Method Article

포스트 컬럼 유도체 화 반응 흐름 고성능 액체 크로마토 그래피 컬럼을 사용하여

DOI:

10.3791/53462

⸱

April 26th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Science and Health, University of Western Sydney, 2Van′t Hoff Institute for Molecular Sciences, University of Amsterdam

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

포스트 컬럼 유도체화(PCD)를 사용하는 방법을 위한 반응 흐름 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼 사용을 위한 프로토콜이 제시됩니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

포스트 컬럼 유도체화(PCD)를 사용하는 방법을 위한 반응 흐름 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼 사용을 위한 프로토콜이 제시됩니다. PCD를 최신 HPLC 시스템 및 컬럼에 적용할 때 가장 큰 어려움은 시약 혼합 및 유도체화 반응이 일어날 수 있도록 하는 대용량 반응 코일이 필요하다는 것입니다. 이 큰 포스트 컬럼 데드 볼륨(dead volume)은 띠 확장으로 이어져 관찰된 분리 효율과 실제로 감도 검출의 손실이 발생합니다. 반응 흐름 포스트 컬럼 유도체화(RF-PCD)에서 유도체화 시약은 이동상의 흐름에 대해 반응 유동 컬럼의 외부 포트 중 하나 또는 두 개로 펌핑되며, 여기서 컬럼 엔드 피팅 내에 있는 프릿 내부의 컬럼 유출물과 혼합됩니다. 이 기법은 컬럼 유출물과 유도체화 시약의 보다 효율적인 혼합을 가능하게 하며, 이는 반응 루프의 부피를 최소화하거나 완전히 제거할 수 있음을 의미합니다. RF-PCD 방법은 관찰된 분리 효율 및 신호 대 잡음비 측면에서 기존 PCD 방법보다 더 나은 성능을 발휘하는 것으로 밝혀졌습니다. RF-PCD 기술의 또 다른 장점은 중앙 포트에서 나오는 폐수를 과소 침공된 상태로 모니터링할 수 있다는 것입니다. RF-PCD는 현재 상대적으로 작은 범위의 포스트 컬럼 반응에 대해 시험되었지만, 현재로서는 RF-PCD가 기존의 하나 또는 두 개의 성분(두 시약이 동시에 추가되는 한) 포스트 컬럼 유도체화 반응에 적용할 수 없다고 제안할 이유는 없습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

포스트 컬럼 유도체 (PCD)과 결합 된 고속 액체 크로마토 그래피 (HPLC)의 분석 실험실에서 여러 문제를 해결하는 유용 강력한 도구이다. 이것은, 1,2- 가능한 검출기의 스위트 그렇지 않으면 발견 할 수있는 화합물을 검출 선택적으로 검출 및 정량 3-5의 하한을 허용하거나 표적 피검의 신호를 증가시킬 수있는 것은 피하기 위해 타깃 분석 물을 유도체 화 매트릭스 효과 6. 일반적으로 사용되는 반응은 PCD 또는 9,10 11,12 카민, 2,2- 디 페닐와 반응성 산소 종의 유도체 (ROS) 닌히 드린 오르토 phthaladehyde 7-9과 아미노산 등 아민의 반응을 포함 1 picrylhydrazil 라디칼 (DPPH •)를 13, 14 또는 2,2'- 아지노 비스 (3- ethylbenzothiazoline -6- 술폰산 (ABTS) 15, 16, 및 황 C를 유도체 화하는 요오드화 지드 시약의 사용ontaining 화합물 17, 18.

HPLC 시스템 6 PCD 반응의 사용에 대한 여러 결점 그러나있다. 주로 이들 중에서 혼합하고, 반응을 8 발생하기위한 시간을 허용하는 유도체 화 시약 (들) 및 상기 검출기의 첨가 시점 간의 반응 코일을 사용하는 것이다. 이러한 반응은 종종 HPLC 시스템 (19)의 나머지 부분의 부피에 비해 상당한 500 μL 이상의의 볼륨이 루프. 이러한 대량의 반응의 사용은 반응 루프가 존재하지 않고 관찰 될지에 비해 증가 된 피크 넓어짐 결과 루프. 이는 정량 및 검출 높은 한계가 짧고 넓은 피크 결과 부정적인 크로마토 해상도에 영향을 미친다. 1 및도 2는 다양한 후 열 반응 루프 볼륨의 추가 결과 피크 형상의 열화를 강조. 이 분석모바일 94 % 메탄올 위상 조성물 6 % 밀리 Q 물로 수행 하였다. 이동상의 유속은 1 ㎖ / 분으로하고, 주입 부피는 20 μL이었다 및 분석 파장은 265 nm였다. 20 μL 1,000 μL에서 죽은 볼륨을 변화 코일은 열 및 PCD 방법에서 반응 루프 죽은 볼륨의 효과를 시뮬레이션 할 수있는 검출기 사이에 삽입되었다. 이러한 루프는 0.5 mm 내경 스테인레스 스틸 튜브로 제조되었다. 실험은 제어기 (SCL-10AVP)로 이루어진 HPLC 시스템에서 수행하고, 저압 그라디언트 밸브 (FCL-10ALVP), 펌프 (LC-20AD), 인젝터 (SIL-10ADVP) 및 PDA 검출기 ( SPD-M10ADVP). 이동상 전에 HPLC 시스템으로 도입 탈기를 통해 펌핑 하였다. 분리는 250 mm X 4.6 mm ID가 5 μm의 컬럼을 사용하여 수행 하였다. 실험 조건은 최근 문헌에 게시 된 PCD 반응의 통상적으로 선택 하였다.

