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방법 논문

마우스의 구강 투여에 따라 생균제 효모의 변환 및 위장 면역 조직에서 그들의 복구

12.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53453

⸱

2016년 2월 8일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 2Department of Biochemistry, Emory University School of Medicine

이 논문에서

요약

개발 변환 관리 및 생균제 효모 사카 boulardii에의 외래 단백질 발현을 테스트 할 수있는 기술의 통일 된 설명은 여기에 제시 하였다.

초록

재조합 경구 요법의 개발은 점막 면역 체계를 보다 직접적으로 표적으로 삼고 위장 장애와 싸우는 능력을 향상시킬 것입니다. 특히 이 접근법에 프로바이오틱 효모를 적용하면 몇 가지 이점이 있습니다. 이러한 균주는 다양한 복합 이종 단백질을 합성할 수 있는 잠재력을 가지고 있을 뿐만 아니라 장을 통과하는 동안 이러한 단백질이 생존하고 보호할 수 있습니다. 그러나 결정적으로 이 접근 방식은 일반적으로 함께 사용되지 않는 다양한 실험실 기술에 대한 전문 지식을 필요로 합니다. 또한, 효모 형질전환에 대한 개별 프로토콜은 일반적으로 사용되는 실험실 균주에 대해 잘 특성화되어 있지만, 여기서는 대체 접근법과 잘 특성화되지 않은 프로바이오틱스 균주에 대한 형질전환을 최적화하는 것의 중요성에 중점을 둡니다. 이러한 방법을 자세히 설명하면 경구용 약물 전달 매개체로서 프로바이오틱스 효모를 테스트하기 위한 최상의 접근 방식에 대한 논의를 촉진하는 데 도움이 될 것이며 실제로 위장 요법을 위한 이 새로운 전략의 개발을 촉진하는 데 도움이 될 것입니다.

서론

프로 바이오 틱 미생물을 효​​율적이고 경제적으로 위장관에 이종 단백질을 전달하는 흥미로운 잠재적 인 수단이다. 이 생물은 아직 1 식민지화하지 않는 위장관 통과 생존 제어 투약이 가능하고 약물 표현에 노출을 제한 할 수있다. 또한, 쉽게 대규모 이종 단백질을 생산하는 이들 미생물을 설계하는 능력은 그들을 합성 전달 입자 경제적 인 대안을 렌더링한다. 최근 2 boulardii에 생균제 효모 사카의 영양 요 구성 균주를 사용하여 입증하지만, 이러한 접근법의 개발은, 효모 및 분자 생물학에서 동물 처리 기술 및 면역 학적 방법에 이르기까지 전통적으로 특정 연구에서 결합되지 실험 기법에 대한 지식을 필요로한다. 본원에 기재된 각각의 방법은 그 자체로 신규 아니다 따라서 비록실험 프로토콜이 원고의 목적은 쥐 위장관에 약물 전달 비히클로서 생균제 효모 실험 테스트에 필요한 기술을 통합 도입을 제공하는 것이다. 제공에 필수적인 프로토콜의 편집이다 : 쉽게 유 전적으로 조작 할 수있는 효모의 영양 요 구성 돌연변이 균주의 1) 생성; 효모 배양 2) 변환은 이종 단백질을 발현하는 단계; 구강 투여를 통해 장에 재조합 효모의 3) 관리; 자신의 이종 단백질 발현의 쥐 소장 및 평가에서 가능한 재조합 바이오 틱 효모의 4) 복구.

다수의 양성 및 음성 선택 방법 효모 종의 조작에 존재하지만 첫째, 이러한 영양 요 구성 마커를 사용함으로써 부정적 선택 효율 효모 형질 전환 및 선택 될 수있는 용이성을 모두 증가시킨다. 공동 항생제를 사용하여 형질 전환 체의 긍정적 인 선택,ntrast 크게 효모 조작의 비용을 증가시킨다. 또한, 항생제 함유 고체 배지에 효모의 선택은 밖으로 합성 드롭 고체 배지 (게시되지 않은 관찰)에 영양 요 효모의 선택에 대해 변형되지 않은 배경 식민지의 증가 성장을 할 수 있습니다. 영양 요 구성 효모가 필수 아미노산 또는 우라실의 합성에 중요한 효소가 결여 균주이다. 효모가 필수 대사 물질이 부족 미디어 밖으로 합성 드롭에 도금 할 때 따라서 음의 선택이 가능 누락 된 대사 또는 대사 유전자로 보충하면 효모는 증가 할 수 있습니다. 많은 일반적으로 사용되는 사카로 마이 세스 세레 비지에 실험실 균주는 이미 사실 영양 요 구성 돌연변이 3입니다. 공업, 임상, 바이오 틱 및 효모 그러나, 일반적으로 필요한 모든 영양소를 합성하는 능력 prototrophic이다. 효모를보다 효율적으로 유전자 조작을 사용하려면, 영양 요 구성 유전자를 선택적으로 타겟팅 할 수 있습니다항생제없이 선택 될 수있는 균주를 생성한다. 6 - 영양 요 구성 마커 유전자의 구체적인 타겟팅 CRISPR / Cas9 4 타겟으로 최근에 상동 재조합에 의존 PCR 매개 유전자 파괴를 통해 달성 될 수있다. 또한, UV 돌연변이 유발 빠르게도 7 기술적으로 어려운 여러 플라스미드와 함께하는 형질 전환 효모 균주의 영양 요 구성 돌연변이 체를 생성 할 수 있습니다. PCR 타겟팅 및 CRISPR / Cas9 광범위 다른 설명되었지만,이 원고 한 음성 선별보다는 효모 형질 전환 체의 양성 항생제 선택할 수 영양 요 구성 균주를 제작하는 UV 돌연변이 유발 접근법을 설명하는 상세한 프로토콜 부분에 제시 하였다.

