마우스의 구강 투여에 따라 생균제 효모의 변환 및 위장 면역 조직에서 그들의 복구

요약

개발 변환 관리 및 생균제 효모 사카 boulardii에의 외래 단백질 발현을 테스트 할 수있는 기술의 통일 된 설명은 여기에 제시 하였다.

초록

재조합 경구 요법의 개발은 점막 면역 체계를 보다 직접적으로 표적으로 삼고 위장 장애와 싸우는 능력을 향상시킬 것입니다. 특히 이 접근법에 프로바이오틱 효모를 적용하면 몇 가지 이점이 있습니다. 이러한 균주는 다양한 복합 이종 단백질을 합성할 수 있는 잠재력을 가지고 있을 뿐만 아니라 장을 통과하는 동안 이러한 단백질이 생존하고 보호할 수 있습니다. 그러나 결정적으로 이 접근 방식은 일반적으로 함께 사용되지 않는 다양한 실험실 기술에 대한 전문 지식을 필요로 합니다. 또한, 효모 형질전환에 대한 개별 프로토콜은 일반적으로 사용되는 실험실 균주에 대해 잘 특성화되어 있지만, 여기서는 대체 접근법과 잘 특성화되지 않은 프로바이오틱스 균주에 대한 형질전환을 최적화하는 것의 중요성에 중점을 둡니다. 이러한 방법을 자세히 설명하면 경구용 약물 전달 매개체로서 프로바이오틱스 효모를 테스트하기 위한 최상의 접근 방식에 대한 논의를 촉진하는 데 도움이 될 것이며 실제로 위장 요법을 위한 이 새로운 전략의 개발을 촉진하는 데 도움이 될 것입니다.

서론

프로 바이오 틱 미생물을 효​​율적이고 경제적으로 위장관에 이종 단백질을 전달하는 흥미로운 잠재적 인 수단이다. 이 생물은 아직 ¹ 식민지화하지 않는 위장관 통과 생존 제어 투약이 가능하고 약물 표현에 노출을 제한 할 수있다. 또한, 쉽게 대규모 이종 단백질을 생산하는 이들 미생물을 설계하는 능력은 그들을 합성 전달 입자 경제적 인 대안을 렌더링한다. 최근 ² boulardii에 생균제 효모 사카의 영양 요 구성 균주를 사용하여 입증하지만, 이러한 접근법의 개발은, 효모 및 분자 생물학에서 동물 처리 기술 및 면역 학적 방법에 이르기까지 전통적으로 특정 연구에서 결합되지 실험 기법에 대한 지식을 필요로한다. 본원에 기재된 각각의 방법은 그 자체로 신규 아니다 따라서 비록실험 프로토콜이 원고의 목적은 쥐 위장관에 약물 전달 비히클로서 생균제 효모 실험 테스트에 필요한 기술을 통합 도입을 제공하는 것이다. 제공에 필수적인 프로토콜의 편집이다 : 쉽게 유 전적으로 조작 할 수있는 효모의 영양 요 구성 돌연변이 균주의 1) 생성; 효모 배양 2) 변환은 이종 단백질을 발현하는 단계; 구강 투여를 통해 장에 재조합 효모의 3) 관리; 자신의 이종 단백질 발현의 쥐 소장 및 평가에서 가능한 재조합 바이오 틱 효모의 4) 복구. <....

프로토콜

1. UV 돌연변이 유발은 영양 요 효모 균주를 생성하는

1. UV 조사의 필요한 투여 량을 결정하기 위해 생존 곡선을 생성
   1. 표준 절차 ^(26)에 따라 YPD (효모 추출물 펩톤 덱 스트로스) 미디어 및 표 1에 다른 시약을 준비하고 YPD 매체의 5 ~ 10 ml의에 단일 콜로니를 접종. 최소 8 시간 동안 포화 30 ° CO / N에서 롤러 드럼에 문화를 품어.
   2. 플라스틱 큐벳 물에 세포를 1:10 희석하여 분광 광도계를 사용하여 O / N 배양의​​ 세포 농도를 결정한다. 20 mL의 멸균 증류수에 ¹⁰⁷ 세포 / ml의 농도로 세포를 희석.
   3. 뚜껑을 제거하여, UV 전구 아래의 판을 14cm를 배치, 멸균 플라스틱 페트리 접시에 희석 세포를 붓고.
   4. 각각의 증가 등 그 다음 세포 500 μl를 추출하는 일련 5,000 μJ에 세포와 UV 조사의 10,000 μJ의 용량을 노출 셀0 μJ, 5000 μJ, 10,000 μJ, 15,000 μJ, 20,000 μJ, 25,000 μJ, 30,000 μJ, 40,000 μJ, 50,000 μJ UV 조사에 노출 된 후 샘플링된다. 전송 추출 된 세포 샘플을 1.5 ml의 튜브를 멸균 및 직렬 ....