그만큼간단하게는, 일반적인 포스트 칼럼 반응기 설치 효과적으로 액체가 흐를 수 있으며, 반응이 일어날 수있는 가늘고 긴 튜브이다 비 분할 된 관형 반응기를 지칭한다. 이 시스템 피크 넓어짐은 단지 시스템에 추가 데드 볼륨뿐만 아니라, 이이 지마 등. (8)에 의해 강조된 상기 튜브의 내부 직경에 의존한다. 또한, 코일 형상이 관찰 된 브랜드의 폭이 넓어의 역할을한다. 반응기의 권취하면 불감 부피가 최소화 될 수 있다는 것을 의미 잘 혼합의 결과로, 보조 유동 프로파일을 변경하는 것을 스튜어트 20 밝혔다. 21 코일 니트 열린 관을 사용하는 경우 피크 폭이 넓어은 중요하지 않습니다 것을 주장하고있다. 피크 넓어짐이 지나치게 큰 경우, 리액터의 다른 형태는 (20, 22)를 고려할 수있다. 이 침대 원자로 또는 분할 흐름 반응기를 포함 할 수있다. 이 원자로는 달리의 requir 것 느린 반응에 특히 유용하다전자 큰 반응이 반복됩니다. 비 단편화 된 관형 반응기는 PCD의 응용 프로그램에서 사용되는 반응기의 가장 일반적인 유형의 반응기 설정이 유형의 상품이 문서의 나머지 부분은 같다.

반응 플로우 (RF) 컬럼 디자인은 이동상이 외측에 위치하는 반경 방향 중앙 열의 영역 또는 세 개의 포트에 위치한 하나의 포트 중 하나를 통해 열을 종료 (또는 입력) 할 수있는 멀티 - 포트 단부 피팅을 포함 칼럼의 벽 영역 (도 3 참조). 이 두 스트림은 열 벽 밖으로 확장하는 외부 다공성 프릿에 둘러싸여 차례에 불 침투성 링에 둘러싸여 중앙 다공성 프릿을 포함하는 최종 피팅을 사용하여 분리된다. 때문에 중앙 불 침투성 링 크로스 흐름에 두 개의 다공성 영역 사이 수 없습니다.

반응물 흐름 크로마토 동안 유도체 화 시약 (들)은 하나 또는 TW로 이동상 흐름의 방향에 대해 펌핑반응 유동 열의 외측 포트 O. 컬럼 용리액이 자유로운 외부 포트를 통해 외부 프릿의 유도체 화 시약 (들)과 혼합되어 검출기로 전달된다. 반응 흐름 중 하나의 시약 유도체 사용할 수 있습니다 또는 듀얼 시약 시스템합니다 (유도체 화 시약 2 포트와 1 포트에 연결합니다 (유도체 화 시약 1 포트, 1 포트는 검출기 1 포트 차단에 열 용출액을 전달하는) ) 검출기에 열 리제를 전달합니다. 중앙 스트림의 흐름은 어느 underivatized 칼럼 용출액 효과적으로 다중화 검출부 (23), 폐기물 전달을 검출하는데 사용될 수있다.

RF-PCD 크로마토 그래피를 실행하는 중앙 및 주변 유동의 비율이 때 사용할 하나의 주요 튜닝 방법. 각 유도체의 최적 비율은 중앙 유동 검출 또는 폐기물 전달할지 여부와 같은 요인에 달려있다. 따라서, 최적의 비율이 결정되면이를 적절한 유동 비율은 각 실행이 수행되기 전에 달성되는 것이 보장되어야한다.