이종 단백질의 경구 전달을 위해 같은 영양 요 구성 균주의 사용에 필요한 다음 단계는 플라스미드 DNA로 형질 전환 효모이다. 찬성의 첫 번째 성공적인 변환 이후1978 사카로 마이 세스 세레 비지에 (8)에 대해보고 된 spheroplasts t는 수많은 변형 효율을 증가 효모 종은 유 전적으로 변형 될 수있는 것을 특징으로 완화되었다. S.로 DNA의 성공적인 전환을위한 전기 사용 cerevisiae를 먼저 1985 9에서 설명하고, 이후지지 삼투 셀 (10)에 1 M 소르비톨 배양 첨가를 통해 개선되었다. 전기 효율은 또한 효모 종 및 균주, 세포 수와 성장 단계, 전기 체적, 전계 강도, 및 특정 버퍼 (11)에 의존하는 것으로 나타났다. 이 특별한 장비를 필요로하지 않기 때문에 원래 이토 외. (12)에 의해 기재된 리튬 아세테이트 (LiOAc) 변환은, 가장 일반적으로 사용되는 프로토콜 사이에서 변환된다. 추가의 분석은 세포를 중간 로그 상에 수집되는 경우 LiOAc 효모 변환 효율을 크게 증가시키는 것으로 나타났다열 성장은 42 ° C에서 12 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 DNA의 존재 하에서 충격된다. PEG와 전체 그대로 효모의 배양이 가능 세포막에 DNA의 첨부 파일을 개선을 통해뿐만 아니라 막 (13)에 다른 효과를 통해, 효율적인 변환을 위해 필수적이다. 리튬 자체도 손상 전지 (14)의 투과성을 증가시킨다. 대부분의 실험실 S. 있지만 세레 비지에 균주 쉽게 LiOAc 변형 3을 이용하여 변환 될 수 있고, 다른 효모 종은 더욱 효율적으로 다른 프로토콜을 사용하여 변환 될 수있다. 피 키아 파스 토리스, 예를 들면, 가장 효율적으로 변환 오히려 LiOAc 변환 (13)보다 전기를 통한 것이다. 이것은 중요하다, 따라서, 복수의 테스트 유 전적으로지지 않은 효모 균주를 수정을 시도 할 때와 변화의 방법은 배양 기간과 시약의 농도를 최적화 할 수 있습니다. 이 원고 따라서 LiOAc 그럴 모두 설명영양 요구 돌연변이와 야생 유형 S.의 변환을위한 기술로 ansformation 및 전기 boulardii에. 관심있는 독자는 효모 변형, 다른 프로토콜 및 행동 13, 15의 가능한 메커니즘의 추가 논의의 진화의 철저한 설명은 최근 리뷰에 관한 것이다. 플라스미드가 쉽게 검출 가능한 단백질을 코딩하는 효모로 형질 전환은 적절한 발현 이종 단백질의 기능을 보장하기 위해 다운 스트림 테스트 또한 필수적이다. 무수한 다른 단백질 치료 연구의 궁극적 인 목적 및 면역, ELISA, 및 다른 기술에 의해 단백질이 검출 가능한 항체에 따라 선택 될 수있다. 이러한 기술에 대한 프로토콜은 완전히 다른 16,17 설명되었지만, 표준 곡선과 비교하여 형질 전환 효모에서 이종 단백질 생산의 수준을 결정하기 위해 사용될 수있다. 목적 데모 및 표시 할효모 생물학 매우 일반적으로 사용되는 단백질의 성공적인 제조 방법이 원고는 형광 현미경을 사용하여 연속적인 검출이 가능 플라스미드 인코딩 녹색 형광 단백질 (GFP)로 형질 전환을 제공한다.

부품 셋, 넷에 설명 된대로 이종 단백질, 적절한 관리 및 위장관 조직 내에서 이러한 미생물의 검출 인 표현 바이오 틱 미생물의 생산에 똑같이 중요. 구강 투여를 통해 재조합 효모의 관리를 직접 C57BL / 6 마우스 자연스럽게 18 구토 능력이있는에서 위,에 효모의 제어 수량의 전달을 위해 수 있습니다. 그러나, 부적절한 동물 처리 및 위관은 식도 손상 및 천공, 위 천공, 기관 관리, 흡인 성 폐렴 (19, 20)로 이어질 수 있습니다. 빈약 한 기술과 경험 부족은 또한 쥐의 면역 반응 및 실험 resu의 변동성을 증가시킬 수있다구강 투여에 21,22 동물 응력에 기인 한 LTS. 적절한 기술의 연습 따라서뿐만 아니라 동물의 불편을 감쇠 할 수 있습니다뿐만 아니라, 실험 결과의 정밀도를 높일 수 있습니다. 이 원고는 설명하고 재조합 효모의 제어 용량의 관리를 위해 동물 처리 및 구강 투여를 보여줍니다.

마지막으로, 효모 및 이종 단백질의 존재를 림프 조직을 분석하여 재조합 효모의 성공적인 전달을 확인하는 것이 중요하다. 가장 용이하고 예측 효모의 존재를 검사 할 수 위장관 면역 조직 파이어 패치이다. 파이어 패치는 점막 면역 반응의 유도 (23)의 키 사이트입니다 소장을 따라 차 림프 기관입니다. 내강에서 항원 microfold 통해 transcellularly 상피 (M) 세포를 전달하고 묶 노출 시킴 따라서 파이어 패치로 출시제시 세포 D 항원 내강 내용 장내한다. 장 상피를 가로 지르는 입자 흡수도 술잔 세포에 의해 달성 될 수 있지만, 이러한 셀은 차지 입자 직경이 24 미만 0.02 ㎛ 인 것으로 나타났다. Transepithelial 수상 돌기는 CD103 + 수지상 세포 (DC)도 25 루멘 장에서 작은 입자를 차지 연장; 그러나, CD103 + DC가 세균보다 큰 입자를 가지고 있음을 보여주는보고는 현재 존재하지 않는다. 따라서, 그대로 생균제 효모 직경 3-6 μm의 평균 크기 사이의, M 세포에 의해 용해 및 파이어 패치로 전송 될 가능성이 가장 높은. 여기에 설명 된 절차가 쉽게 바이오 틱 균의 흡수를 평가하기 위해 적응 될 수 있지만, 수집 및 생존 재조합 효모 파이어 패치 선별 프로토콜이다.

