigma Aldrich는 관심 미생물 종을 대상으로
Dual-Labeled ProbesSigma Aldrich는 관심 미생물 종을 대상으로 합니다
스크류 캡 튜브AxigenST-200-SS2 ml 
PowerSoil DNA 추출 키트 Mo Bio Laboratories12888-100
유리 구슬, 산 세척 425-600 µ mSigma AldrichG8772-100G
유리 구슬, 산성 세척 < 106 &마이크로; mSigma AldrichG4649-100G
PowerSoil Solution C1Mo Bio Laboratories12888-100-1세포 용해 완충액, Power Soil Kit
Magic Touch 얼음 양동이Bel-Art18848-4001
Mini-Beadbeater-16BioSpec607EUR
StepOnePlus Real-Time PCR SystemApplied Biosystems4376600
Fast SYBR Green Master MixApplied Biosystems4385612
TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스Applied Biosystems4370048
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mlApplied Biosystems4346906
MicroAmp Splash-Free 96-Well BaseApplied Biosystems4312063
MicroAmp 광학 접착 필름Applied Biosystems4311971
Centrifuge 5810 REppendorf5811 000.010Rotor A-4-62 with MTP buckets 
협회팩 Luer-Lok Tip 309605 합니다. .

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