또한 프릿의 사용은 컬럼 용리액 스트림 전형적 제로 데드 볼륨 T 피스 또는 낮은 데드 볼륨을 사용하는 기존의 혼합 기법에 비해 더 효율적인 믹싱 RF-PCD 결과에서 유도체 화 시약을 혼합하는 것으로 밝혀졌다 W- 작품은 두 개의 스트림을 혼합합니다. 이는 상대적으로 작은 반응 루프의 사용을 허용하거나, 완전히 반응 루프 심지어 제거 하였다. 전통적인 포스트 컬럼 유도체 화 방법에 비해 선명한 피크에서의 반응 루프의 크기 결과의 감소. 이 모든 컬럼 용리액이 유도된다는 사실에도 불구하고 대 잡음비 큰 신호가 관찰되고, 검출 및 정량 하한값 따라서 달성 할 수 있다는 것을 의미한다.

반응 유동 크로마토 그래피 PCD 반응의 적응에 어려움을 극복하기 위해 개발 된때문에 많은 양의 반응 루프 사용의 필요성으로 인한 큰 포스트 칼럼 죽은 볼륨 현대 HPLC 컬럼 및 시스템 확대 밴드에 의한 효율 특히 손실의. 종래의 PCD에 비해 RF-PCD에보다 효율적인 혼합 공정은 작은 반응 루프 볼륨 관측 분리 효율의 증가로 이어지는 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 또한 RF-PCD 크로마토 두 신호가 증가하고, 종래의 PCD 법에 비해 검출 및 정량 하한값의 결과 PCD 종래 기술에 비해 노이즈 감소이다. PCD 종래의 방법에 비해 RF-PCD의 추가적인 장점은 RF 열의 중앙 포트뿐만 아니라 칼럼의 주변부로부터 용출 유도 된 스트림으로부터 용출 underivati​​zed 스트림을 모니터링 할 수있는 능력이다. RF-PCD는 기존의 PCD의 방법에 비해 많은 장점을 표시하는 비교적 새로운하지만 유망한 기술이다.

는 RF 열 연결은 큰 차이가 RF 열에 피팅의 개수로되는 종래의 HPLC 칼럼과 거의 동일한 방식으로 달성된다. HPLC 시스템 표준 HPLC 컬럼을 연결하는 피팅은 HPLC 시스템에 RF 열을 연결하는 데 사용될 수있다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

주의 : (메탄올에 대한, 즉 MSDS)를 사용하기 전에 모든 재료 및 시약에 대한 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 용매 및 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 용리액을 처리 할 때 모든 적절한 안전 관행의 사용을 확인합니다. HPLC, 분석 균형과 검출기 장비의 공학적 통제의 적절한 사용을 보장하고, 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지와 폐쇄 발가락 신발)의 사용을 보장합니다.

참고 :이 프로토콜은 관심의 화학 물질 화합물의 특성에 특정한 다른 시약과 반응 흐름 포스트 컬럼 유도체의 3 가지 방법 (RF-PCD) 기술, 각각에 대해 설명합니다. ROS의 분석을 위해 "플루오 레스 카민을 사용하여 주 아민의 2 감지"절을 참조하십시오 차 아민의 분석을 위해, "ROS의 1 감지 DPPH • 사용"섹션으로 이동 페놀 화합물의 분석 절 "3로 이동 . 페놀류의 검출4 aminoantipyrene 및 페리 시안화 칼륨 "을 사용. 걸쳐 초순수 (예를 들어, 밀리 Q 물)를 사용합니다.

주 : RF 열 연결은 큰 차이가 RF 열에 피팅의 개수로되는 종래의 HPLC 칼럼과 거의 동일한 방식으로 달성된다. HPLC 시스템 표준 HPLC 컬럼을 연결하는 피팅은 HPLC 시스템에 RF 열을 연결하는 데 사용될 수있다.