요약하면, 배달 재조합 효모 생균제 평가소장에 rapeutic 단백질은 동물의 취급 및 면역학에 분자 생물학에 걸친 실험 기술의 능력을 필요로한다. 1 여기를 제시 프로토콜) 쉽게 부정적인 항생제없이 선택할 수있는 세대 및 영양 요 효모 균주의 선별, 2) 다른 프로토콜은 효모를 변환 및 이종 단백질의 발현을 활성화, 3) 적절한 동물 처리 기술과 경구 위관의 시위 재조합 효모의 위장 납품 및 파이어 판 절제술 4) 프로토콜과 가능한 재조합 효모 및 기능 이종 단백질을 스크리닝. 결합하여, 이러한 프로토콜은 생성 및 위장관에 이종 단백질 치료제를 제공 할 수있는 생균제 효모의 테스트를 허용한다.

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프로토콜

1. UV 돌연변이 유발은 영양 요 효모 균주를 생성하는

  1. UV 조사의 필요한 투여 량을 결정하기 위해 생존 곡선을 생성
    1. 표준 절차 (26)에 따라 YPD (효모 추출물 펩톤 덱 스트로스) 미디어 및 표 1에 다른 시약을 준비하고 YPD 매체의 5 ~ 10 ml의에 단일 콜로니를 접종. 최소 8 시간 동안 포화 30 ° CO / N에서 롤러 드럼에 문화를 품어.
    2. 플라스틱 큐벳 물에 세포를 1:10 희석하여 분광 광도계를 사용하여 O / N 배양의​​ 세포 농도를 결정한다. 20 mL의 멸균 증류수에 107 세포 / ml의 농도로 세포를 희석.
    3. 뚜껑을 제거하여, UV 전구 아래의 판을 14cm를 배치, 멸균 플라스틱 페트리 접시에 희석 세포를 붓고.
    4. 각각의 증가 등 그 다음 세포 500 μl를 추출하는 일련 5,000 μJ에 세포와 UV 조사의 10,000 μJ의 용량을 노출 셀0 μJ, 5000 μJ, 10,000 μJ, 15,000 μJ, 20,000 μJ, 25,000 μJ, 30,000 μJ, 40,000 μJ, 50,000 μJ UV 조사에 노출 된 후 샘플링된다. 전송 추출 된 세포 샘플을 1.5 ml의 튜브를 멸균 및 직렬 멸균 1:10 단위로 희석한다.
    5. 1 분 동안 16,000 XG에서의 microcentrifuge에서 원심 분리하여 각 희석 세포 펠렛. 효모 세포를 도금 멸균 수에 해당하는 100 μl의 볼륨에 기음 뜨는 및에 resuspend. YPD 고체 배지를 포함하는 판 상에 재현 탁 세포의 전체 볼륨을 피펫 균등하게 각 플레이트에서 세포를 배포하는 멸균 스프레더를 사용합니다.
    6. 광 활성화 및 UV 유도 된 돌연변이의 보수를 방지하기 위해 알루미늄 포일의 미디어와 커버 플레이트의 건조를 방지하기 위해 파라 필름으로 판 가장자리를 감싸. 가능한 효모 식민지 (그림 1)의 성장을 할 수 있도록 거꾸로 30 ° C에서 2~4일에 대한 번호판을 품어.
    7. 한 접점을 계산선택적으로 계산 식민지를 표시하는 펜의 도움, 휴대용 전자 카운터 펜, 또는 카운터 식민지의 r은 확대 스탠드. UV 조사 각 μJ 도즈 도금 총 세포 비율로 플롯 조사 효모 (도 2)에 대한 생존 곡선을 생성한다.
      주 : 반수체 효모 균주는 동일한 생존율 %에 도달 이배체 균주 UV 조사에 대하여 낮은 복용량을 필요로 할 것으로 예상 할 수있다. 이러한 rad1 S. 기능성 DNA 복구 효소를 결여 효모 균주 cerevisiae의 돌연변이는 매우 낮은 용량에서 UV 조사의 존재를 표시하는 양성 대조군으로 사용할 수있다.
    8. UV 돌연변이의 용량을 결정하면 1.1.7 설립 생존 곡선을 참조하여 검사에 사용할 수있다. 예 50과 동일 생존 곡선을 따라 점의 x 값은 효모의 50 %가 생존하는 UV 조사량이다. 이 낮은 %의 생존에 돌연변이를 선별하는 것은 될 수 있습니다특히 배체 효모에 대한 성공적 돌연변이 균주의 높은 수율,. WT S. 대한 50 %의 생존율 선량 도 2에 도시 된 바와 같이 boulardii에이 약 18,000 μJ이다.
      주 : 높은 UV 선량 관심 영양 요 구성 마커 유전자 이외의 세포질 통로 용 유전자 돌연변이의 위험이 증가하지만,이 단점은 영양 요 구성 마커 유전자의 두 복사본 돌연변이를 유도 할 필요성에 대하여 균형을 이루어야한다. 예컨대 90 % 등의 높은 생존율 %에서 선별 하나의 유전자 카피가 돌연변이되어야하는 반수성 균주에 대해서는 추가적인 돌연변이의 위험을 감소시키고 여전히 충분한 영양 요 구성 돌연변이 생성을 허용한다.
  2. 영양 요 효모 균주에 대한 UV 돌연변이 유발 및 심사
    1. 단계 1.1.1-1.1.3에 기술 된 바와 같이 효모를 준비합니다.
    2. 1.1.8 결정으로, 50 %의 생존에 해당하는 자외선 조사의 용량에 효모를 노출. WT S. 들어 boulardii에,이 용량 WA약 18,000 μJ (그림 2)로 결정이야.
    3. UV 1 ml의 볼륨이 1 분 동안 16,000 XG에서의 microcentrifuge에서 원심 분리하여 효모와 펠렛을 조사 수집합니다. 100 ㎕의 멸균 수에 대기음 뜨는 및에 resuspend 세포.
      1. 돌연변이의 선택
