Method Article

포스트 컬럼 유도체 화 반응 흐름 고성능 액체 크로마토 그래피 컬럼을 사용하여

DOI:

10.3791/53462

⸱

April 26th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Science and Health, University of Western Sydney, 2Van′t Hoff Institute for Molecular Sciences, University of Amsterdam

In This Article

Summary

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포스트 컬럼 유도체화(PCD)를 사용하는 방법을 위한 반응 흐름 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼 사용을 위한 프로토콜이 제시됩니다.

Abstract

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포스트 컬럼 유도체화(PCD)를 사용하는 방법을 위한 반응 흐름 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼 사용을 위한 프로토콜이 제시됩니다. PCD를 최신 HPLC 시스템 및 컬럼에 적용할 때 가장 큰 어려움은 시약 혼합 및 유도체화 반응이 일어날 수 있도록 하는 대용량 반응 코일이 필요하다는 것입니다. 이 큰 포스트 컬럼 데드 볼륨(dead volume)은 띠 확장으로 이어져 관찰된 분리 효율과 실제로 감도 검출의 손실이 발생합니다. 반응 흐름 포스트 컬럼 유도체화(RF-PCD)에서 유도체화 시약은 이동상의 흐름에 대해 반응 유동 컬럼의 외부 포트 중 하나 또는 두 개로 펌핑되며, 여기서 컬럼 엔드 피팅 내에 있는 프릿 내부의 컬럼 유출물과 혼합됩니다. 이 기법은 컬럼 유출물과 유도체화 시약의 보다 효율적인 혼합을 가능하게 하며, 이는 반응 루프의 부피를 최소화하거나 완전히 제거할 수 있음을 의미합니다. RF-PCD 방법은 관찰된 분리 효율 및 신호 대 잡음비 측면에서 기존 PCD 방법보다 더 나은 성능을 발휘하는 것으로 밝혀졌습니다. RF-PCD 기술의 또 다른 장점은 중앙 포트에서 나오는 폐수를 과소 침공된 상태로 모니터링할 수 있다는 것입니다. RF-PCD는 현재 상대적으로 작은 범위의 포스트 컬럼 반응에 대해 시험되었지만, 현재로서는 RF-PCD가 기존의 하나 또는 두 개의 성분(두 시약이 동시에 추가되는 한) 포스트 컬럼 유도체화 반응에 적용할 수 없다고 제안할 이유는 없습니다.

Introduction

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포스트 컬럼 유도체 (PCD)과 결합 된 고속 액체 크로마토 그래피 (HPLC)의 분석 실험실에서 여러 문제를 해결하는 유용 강력한 도구이다. 이것은, 1,2- 가능한 검출기의 스위트 그렇지 않으면 발견 할 수있는 화합물을 검출 선택적으로 검출 및 정량 3-5의 하한을 허용하거나 표적 피검의 신호를 증가시킬 수있는 것은 피하기 위해 타깃 분석 물을 유도체 화 매트릭스 효과 6. 일반적으로 사용되는 반응은 PCD 또는 9,10 11,12 카민, 2,2- 디 페닐와 반응성 산소 종의 유도체 (ROS) 닌히 드린 오르토 phthaladehyde 7-9과 아미노산 등 아민의 반응을 포함 1 picrylhydrazil 라디칼 (DPPH •)를 13, 14 또는 2,2'- 아지노 비스 (3- ethylbenzothiazoline -6- 술폰산 (ABTS) 15, 16, 및 황 C를 유도체 화하는 요오드화 지드 시약의 사용ontaining 화합물 17, 18.

HPLC 시스템 6 PCD 반응의 사용에 대한 여러 결점 그러나있다. 주....

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Protocol

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주의 : (메탄올에 대한, 즉 MSDS)를 사용하기 전에 모든 재료 및 시약에 대한 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 용매 및 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 용리액을 처리 할 때 모든 적절한 안전 관행의 사용을 확인합니다. HPLC, 분석 균형과 검출기 장비의 공학적 통제의 적절한 사용을 보장하고, 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지와 폐쇄 발가락 신발)의 사용을 보장합니다.