1. ROS의 검출은 DPPH • 사용

  1. HPLC 기기의 설정
    1. 선 A 100 % 물 이동상과 같은 라인 B 100 % 메탄올 HPLC 기기를 준비한다. 제조업체의 요구 사항에 따라 펌프를 제거.
    2. HPLC를 계기 요소와도 4a에 도시 된 바와 같이 추가적인 유도체 펌프를 설정한다.
    3. 520 nm의 파장을 분석하는 UV-비스 검출기를 설정한다.
  2. 의 설정RF 열
    1. HPLC를 계기로 RF 컬럼의 입구를 연결합니다.
    2. 고주파 열 중앙 포트를 콘센트에 0.13 mm ID를 튜브의 15cm 길이를 연결합니다.
    3. 0.13 mm ID를 튜브의 15cm 길이를 사용하여 UV-마주 검출기 출구 주변 포트를 연결합니다.
    4. 상기 RF 컬럼의 출구에 주변 포트에 DPPH • 펌프 라인을 연결합니다.
    5. 열 마개를 사용하여 RF 컬럼의 출구에서 미사용 포트 주변 블록.
    6. 1 ml를 분으로 HPLC 펌프의 유량을 가져 -1 100 % B에서 행 - 100 % 메탄올.
    7. 4.6 mm의 ID × 100 mm 길이 열을 10 분 동안 100 % 메탄올을 이동상으로 열 평형. 이 시간은 사용자가 사용할 수있다 다른 컬럼의 크기에 따라 조정되어야한다.
  3. DPPH의 • 시약의 제조
    1. 메탄올 DPPH • 0.1 ㎎ / ㎖ 용액을 제조 하였다.
    2. 10 분 동안 DPPH • 시약을 함유하는 플라스크를 초음파 처리.
    3. 빛에 노출을 방지하기 위해 호일에 플라스크를 커버.
    4. 제조업체의 요구 사항에 따라 제조 된 DPPH • 시약과 DPPH • 펌프를 제거.
  4. 고주파 열 배출구 조정
    1. 정확하게이 깨끗하고 건조 선박의 무게. 하나의 중앙으로 용기 및 주변과 다른 레이블.
    2. 1.0 분 동안 중앙 표시된 용기에 중앙 포트에서 나오는 폐수를 수집합니다.
    3. 중앙 포트 용기를 다시 무게를 다음과 같이 중앙 포트로부터 유동의 무게를 구한다
      중앙 포트 선박의 초기 무게 (g) - 중앙 포트 (g)의 무게는 중앙 포트 선박 (g)의 최종 무게 =
    4. 반복 UV-VI를 RF 컬럼의 주변 포트에 연결하고, 주변 포트 용기 등을 위해 무게를 계산되어 배출되는 폐수에 대한 1.4.2와 1.4.3 단계다음과 같습니다 :
      주변 포트 선박의 초기 무게 (g) - 주변 포트 (g)의 무게는 주변 포트 선박 (g)의 최종 무게 =
    5. 다음과 같은 중추 및 말초 포트에서 나오는 유동의 비율을 계산한다 :
      % 중앙 포트 중앙 포트 (g)의 = 무게 / (중앙 포트 (g) + 주변 포트 (g)의 무게의 무게) × 100
      % 주변기기 포트 주변 포트 (g)의 = 무게 / (중앙 포트 (g) + 주변 포트 (g)의 무게의 무게) × 100
    6. 중심 흐름과 주변 유동의 분할 비를 확보하기 30:70 (말초의 중앙)이다. 중앙 흐름이 30 % 이상이면, 중앙 포트의 출구에 0.13 mm ID에 튜브의 길이를 추가하여 나오는 유동의 양을 감소시킨다. 중앙 흐름이 30 % 미만이면, 중앙 포트로부터 0.13 mm 튜브의 길이를 감소시킨다.
    7. (: 주변 중앙) 달성 30:70의 분할 비율이 될 때까지 단계를 반복 1.4.1은 1.4.6입니다.
    8. 는 D의 유량을 설정0.5 ml의 분 -1 PPH • 시약 펌프.
      참고 : DPPH의 • 시약으로 설정 한 RF 열은 이제 분석을위한 준비가되어 있습니다. 이제 샘플 주입 될 수있다.
  5. 포스트 실행 종료 조건
    1. 모든 샘플이 실행이 완료되었음을 나타내는 주입 된 후에는 유도체 화 시약 펌프 흐름을 중지합니다.
    2. 주변 포트에서 DPPH • 시약 펌프 라인을 제거하고 포트를 마개.
    3. 이 이동상은 1 ml를 분으로 컬럼을 통과 -1 10 분간 허용하여 저장하고자하는 상기 이동상과 열 평형.
    4. HPLC를 악기에 이동상 펌프의 흐름을 중지합니다.
    5. 메탄올 DPPH • 시약을 교체하고 추가 펌프를 제거.
      주 : HPLC 시스템은 이제 종료 될 수있다.