        1. 이러한 URA3와 같은 선택을 사용하는 경우 - 영양 요 구성 돌연변이 체를 판은 기능 URA3 효소가 부족한 세포에 대한 선택 5 플루오로 오로 산 (5-FOA)를 포함하는 미디어에 효모를 조사.
          참고 : URA3의 기능 사본을 포함하는 모든 효모 죽음 셀 선도 및 URA3 쉽게 선택할 수 있도록 독소 5- 플루오로 우라실 5-FOA를 변환 - 기능 URA3 (27)이 부족 식민지. TRP1; α-아미 노아 산 (28)를 포함하는 미디어를 사용하고 MET2 및 MET15 마커 유사 선택 방법은 LYS2 및 LYS5 가능하다; 5- 플루오안트라 닐산 (29); 각각 메틸 수은 30,31.
        2. 5 FOA를 포함하는 최소 배지에 재현 탁 세포의 100 μl를 피펫과 멸균 스프레더에 균일하게 코팅 플레이트를 사용합니다. 파라 필름에 판을 감싸고 가능한 효모 식민지의 성장을 할 수 있도록 거꾸로 30 ° C에서 2-4일에 대한 품어.
        3. YPD, 우라실에 restreaking 5-FOA 판에 나오는 모든 식민지의 표현형 - - URA3을 확인하고 5 FOA 플레이트 (그림 3). 단일 콜로니 중 일부를 수집하는 무균 이쑤시개의 팁을 사용하여 부드럽게 신선한 YPD, 우라실 걸쳐 세포 드래그 -, 5-FOA 판. 다시 거꾸로 30 ° C에서 2~4일을위한 포장 판을 품어.
          참고 : 대략 원형 성장을 제기으로 비 가능한 세포는 어떤 제기 성장 (그림 3)없이 불투명 한 얼룩으로 표시됩니다 동안 실행 가능한 식민지가 나타납니다.
      2. SCR은돌연변이의 eening
        1. 선택 방법은 사용할 수 없습니다하는 영양 요 구성 돌연변이를 생성하는 경우, 코트에게로 균등하게 판을 멸균 스프레더를 사용하여, UV의 시리얼 1시 10분 희석 멸균 물에 효모 세포를 조사 준비하고 YPD 매체에 희석을 피펫.
        2. 파라 필름에서 접시를 감싸 거꾸로 30 ° C에서 2-4일에 대한 품어. 쉽게 서로 접시 당 일반적으로 더 이상 100 정도 이상의 식민지를 구별 할 수있는 개별 식민지의 성장을 허용하는 희석을 결정합니다.
        3. 이 결정된 희석 1.2.1-1.2.3 접시 세포에 기재된 효모 샘플 반복 UV 돌연변이. , YPD 매체 상에 희석 효모를 피펫 세포를 배포하는 멸균 스프레더를 사용하고, 거꾸로 30 ° C에서 2~4일을위한 포장 판을 품어.
        4. 관심의 대사가없는 선택적 매체에 복제 도금에 의해 영양 요구에 대한 화면입니다. 첫째, 접시 스탠드에 멸균 벨벳 패드를 고정플레이트 방향을 표시, 벨벳에 UV 조사 식민지와 함께 접시를 반전.
        5. 다음으로, 판에 벨벳에서 세포를 전송할 눌러 가볍게 벨벳에 관심있는 대사가없는 새로운 판을 반전합니다. 4 ℃에서 원판을 보관합니다. 랩 거꾸로 30 ° C에서 2-4일에 대한 새로운 판을 품어.
        6. 선택 배지 상 YPD에서 다시 스트리킹 콜로니 의해 복제 도금, 스크린 돌연변이 대안으로. 단일 식민지의 일부를 수집하고 부드럽게 신선한 YPD 판과 관심의 대사 산물이 부족한 판에 걸쳐 세포를 끌어 멸균 이쑤시개의 끝 부분을 사용합니다. 다시 거꾸로 30 ° C에서 2~4일을위한 포장 판을 품어.
          참고 : 케어는 사실 영양 요 세포의 균일 한 인구를 확인하는 하나의 식민지와 행진 밖으로 식민지 여러 번을 선택주의해야합니다.
    4. 또한 inoculat에 ​​의해 조사 된 세포의 표현형을 확인(돌연변이 - - URA3에 대한 미디어 예를 들어, 우라실)에 YPD하고 적절한 대사가없는 미디어 모두의 5 ~ 10 ml의에 하나의 식민지를 보내고. 대사의 부재 YPD 배지에서 세포의 성장을 확인할 수 있지만, 30 ° CO / N에서 롤러 드럼 상 부화.
      참고 : 고체 배지에서 성장 패턴이 명확 효모 영양 요 구성 상태를 표시해야하지만 일부 효모가 스트레스를 허용하고 고체 배지에 작은, 느린 성장 식민지를 형성하지만, 아직 액체 미디어 (게시되지 않은 관찰)에서 동일한 조건을 용납하지하는 것은 가능합니다. 액체 배양 물에 접종 따라서 충분히 UV 조사 돌연변이 성장 패턴을 확인하기 위해 수행되어야한다.
    5. 영양 요 구성 돌연변이를 확인 장기 기억, YPD 10 ㎖에 접종하여 세포 글리세롤 주식을 준비하고, 30 ℃에서 롤러 드럼 O / N에서 배양. 2,500 XG 및 흡인 미디어에서 3 분 동안 원심 분리하여 펠렛 세포. 50 %에 재현 탁 세포멸균 여과 글리세롤, -80 ° C에서 cryovial 및 저장에 전송할 수 있습니다.
      참고 : UV 돌연변이 효모가 잠재적으로 관심의 영양 요 마커 이외의 여러 유전자에 돌연변이가 포함되어 있습니다. 다른 곳에서이 기술로 검증 된 영양 요 구성 돌연변이의 사용을 계속하기 전에,이 균주는 또한, 유전자 시퀀싱 및 산도, 담즙산 스트레스에 대한 내성의 평가, 프로 바이오 틱 균주와 관련된 다른 특성을 분석해야한다. 6 - 또한 PCR 동성 또는 CRISPR의 사용 / Cas9 더 선택적 UV 돌연변이 4의 대안으로 고려되어야 영양 요 구성 마커 돌연변이 타겟팅.