결과

UV 조사 다음 생존 곡선의 생성은 별개 집락 형성 단위 (CFU)를 형성 할 수 있도록 희석하여 효모 세포의 도금을 필요로한다. 상기와 같이 수집 된 각 500 μL 샘플을 약 5 × ¹⁰⁶ 세포를 포함 그러나, 접시 당 100보다 큰 식민지를 정확하게 구별하기가 어렵다. 희석되지 않은 샘플과 조사 셀 직렬 1시 10분 희석 따라서도 1에서 설명한 바와 같이 CFU는 각각 UV 조사량에 열거 될 수 있도록 보장 도금. CFU 카운트, 희석 배수를 곱한 다음의 총 개수로 나눈 각 투여 량 %의 생존을 결정하기 위해 각각 500 ㎕의 시료에 조사하여 원래 셀.도 2는 이배체 야생형 S.의 계산 된 백분율을 나타낸다 boulardii에 세포 0 μJ, 5000 μJ, 10,000 μJ, 15,000 μJ, 20,000 μJ, 22,500 μJ, 25,000 살아.......

토론

함께, 프로토콜은 여기에 장에 이종 치료 단백질의 전달을위한 개발과 영양 요 바이오 틱 효모 균주의 시험에 필요한 필수 단계를 설명합니다. 이 조작 및 재조합 바이오 틱 효모의 테스트는 개별 실험실은 익숙하지 않을 수있는 기술과 자원을 필요로한다. 많은 선행 연구가 여러 효모와 마우스 균주에 대해 위의 프로토콜을 설명하고 있지만 따라서, 이러한 방법은 저자의 지식이 상세한, 통합 형태로 제공되지해야합니다. 또한, 본 원고는 덜 일반적으로 사용되는 실험실 효모 균주보다 특징 바이오 틱 효모의 유전자 조작에 대한 현재의 표준화 된 프로토콜을 적응에 특히 중점을두고 있습니다. 및 변환 (2 부) (1 부에서 설명) 모두 돌연변이 유발을위한 많은 단계는 이배체의 조작, 프로 바이오 틱 효모 ISOLAT에 최적화해야에스. 이 원고는 (은) 동물 처리 (파트 3) 소장의 파이어 판 면역 조직 (파트 4)의 해부와 관련된 잠재적 인 함정에 대해 설명합니다.

많은 산업 및 임상 적 효모 대.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
SmartSpec 3000 분광광도계	BioRad	170-2501	세포 농도 및 효모 배양의 Osub600 측정을 위한 분광 광도계의 예
New Brunswick 롤러 드럼	Eppendorf	M1053-4004	효모 배양 배양용 롤러 드럼의 예
UV Stratalinker 2400 Stratagene		400075-03	Stratalinker 예
Stuart Colony Counter SC6PLUS	11983044	Fisher Scientific	Plate 스탠드는 펜에서 압력을 감지하면 콜로니 카운트를 기록합니다
Scienceware Colony Counter	F378620002	Bel-Art Scienceware	핸드 헬드 콜로니 카운터 펜
복제 도금 장치	Fisherbrand	09-718-1	복제 도금 스탠드 및 패드의 예
Velveteen	사각형 Fisherbrand	09-718-2
L 모양의 멸균 세포 스프레더	Fisherbrand	14665230
Deoxyribonucleic acid, 연어 고환에서 단일 가닥	Sigma-Aldrich	D7656-1ML	효모 LiOAc 변환을 위한 운반체 DNA
예시 Gavage 바늘	Braintree Scientific	N-PK  002	15-20g 마우스의 경우 제안된 바늘은 22게이지(1.25mm 볼), 1인치 길이의 직선 재사용 가능한 개바지 바늘입니다. 체중이 20  이상인 마우스의 경우; g, 20 게이지 이상의 직선 또는 곡선 간주 바늘을 사용할 수 있습니다
1 ml 멸균 슬립 팁 일회용 투베르쿨린 주사기	Becton Dickinson	BD 309659
Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) 톱니 모양의 팁, 넓은 그립 집게 Electron	Microscopy Sciences	77937-28	해부에 필요한 둔기 집게의 예;
직선 및 곡선 해부 가위	전자 현미경 과학	72966-02 및 72966-03	IMDM
	Life 기술	12440053

. . 해부에 필요한 가위의 예