Fluoresc를 사용하여 주 아민 2. 검출아민

  1. 이동상 제조
    1. 볼륨 전에 희석 5 M 수산화 암모늄 9.0 용액의 pH를 조정 된 10 mM 아세트산 암모늄 용액의 1 L를 준비한다.
    2. 95:05 (: ACN 버퍼)의 혼합 이동상을 달성하기 위해 초산 암모늄 버퍼에 아세토 니트릴 (ACN)의 52.6 ML을 추가합니다.
  2. HPLC 기기의 설정
    1. 이동상으로서 라인 A의 미리 준비된 혼합 완충액으로 HPLC 기기를 준비한다. 제조업체의 요구 사항에 따라 펌프를 제거.
    2. HPLC를 계기 요소와도 4a에 도시 된 바와 같이 추가적인 유도체 펌프를 설정한다.
    3. 유도체 화 펌프 펄스 완충 장치 코일을 연결합니다.
    4. 셋업 형광 검출기 (FLD)를 475 내지 390 nm의 발광 파장의 여기 파장.
  3. RF 열 설정
    1. 일 연결HPLC 기기에 RF 컬럼의 전자 입구.
    2. 고주파 열 중앙 포트를 콘센트에 0.13 mm ID를 튜브의 15cm 길이를 연결합니다.
    3. 0.13 mm ID를 튜브의 15cm 길이를 사용하여 FLD 검출기로 RF 컬럼의 출구 주변 포트를 연결합니다.
    4. 상기 RF 컬럼의 출구에 주변 포트 유도체 펌프 라인을 연결합니다.
    5. 열 마개를 사용하여 RF 컬럼의 출구에서 미사용 포트 주변 블록.
    6. 1 ml를 분으로 HPLC 펌프의 유량을 가져 -1 100 %의 라인 (A)에서 - 5 % ACN으로 미리 혼합 된 10 mM 아세트산 암모늄 완충액 pH 9.
    7. 4.6 mm의 ID × 100 mm 길이 열을 10 분 동안 100 %의 A 이동상과 열을 평형. 이 시간은 사용자가 사용할 수있다 다른 컬럼의 크기에 따라 확장 할 수 있습니다.
  4. 플루오 레스 카민 시약의 제조
    1. 0.1 밀리그램 ml의 -1 플루오 레스 카민 시약을 100 ㎖를 확인합니다.
      2. <1 분 리> 초음파 처리.
    2. 빛에 노출되지 않도록 호일로 커버.
    3. 제조업체의 요구 사항에 따라 제조 된 플루오 레스 카민 시약 시약 펌프를 제거.
  5. 고주파 열 배출구 조정
    1. 정확하게이 깨끗하고 건조 선박의 무게. 하나의 중앙으로 용기 및 주변과 다른 레이블.
    2. 1.0 분 동안 중앙 표시된 용기에 중앙 포트에서 나오는 폐수를 수집합니다.
    3. 중앙 용기를 다시 무게 단계 1.4.3에서 다음과 같이 중앙 포트로부터 유동의 중량을 계산한다.
    4. 반복 RF 컬럼의 주변 포트에 연결 단계 1.4.4에서 다음과 같이 주변에 대한 가중치를 계산하는 FLD를 종료 유출 2.5.3에 2.5.2 단계를 반복합니다.
    5. 단계 1.4.5에서 다음과 같은 중추 및 말초 포트에서 나오는 유동의 비율을 계산한다.
    6. 중심 흐름과 주변 사이의 분할 비를 확보흐름은 43:57 (: 주변 중앙)입니다. 중앙 흐름이 43 % 이상이면, 중앙 포트의 출구에 0.13 mm ID에 튜브의 길이를 추가하여 나오는 유동의 양을 감소시킨다. 중앙 흐름이 43 % 미만이면, 중앙 포트로부터 0.13 mm 튜브의 길이를 감소시킨다.
    7. (: 주변 중앙) 달성 43:57의 분할 비율이 될 때까지 단계를 반복 2.5.1은 2.5.6입니다.
    8. 0.7 ml의 분까지 이동상 펌프의 유량 설정 -1.
    9. 0.1 ml를 분으로 흐르게 유도체 펌프 세트 -1.
      참고 : 플루오 레스 카민 시약으로 설정 한 RF 열은 이제 분석을위한 준비가되어 있습니다. 이제 샘플 주입 될 수있다.
  6. 포스트 실행 종료 조건
    1. 모든 샘플이 실행이 완료되었음을 나타내는 주입 된 후에는 유도체 펌프를 중지합니다.
    2. 주변 포트와 스토퍼의 유도체 펌프 라인을 제거합니다.
    3. 이동상과의 열 평형이는이 이동상은 1 ml를 분으로 컬럼을 통과 -1 10 분간 허용하여 저장한다.
    4. 이동상 펌프의 흐름을 중지합니다.
    5. 아세토 니트릴과 플루오 레스 카민 시약을 교체하고 유도체 펌프를 제거.
      주 : HPLC 시스템은 이제 종료 될 수있다.