2. 효모 변환

  1. 효모의 LiOAc 변환
    1. YPD 매체의 5 ~ 10 ml의에 하나의 효모 식민지를 접종하고 30 ° CO / N에서 롤러 드럼에 품어.
    2. 드 로그 상 성장을 유도하고 플라스미드 흡수 효율을 높이기분광 광도계 termine 세포 농도 플라스틱 큐벳에서 멸균 셀의 1:10 희석액을 측정한다. 신선한 따뜻한 YPD 50ml에 - (2.5 × 106 세포 / ml 약 2 × 106)과 배양 될 때까지 200rpm으로 설정 오비탈 플랫폼 진탕 기에서 세포를 배양한다 OD에 0.16-0.2 (600)를 O / N이 배양 물을 희석 약 1 × 107 세포 / ml, 일반적으로 약 4 시간에 도달한다.
      주 : 변환 효율은 플라스미드 DNA의 당 μg의 성공적 변환 효모 집락 형성 단위 (CFU)의 수의 함수로서 측정 될 수있다. 플라스미드 DNA의 μg의 당 변형 식민지에서 효율 결과를 증가. 로그 단계 성장하는 동안 효모 세포 및 수집을 계대 배양하여 변환 효율이 12 증가 하나의 요인이다.
    3. 3 분 동안 2,500 XG에서 원심 분리하여 세포 펠렛.
    4. 펠를 재현 탁하여 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 뜨는 및 전송 세포를 대기음1 ml의 멸균 물 등.
    5. 원심 분리하여 펠렛 세포의 microcentrifuge 1 분 동안 16,000 XG에서, 뜨는을 대기음 1 ml의 TE / LiOAc (트리스 EDTA LiOAc) 버퍼에 재 부유하여 세포를 씻으십시오.
    6. 2 × 109 세포 / ml의 농도로 TE / LiOAc 버퍼에 재현 탁하고 세포를 원심 분리를 반복한다.
    7. 다음의 각으로 변환 혼합물을 준비 : TE / LiOAc 버퍼에 준비 효모의 50 μL, 캐리어 DNA (10 μg의 / μL)의 5 μL 및 플라스미드 DNA (1 μg의) 1 μL. 플라스미드 DNA의 마이크로 그램은 나 증가 변환 효율 (32)에 연결되지 않을 수도 있습니다 DNA의 양의 증가로 적정 할 수있다
      참고 : 하나의 영양 요 마커가없는 돌연변이 효모 균주를 들어, 마커를 코딩하는 하나의 플라스미드는 샘플 당 변형 될 수있다. 또한, 이러한 GFP 같이 쉽게 검출 가능한 단백질을 코딩하는 플라스미드의 사용은 적절한 폴딩 및 PR 이종성 발현을 효율적으로 판정 할 수 있도록변환 이후 효모 균주에 의해 otein.
    8. 각 준비에 철저 PEG / LiOAc / TE와 소용돌이의 300 μl를 추가합니다. PEG와 손상 세포의 배양 효율적인 변환 (13)을 위해 필수적이다.
    9. 200 rpm으로 궤도 플랫폼 쉐이커에 배치 비커에의 microcentrifuge 튜브를 배치하여 교반과 함께 30 분 동안 30 ° C에서 준비를 품어.
    10. 42 ° C의 물을 욕조에 15 분 동안 각 반응과 열 충격 세포에 DMSO의 35 μl를 추가합니다. DMSO (33)의 부가적인 혜택보고 충돌이 있지만, 그대로 효모 세포의 열 충격을 크게 변환 효율 (12)을 증가시키는 것으로 나타났다.
    11. 멸균을, 2.1.5에서와 같이 원심 분리를 통해 펠렛 흡입 또는 상층 액을 피펫 팅, 1 ㎖에 재현 탁하여 세포를 씻으십시오. 조심스럽게 세포 펠렛을 깨고 아래로 피펫합니다.
      참고 : 철저하게 미디어를 사용하기 때문에 상층 액을 제거하는 것이 중요합니다적격 세포를 생성 D 효모의 성장과 콜로니 형성을 억제 할 수있다.
    12. 2.1.5에서와 같이 반복 세포 펠렛은, 뜨는을 대기음, 100 ㎕의 멸균 수에 세포를 재현 탁. 선택적 접시에 전체 볼륨을 피펫과 멸균 스프레더에 균등하게 코트 변형 효모와 함께 접시를 사용합니다.
    13. 미디어의 건조를 방지하고 형질 전환 된 효모 세포의 성장을 할 수 있도록 거꾸로 30 ° C에서 2 일 동안 배양 파라 필름에 코팅 된 판의 가장자리를 감싸. 수율이 다른 균주 (그림 4) 훨씬 낮을 수 있지만, 성공, 효율적으로 변환 및 사카로 마이 세스 세레 비지의 영양 요 구성 선택, 변환 준비 당 식민지의 높은 수를 산출한다.