참고 :이 프로토콜은 관심의 화학 물질 화합물의 특성에 특정한 다른 시약과 반응 흐름 포스트 컬럼 유도체의 3 가지 방법 (RF-PCD) 기술, 각각에 대해 설명합니다. ROS의 분석을 위해 "플루오 레스 카민을 사용하여 주 아민의 2 감지"절을 참조하십시오 차 아민의 분석을 위해, "ROS의 1 감지 DPPH • 사용"섹션으로 이동 페놀 화합물의 분석 절 "3로 이동 . 페놀류의 검출4 aminoantipyrene 및 페리 시안화 칼륨 "을 사용. 걸쳐 초순수 (예를 들어, 밀리 Q 물)를 사용합니다.

주 : RF 열 연결은 큰 차이가 RF 열에 피팅의 개수로되는 종래의 HPLC 칼럼과 거의 동일한 방식으로 달성된다. HPLC 시스템 표준 HPLC 컬럼을 연결하는 피팅은 HPLC 시스템에 RF 열을 연결하는 데 사용....

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Results

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RF-PCD에 의해 사용하기 위해 적응 된 제 PCD 방법은, 2,2- 디 페닐 -1- picrylhydrazil 라디칼 (DPPH •) (24)를 사용하여 항산화 물질의 유도체이다. 이 반응은. Koleva 등의 알 25를 도입 널리부터 사용되어왔다. 검출은 반응성 산소 종의 존재하에, DPPH 라디칼 • 탈색, 관측 흡광도 저하 항산화 결과에 따라서 존재에 의존한다. DPPH • 반응은 종종 500 μL 또는 13-15 더 큰 반응 루프를 사용하지만 그것은 RF-PCD 열을 사용하는 경우에는 반응 루프가 필요하지 않은 것으로 나타났습니다. 그림 5는 사용 유도 Ristretto 커피의 샘플의 두 크로마토 그램을 보여줍니다 기존의 PCD와 RF-PCD 계측을 모두 사용하여 DPPH 라디칼 •.

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Discussion

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RF-PCD는 밴드 넓히는 효과를 최소화하고 분리 성능을 향상 반응 코일을 사용하지 않고 폐수 HPLC 포스트 컬럼 유도체 화 시약의 효과적인 혼합을 허용한다. RF-PCD 방법은 또한 검출 방법에 대한 신호 응답의 개선을 보여 주었다. Camenzuli 등. (28)는 에스프레소 커피 샘플에서 ROS의 검출에 대한 DPPH •와 반응 흐름 컬럼의 사용을보고하는 첫번째이었다. 이들 연구는 각종 DPPH • 반응물 유속과 DPPH • 농도의 범위를 테스트하는 최대 성능을 달성하기 위해 분석 및 RF 조건의 최적화를 포함했다. 그것은 0.1 밀리그램 ml의 -1 0.5 ml를 분의 DPPH • 반응물 유량의 DPPH • 농도 -1 RF-PCD 하에서 ​​개선 된 분리 성능 (즉, 효율성과 감도)에 최적이라고 결론 지었다조건 DPPH •.......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 작업은 UWS와 ThermoFisher Scientific의 지원을 받았습니다. 저자 중 한 명(DK)은 Australian Postgraduate Award 수상을 인정합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HPLC 기기애질런트1290 시리즈 HPLC
유도체화 시스템용 추가 펌프ShimadzuLC-20A
RF 컬럼상업적
PEEK 튜빙Sigma Aldrich Z227307
컬럼 스토퍼Sigma와 함께 제공
AldrichZ290882
분석 저울4점 분석 저울
비과학적인 장비
용리액 수집 바이알바닥이 평평한 작은 바이알은 예: , HPLC 바이알
사용하는
기기에 따라 다릅니다.이동상 및 유도체화 용액용 용기Sigma AldrichZ232211
General Laboratory 유리 용기부피 플라스크, 피펫, 등 수량 및 부피는 시료 전처리 방법에 따라 다릅니다.
메탄올시그마 알드리치34860
DPPH시그마 알드리치D9132
암모늄 아세테이시그마 알드리치17836
암모니아시그마 알드리320145부식성
아세토니트릴시그마 알드리치34998
플루오레스카민시그마 알드리치F9015
4- 아미노안티피렌 Acros Organics BVBAAC103151000
페리시아나이드 칼륨 아날라B10204-30
비 컬럼 PEEK 튜브 커터 스톱워치 은 트 치

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Srijaranai, S., et al. Use of 1-(2-pyridylazo)-2-naphthol as the post column reagent for ion exchange chromatography of heavy metals in environmental samples. Microchem. J. 99, 152-158 (2011).
  2. Kubickova, A., Kubicek, V., Coufal, P.

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