4 Aminoantipyrene과 칼륨 페리시 아나이드를 사용하여 페놀의 3 검출

  1. 이동상 제조
    1. 볼륨 전에 희석 5 M 수산화 암모늄 9.0 용액의 pH를 조정, 100 mM의 아세트산 암모늄 용액의 1 L를 준비한다.
    2. (메탄올 버퍼) 5 : 95의 혼합 이동상을 달성하기 위해, 아세트산 암모늄 완충액, 메탄올 52.6 mL를 추가.
  2. HPLC 기기의 설정
    1. 이동상으로서 라인 A의 미리 준비된 혼합 완충액으로 HPLC 기기를 준비한다. 제조 업체에 따라 펌프를 제거 ';의 요구 사항.
    2. HPLC를 계기 부품 및도 4b에 도시 된 바와 같이 두 개의 추가 시약 펌프를 설정한다.
    3. 시약 펌프의 각 펄스 완충 장치 코일을 연결합니다.
    4. 500 nm의 파장에서 분석하는 UV-마주 검출기를 설정합니다.
  3. RF 열 설정
    1. HPLC를 계기로 RF 컬럼의 입구를 연결합니다.
    2. 고주파 열 중앙 포트를 콘센트에 0.13 mm ID를 튜브의 15cm 길이를 연결합니다.
    3. 0.13 mm ID를 튜브의 15cm 길이를 사용하여 UV-마주 검출기로 RF 컬럼의 출구 주변 포트를 연결합니다.
    4. 각 시약 (즉, 4 aminoantipyrene 및 페리 시안화 칼륨)를 RF 컬럼의 출구에 주변 포트에 펌프 라인을 연결합니다.
    5. 1 ml를 분으로 HPLC 펌프의 유량을 가져 -1 100 %의 라인 (A)에서 - 5 % 메탄올로 예비 혼합 100 mM의 아세트산 암모늄 완충액 pH 9.
    6. w 열을 평형4.6 mm의 ID × 100 mm 길이 열을 10 분 동안 100 %의 A 이동상 번째. 이 시간은 사용자가 사용할 수있다 다른 컬럼의 크기에 따라 확장 할 수 있습니다.
  4. 4-aminoantipyrene 시약의 제조
    1. 단계 3.1.1에 따라 pH가 9 암모늄 아세테이트 완충액을 준비한다.
    2. 150 mg의 4-aminoantipyrene을 달아 제조 아세트산 암모늄 완충액 (pH 9) 100ml에 녹인다.
    3. 1 분 동안 초음파 처리.
    4. 빛에 노출되지 않도록 호일로 커버.
    5. 제조업체의 요구 사항에 따라 제조 된 4 aminoantipyrene 시약 첫 번째 시약 펌프를 제거.
  5. 페리 시안화 칼륨 시약의 제조
    1. 페리 시안화 칼륨 150 mg의 무게를 측정하고, 단계 3.1.1에 따라 제조 초산 암모늄 완충액 100 ㎖ (PH 9)에 녹인다.
    2. 1 분 동안 초음파 처리.
    3. 빛에 노출되지 않도록 호일 커버.
    4. Purg제조업체의 요구 사항에 따라 제조 된 페리 시안화 칼륨 시약과 전자 두 번째 시약 펌프.
  6. RF 열 조정
    1. 정확하게이 깨끗하고 건조 선박의 무게. 하나의 중앙으로 용기 및 주변과 다른 레이블.
    2. 1.0 분 동안 중앙 표시된 용기에 중앙 포트에서 나오는 폐수를 수집합니다.
    3. 중앙 용기를 다시 무게 단계 1.4.3에서 다음과 같이 중앙 포트로부터 유동의 중량을 계산한다.
    4. 반복 UV-VI를 RF 컬럼의 주변 포트에 연결 단계 1.4.4에서 다음과 같이 주변에 대한 무게를 계산되어 배출되는 폐수에 대한 3.6.3에 3.6.2 단계를 반복합니다.
    5. 단계 1.4.5에서 다음과 같은 중추 및 말초 포트에서 나오는 유동의 비율을 계산한다.
    6. 중심 흐름과 주변 유동의 분할 비를 확보하기 50:50 (말초의 중앙)이다. 중앙 흐름이 50 % 이상인 경우, 감소중앙 출구 포트 0.13 mm ID에 튜브의 길이를 추가하여 출사 흐름 양. 중앙 흐름이 50 % 미만이면, 중앙 포트로부터 0.13 mm 튜브의 길이를 감소시킨다.
    7. (: 주변 중앙) 달성 50:50의 분할 비율이 될 때까지 단계를 반복 3.6.1은 3.6.6입니다.
    8. 0.5 ml의 분당 4 aminoantipyrene 펌프의 유량 설정 -1.
    9. 0.25 mL의 분에 페리 시안화 칼륨 펌프의 유량 설정 -1.