    14. 짧은 기간 (일반적으로 1-3주) 거꾸로, 4 ° C에서 적용을위한 저장 효모 판. 장기 저장을 위해 1.2.5에 설명 된대로 변형 효모의 글리세롤 주식을 준비합니다.
      참고 : 또한 연구 시험 변형 CFU 플라스미드의 안정성을 결정하고 적절한 이종 단백질의 발현을 평가하기 위해 필요하다. 플라스미드의 안정성을 34, 면역 이용 철저한 설명 세포 샘플 (17)로부터 회수 된 변성 단백질을 검출하기 위해, 효소는 정상적으로 입체 단백질 16, 및 35은 다른 가능한 효모 연구에서 GFP의 사용을 절첩 검출하는 면역 분석법 (ELISA)을 연결. 도표 도 6은 형질 전환 S. 성공적 GFP 발현의 대표 화상을 도시 변형되지 않은 세포에 cerevisiae의 상대. 이러한 형광 단백질의 사용은 효율적 성공적인 이종 단백질 생산을 결정하는 하나의 수단이다.
  2. 효모의 전기
    1. YPD 매체의 5 ~ 10 ml의에 하나의 효모 식민지를 접종하고 30 ° CO / N에서 롤러 드럼에 품어.
    2. 멸균 세포의 1:10 희석액을 측정하는 분광 광도계를 사용하여 세포 농도를 결정한다. 디약 0.3의 OD 600 상응하는 100 ml의 신선한 따뜻한 YPD 미디어 류트 O / N 문화. 일반적으로, 약 1.6의 4 ~ 5 시간을 OD 600에 도달 할 때까지 200 rpm으로 궤도 플랫폼 흔드는 세트에 30 ° C의 하위 문화를 품어. 각각 100 ㎖의 하위 문화는 두 개의 변환 반응에 충분한 조건 세포를 생성합니다.
    3. 3 분 동안 2,500 XG에서 원심 분리하여 세포 펠렛. 뜨는을 대기음 50 ml의 얼음 냉 멸균 물에 재현 탁하여 세포를 씻으십시오. 세포를 펠렛 뜨는 흡입, 신선한 50 ML의 얼음 냉 멸균 물에 재현 탁하여 세척을 반복합니다.
    4. 다시 세포 펠렛 50 ml의 차가운 얼음 전기 버퍼 (1 M 소르비톨, 1 mM의 염화칼슘 2)에 재현 탁.
    5. 20 반복 2.2.3에서와 같이 스핀, 기음 뜨는 및에 resuspend 세포 ml의 0.1 M LiOAc / 10 mM의 DTT. 30 분 동안 30 ° C에서 롤러 드럼 상에 세포 현탁액을 부화. LiOAc 및 DTT 세포의 예비 배양이 상승적으로 증가전기 (36)의 효율.
    6. , 2.2.3에서와 같이 세포 펠렛 뜨는을 제거하고, 50 ml의 차가운 얼음 전기 버퍼에 재현 탁하여 씻는다. 1 ml의 최종 용적에 빙냉 전기 버퍼에 재현 탁하고 세포를 원심 분리를 반복한다.
    7. 에어컨 효모 세포, 전기 천공 큐벳 멸균 및 플라스미드 DNA : 얼음에 준비한다. 즉시 1 ML의 전기 버퍼 조절 세포의 최종 재 부유 한 후, 약 1 μg의 플라스미드 DNA의 400 μL를 조절 효모 세포를 결합하고 냉담한 0.2 μm의 전기 큐벳에 추가 할 수 있습니다. DNA의 증가 금액의 사용은 약간 변환 효율 (11)을 증가시킬 수있다. 다음 2.5 kV의 25 μF에 electroporator 세트 electroporate, 5 분 동안 얼음에 반응을 품어.
      주 : 2.1.7에서 설명 된 바와 같이, 하나의 영양 요 구성 마커를 결핍 돌연변이 효모 균주는 하나의 플라스미드 시료 당 돌연변이를 코딩하는 마커로 형질 전환 될 수있다. 또한, 사용같은 GFP로 쉽게 검출 단백질을 코딩하는 플라스미드 적절한 폴딩 및 변환 이후 이종 단백질의 발현을 효율적으로 결정 수 있습니다.
    8. YPD 1 혼합물 : 전송 한 8 ㎖ 중에 세포를 전기 천공 1 M 소르비톨 세포는 60 분 동안 30 ° C에서 롤러 드럼 상 부화 할 수있다.
    9. 펠렛 2.2.3에서와 같이 세포와 100 μl의 1에 resuspend : 1 YPD : 1 M 소르비톨. 1 M 소르비톨을 포함하는 선택적 매체로 전체 볼륨 플레이트 파라 필름에 판의 가장자리를 포장하고, 형질 전환 된 효모 세포의 성장을 할 수 있도록 거꾸로 30 ° C 2-5 일 동안 번호판을 품어.
      주 : 2.1.14과 2.2.7에 기술 된 바와 같이, 이종 단백질의 적절한 표현을 평가하는 시험 형질 전환 효모 중요합니다.

형질 전환 효모와 마우스 3. 구강 투여

  1. 실험실의 관리 및 이용에 대한 안내에 따라 모든 동물 보호 및 취급 절차를 수행imals 및 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인.
  2. 선택 배지의 5 ~ 10 ml의로 변환 영양 요 효모의 단일 콜로니를 접종하여 O / N 효모 배양을 준비합니다. 포화 될 때까지 30 ° C에서 롤러 드럼에 적어도 8 시간 동안 O / N 문화를 품어.
    주 : 4.7에 기재된 바와 같은 GFP 플라스미드로서 부호화 시험 단백질의 사용은 gavaged 효모 단백질 발현 테스트의 용이함을 허용한다.
  3. 단백질 발현의 최대 유도 및 O에서 비주류를 준비, 로그 위상 성장을 유도하는 / 2.1.2에 설명 된대로 적절한 미디어의 약 0.16-0.2 50 ㎖를 OD 600 상당에 희석하여 N 문화.
  4. 1.1.2에서와 같이 계대 배양 세포의 농도를 결정하고 / ㎖ 10 9 세포에 조정합니다. 정확도를 향상 및 샘플로드의 완화 그룹 당 몇 백 ㎕를 추가로 볼륨과 각 마우스 100 μL 용량을 준비합니다.
  5. 2,500 XG에 원심 분리하여 펠렛 세포3 분 또는 1 분 동안 16,000 XG에의 microcentrifuge있다. 멸균의 동일한 볼륨을 추가하고 부드럽게 피펫 팅 아래로 기음 뜨는 및에 resuspend 세포.
  6. 100 ㎕의 증가에 대한 거품과 설정 플런저를 제거해야되고, 1 ㎖의 멸균 주사기 및로드 효모 샘플에 적절한 게이지 위관 바늘 (15 ~ 20 g을 마우스 22 G)를 수정합니다. 위관 제어 마우스에 멸균 물을 추가로 주사기를로드 및 오염 효모의 존재를 확인합니다.
  7. 단단히 목 (그림 6A) 주위의 피부를 쥐고 집게 손가락과 엄지 손가락으로, 비 지배적 인 손을 사용 gavaged 할 수있는 마우스를 선택합니다. 상기 하부 몸체의 이동을 방지하기 위해 작은 손가락 아래 꼬리 정력. 그립이 안전 및 위관 중에 내부 조직의 손상을 방지하기 위해 머리를 이동하는 것을 금지 마우스주십시오.
    참고 :이 같은 마우스에 바늘을 잡고 위관 바늘을 삽입하는 방법까지 예측전구도 흉골의 칼 모양의 과정이다. 바늘이 길이를 삽입하면 일반적으로 위관 바늘 전구 위를 입력 할 수 있습니다.
  8. 지배적 인 손을 사용하여, 부드럽게, 입과 목의 뒤쪽의 지붕을 따라 바늘을 구부림 센터의 왼쪽에 약간 유지하여 마우스 식도에 위관 바늘을 삽입합니다. 마우스가 바늘의 전구 제비와 바늘이 3.7 (그림 6B)에서 추정 지점에 약간 더 하강 할 수 있도록 기다립니다. 어떤 저항이 위관 바늘의 삽입시 또는 언제든지 마우스를 말하다하기 시작하면 생각되면, 조심스럽게 바늘을 제거하고 다시 식도를 찾아보십시오.
  9. 마우스가 위관 바늘의 전구를 삼킨 후, 부드럽게 직접 마우스 위장에 효모 100 ㎕ (10 8 CFU)를 관리하기 위해 주사기 플런저를 우울.
    참고 : 마우스는 투여 후 18, 19 gavaged 솔루션 중 하나를 구토 할 수없는 있지만 21,37 중에 발생하는 SUP> 것이 가능하다. 적절한 위관 영양법 바늘을 삽입뿐만 아니라 용액의 부피와 점도를 조정하는 등, 역류를 제한하고 정확한 투여를 보장하는 데 도움이 될 수 있습니다.
  10. 조심스럽게 마우스 위장과 식도에서 위관 바늘을 제거하고 케이지에 마우스를 반환합니다. 마우스가 호흡 및 위관 영양 바늘이 제대로 절차를 통해 어떠한 솔루션이 흡입되지 않았 음을 삽입하도록 위관 후 일반적으로 이동되어 있는지 확인합니다.

실행 가능한 효모 식민지의 수확 쥐 파이어 패치 4. 및 절연

  1. 적절한 시간 지점 포스트 위관에서 일반적으로 4 시간, IACUC를 사용하여 희생 마우스는 방법을 승인했다. 발가락 핀치 다음과 같은 응답의 부족을 확인하고 마우스를 희생 같은 자궁 전위 등의 보조 측정을 사용합니다. 많은 연구가 최대 효율의 타이밍을 도시 한 바와 같이 추가의 시점은, 테스트 할 수있다상피에 걸쳐 수행하는 입자 (38, 39) 의존한다.
  2. 완전히 노출 된 복부와 마우스를 놓고 70 % EtOH로 분사하여 복부 지역을 소독. 내부 조직이 손상되지 않도록주의하면서 가위로 털과 피부를 통해 횡 절개를합니다. 수동으로 절개 복막, 복부 장기를 덮고있는 얇은 장막 안감을 노출 더 열 올립니다. 조심스럽게 복막을 들어 올려 장내를 노출하는 횡 절개를합니다.
  3. 조심스럽게 장간막 동맥, 지방 및 기타 조직에서 소장을 애타게 무딘 집게를 사용합니다. 대장의 시작에서, 맹장을 마우스 복부의 사분면에서의 위장에서 창자 조직의 큰 포켓 소장 노출.
  4. 1-3mm 소장을 따라 불투명 한 조직의 약 원형 패치 (그림 7)를 찾아 파이어 패치를 분리합니다. 곡선 해부 SCI​​S를 사용하여세서, 주변의 점막 고유의 것도 수집하지 않습니다 수 있도록 여백을 남​​겨 파이어 판의 돔을 절단.
    주 : 대부분의 마우스는 4-8 쉽게 볼 파이어 패치 사이에있다. 다이렉트 오버 조명 영역의 절차를 수행하면 파이어 패치가 가시화 될 수있는 용이성을 증가시킬 것이다.
  5. 전체 Iscove의 수정 둘 베코의 미디어 (IMDM)에 파이어 패치를 해부 수집합니다.
    주 : 효모 판 위장관 박테리아 오염을 방지하기 위해 수거 매체 항생제 무균 기술을 사용하여 포함하는 것이 중요하다.
  6. 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 스트레인 파이어 패치는 수집 매체를 제거합니다. 50 ML 튜브 위에 신선한 완료 IMDM 씻을 파이어 패치와 부드럽게 파이어 패치를 깨고 1 ML의 주사기에서 플런저를 사용합니다. 7 분 동안 1,800 rpm에서 원심 분리하여 변형 된 세포를 펠렛. 기음 뜨는 및에 resuspend 세포에서약 100 μL의 최종 부피.
  7. 선택적 효모 매체에 변형 된 세포를 적용하고 균일하게 세포를 배포 할 판 스프레더를 사용합니다. 파라 필름에 판 가장자리를 감싸 쥐 파이어 패치에서 발견 한 모든 가능한 효모의 성장을 할 수 있도록 거꾸로 30 ° C에서 2 일 동안 번호판을 품어.
    참고 : 파이어 '패치에서 효모의 복구 후 추가적인 연구가 변종이 면역 조직에 제대로 접혀 이종 단백질을 제공 할 수 있는지 확인하는 것이 필요하다. 2.1.14에 기술 된 바와 같이, 이러한 방법은 2,40 GFP 형광 단백질을 검출하기 위해 면역, ELISA 또는 형광 현미경을 포함 할 수있다.