      참고 :이 성분 시약으로 설정 한 RF 열은 이제 분석을위한 준비가되어 있습니다. 이제 샘플 주입 될 수있다.
  7. 포스트 실행 종료 조건
    1. 모든 샘플은 실행이 완료되었음을 나타내는 완료 실행 주입되고 나면, 시약 펌프를 모두 중지합니다.
    2. 주변 포트에서 시약 펌프 라인을 제거하고 0.13 mm 튜브의 15cm 조각으로 대체.
    3. WHI의 이동상과 열 평형CH는 이동상은 1 ml를 분으로 컬럼을 통과 -1 10 분간 허용하여 저장한다.
    4. HPLC를 악기에 이동상 펌프의 흐름을 중지합니다.
    5. 대체 두 시약의 시약은 메탄올로 펌프 및 제조 요구 사항에 따라 추가 펌프를 제거.
      주 : HPLC 시스템은 이제 종료 될 수있다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RF-PCD에 의해 사용하기 위해 적응 된 제 PCD 방법은, 2,2- 디 페닐 -1- picrylhydrazil 라디칼 (DPPH •) (24)를 사용하여 항산화 물질의 유도체이다. 이 반응은. Koleva 등의 알 25를 도입 널리부터 사용되어왔다. 검출은 반응성 산소 종의 존재하에, DPPH 라디칼 • 탈색, 관측 흡광도 저하 항산화 결과에 따라서 존재에 의존한다. DPPH • 반응은 종종 500 μL 또는 13-15 더 큰 반응 루프를 사용하지만 그것은 RF-PCD 열을 사용하는 경우에는 반응 루프가 필요하지 않은 것으로 나타났습니다. 그림 5는 사용 유도 Ristretto 커피의 샘플의 두 크로마토 그램을 보여줍니다 기존의 PCD와 RF-PCD 계측을 모두 사용하여 DPPH 라디칼 •.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RF-PCD는 밴드 넓히는 효과를 최소화하고 분리 성능을 향상 반응 코일을 사용하지 않고 폐수 HPLC 포스트 컬럼 유도체 화 시약의 효과적인 혼합을 허용한다. RF-PCD 방법은 또한 검출 방법에 대한 신호 응답의 개선을 보여 주었다. Camenzuli 등. (28)는 에스프레소 커피 샘플에서 ROS의 검출에 대한 DPPH •와 반응 흐름 컬럼의 사용을보고하는 첫번째이었다. 이들 연구는 각종 DPPH • 반응물 유속과 DPPH • 농도의 범위를 테스트하는 최대 성능을 달성하기 위해 분석 및 RF 조건의 최적화를 포함했다. 그것은 0.1 밀리그램 ml의 -1 0.5 ml를 분의 DPPH • 반응물 유량의 DPPH • 농도 -1 RF-PCD 하에서 ​​개선 된 분리 성능 (즉, 효율성과 감도)에 최적이라고 결론 지었다조건 DPPH •...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 UWS와 ThermoFisher Scientific의 지원을 받았습니다. 저자 중 한 명(DK)은 Australian Postgraduate Award 수상을 인정합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HPLC 기기애질런트1290 시리즈 HPLC
유도체화 시스템용 추가 펌프ShimadzuLC-20A
RF 컬럼상업적
PEEK 튜빙Sigma Aldrich Z227307
컬럼 스토퍼Sigma와 함께 제공
AldrichZ290882
분석 저울4점 분석 저울
비과학적인 장비
용리액 수집 바이알바닥이 평평한 작은 바이알은 예: , HPLC 바이알
사용하는
기기에 따라 다릅니다.이동상 및 유도체화 용액용 용기Sigma AldrichZ232211
General Laboratory 유리 용기부피 플라스크, 피펫, 등 수량 및 부피는 시료 전처리 방법에 따라 다릅니다.
메탄올시그마 알드리치34860
DPPH시그마 알드리치D9132
암모늄 아세테이시그마 알드리치17836
암모니아시그마 알드리320145부식성
아세토니트릴시그마 알드리치34998
플루오레스카민시그마 알드리치F9015
4- 아미노안티피렌 Acros Organics BVBAAC103151000
페리시아나이드 칼륨 아날라B10204-30
비 컬럼 PEEK 튜브 커터 스톱워치 은 트 치