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결과

UV 조사 다음 생존 곡선의 생성은 별개 집락 형성 단위 (CFU)를 형성 할 수 있도록 희석하여 효모 세포의 도금을 필요로한다. 상기와 같이 수집 된 각 500 μL 샘플을 약 5 × 106 세포를 포함 그러나, 접시 당 100보다 큰 식민지를 정확하게 구별하기가 어렵다. 희석되지 않은 샘플과 조사 셀 직렬 1시 10분 희석 따라서도 1에서 설명한 바와 같이 CFU는 각각 UV 조사량에 열거 될 수 있도록 보장 도금. CFU 카운트, 희석 배수를 곱한 다음의 총 개수로 나눈 각 투여 량 %의 생존을 결정하기 위해 각각 500 ㎕의 시료에 조사하여 원래 셀.도 2는 이배체 야생형 S.의 계산 된 백분율을 나타낸다 boulardii에 세포 0 μJ, 5000 μJ, 10,000 μJ, 15,000 μJ, 20,000 μJ, 22,500 μJ, 25,000 살아...

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토론

함께, 프로토콜은 여기에 장에 이종 치료 단백질의 전달을위한 개발과 영양 요 바이오 틱 효모 균주의 시험에 필요한 필수 단계를 설명합니다. 이 조작 및 재조합 바이오 틱 효모의 테스트는 개별 실험실은 익숙하지 않을 수있는 기술과 자원을 필요로한다. 많은 선행 연구가 여러 효모와 마우스 균주에 대해 위의 프로토콜을 설명하고 있지만 따라서, 이러한 방법은 저자의 지식이 상세한, 통합 형태로 제공되지해야합니다. 또한, 본 원고는 덜 일반적으로 사용되는 실험실 효모 균주보다 특징 바이오 틱 효모의 유전자 조작에 대한 현재의 표준화 된 프로토콜을 적응에 특히 중점을두고 있습니다. 및 변환 (2 부) (1 부에서 설명) 모두 돌연변이 유발을위한 많은 단계는 이배체의 조작, 프로 바이오 틱 효모 ISOLAT에 최적화해야에스. 이 원고는 (은) 동물 처리 (파트 3) 소장의 파이어 판 면역 조직 (파트 4)의 해부와 관련된 잠재적 인 함정에 대해 설명합니다.

많은 산업 및 임상 적 효모 대...

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공개 사항

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

저자는 트레이시 J. 어린 양에게 수여 면역학 및 면역 주사와 NIH 새로운 혁신 상 (1DP2AI112242-01)에 대한 아동 센터를 통해 자금을 인정합니다. 저자는 또한 rad1 S.의 관대 한 기여 나탈리아 P. Degtyareva 감사합니다 cerevisiae의.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
SmartSpec 3000 분광광도계BioRad170-2501세포 농도 및 효모 배양의 Osub600 측정을 위한 분광 광도계의 예
New Brunswick 롤러 드럼EppendorfM1053-4004효모 배양 배양용 롤러 드럼의 예
UV Stratalinker 2400 Stratagene400075-03Stratalinker 예
Stuart Colony Counter SC6PLUS11983044Fisher ScientificPlate 스탠드는 펜에서 압력을 감지하면 콜로니 카운트를 기록합니다
Scienceware Colony Counter F378620002Bel-Art Scienceware핸드 헬드 콜로니 카운터 펜
복제 도금 장치Fisherbrand09-718-1복제 도금 스탠드 및 패드의 예 
Velveteen사각형 Fisherbrand09-718-2
L 모양의 멸균 세포 스프레더 Fisherbrand14665230
Deoxyribonucleic acid, 연어 고환에서 단일 가닥Sigma-AldrichD7656-1ML효모 LiOAc 변환을 위한 운반체 DNA
예시 Gavage 바늘Braintree ScientificN-PK  00215-20g 마우스의 경우 제안된 바늘은 22게이지(1.25mm 볼), 1인치 길이의 직선 재사용 가능한 개바지 바늘입니다. 체중이 20  이상인 마우스의 경우; g, 20 게이지 이상의 직선 또는 곡선 간주 바늘을 사용할 수 있습니다
1 ml 멸균 슬립 팁 일회용 투베르쿨린 주사기Becton DickinsonBD 309659
Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) 톱니 모양의 팁, 넓은 그립 집게 ElectronMicroscopy Sciences77937-28해부에 필요한 둔기 집게의 예;
직선 및 곡선 해부 가위전자 현미경 과학72966-02 및 72966-03IMDM
Life 기술12440053
. . 해부에 필요한 가위의 예

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