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Srijaranai, S., et al. Use of 1-(2-pyridylazo)-2-naphthol as the post column reagent for ion exchange chromatography of heavy metals in environmental samples. Microchem. J. 99, 152-158 (2011).
  2. Kubickova, A., Kubicek, V., Coufal, P. UV-VIS detection of amino acids in liquid chromatography: online post-column solid-state derivatization with Cu(II) ions. J Sep Sci. 34, 3131-3135 (2011).
  3. Quinto, M., Spadaccino, G., Palermo, C., Centonze, D. Determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography and post-column photochemical derivatization-fluorescence detection. J. Chromatogr. A. 1216, 8636-8641 (2009).
  4. Lee, M., Lee, Y., Soltermann, F., von Gunten, U. Analysis of N-nitrosamines and other nitro(so) compounds in water by high-performance liquid chromatography with post-column UV photolysis/Griess reaction. Water Res. 47, 4893-4903 (2013).
  5. Niu, Y., et al. Identification of isoflavonoids in Radix Puerariae for quality control using on-line high performance liquid chromatography-diode array detector-electrospray ionization-mass spectrometry coupled with post-column derivatization. Food Res Int. 48, 528-537 (2012).
  6. Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. Liquid chromatography coupled to on-line post column derivatization for the determination of organic compounds: a review on instrumentation and chemistries. Anal. Chim. Acta. 798, 1-24 (2013).
  7. Dousa, M., Brichac, J., Gibala, P., Lehnert, P. Rapid hydrophilic interaction chromatography determination of lysine in pharmaceutical preparations with fluorescence detection after postcolumn derivatization with o-phtaldialdehyde. J Pharm Biomed Anal. 54, 972-978 (2011).
  8. Iijima, S., et al. Optimization of an Online Post-Column Derivatization System for Ultra High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) and Its Applications to Analysis of Biogenic Amines. Anal Sci. 29, 539-545 (2013).
  9. Cunico, R. L., Schlabach, T. Comparison of Ninhydrin and o-Phthalaldehyde Postcolumn Detection Techniques for High Performance Liquid Chromatography of Free Amino. J. Chromatogr. A. 1983, 461-470 (1983).
  10. Donahue, E. P., Brown, L. L., Flakoll, P. J., Abumrad, N. N. Rapid Measurement of Leucine-specific Activity in Biological Fluids by Ion-exchange Chromatography and Post-column Ninhydrin Detection. J. Chromatogr. A. 571, 29-36 (1998).
  11. Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: A Reagent for Assay of Amino Acids, Peptides, Proteins and Primary Amines in the Picomole Range. Science. 1972, 871-872 (1972).
  12. Samejima, K. Separation of Fluorescamine Derivitices of Aliphatic Diamines and Polyamines by High Speed Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 96, 250-254 (1974).
  13. Zhang, Y., et al. Evaluation of antioxidant activity of ten compounds in different tea samples by means of an on-line HPLC-DPPH assay. Food Res Int. 53, 847-856 (2013).
  14. Niu, Y., et al. Identification of the anti-oxidants in Flos Chrysanthemi by HPLC-DAD-ESI/MS(n) and HPLC coupled with a post-column derivatisation system. Phytochem Anal. 24, 59-68 (2013).
  15. Raudonis, R., Bumblauskiene, L., Jakstas, V., Pukalskas, A., Janulis, V. Optimization and validation of post-column assay for screening of radical scavengers in herbal raw materials and herbal preparations. J. Chromatogr. A. 1217, 7690-7698 (2010).
  16. Raudonis, R., Raudone, L., Jakstas, V., Janulis, V. Comparative evaluation of post-column free radical scavenging and ferric reducing antioxidant power assays for screening of antioxidants in strawberries. J. Chromatogr. A. 1233, 8-15 (2012).
  17. Zakrzewski, R. Determination of Methimazole in Pharmaceutical Preparations using an HPLC Method Coupled with an Iodine-Azide Post-Column Reaction. J. Liq. Chrom. Rel. Technol. 32, 383-398 (2008).
  18. Zakrzewski, R. Development and validation of a reversed-phase HPLC method with post-column iodine-azide reaction for the determination of thioguanine. J. Anal. Chem. 64, 1235-1241 (2009).
  19. Gritti, F., Guiochon, G. Accurate measurements of the true column efficiency and of the instrument band broadening contributions in the presence of a chromatographic column. J. Chromatogr. A. 1327, 49-56 (2014).
  20. Stewart, J. T. Post cotumn derivatization methodology in high performance liquid chromatography (HPLC). Trends Anal. Chem. 1, 170-174 (1982).
  21. Rigas, P. G. Post-column labeling techniques in amino acid analysis by liquid chromatography. Anal. Bioanal. Chem. 405, 7957-7992 (2013).
  22. Frei, R. W. Reaction Detectors in Modern Liquid Chromatography. Chromatographia. 15, 161-166 (1982).
  23. Pravadil-Cekic, S., et al. Using Reaction Flow Chromatography for the Analysis of Amino Acid: Derivatisation With Fluorescamine Reagent. Microchem. J. , (Accepted Manuscript) (2015).
  24. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).
  25. Koleva, I. I., Niederlander, H. A. G., van Beek, T. A. An On-Line HPLC Method for Detection of Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures. Anal Chem. 72, 2323-2328 (2000).
  26. Selim, M., et al. A Two-component Post-column Derivatisation Method Utilsing Reaction Flow Chromatography. Microchem. J. 116, 87-91 (2014).
  27. Bigley, F. P., Grob, R. L. Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).
  28. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products. J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Post Column DerivatizationReaction Flow ColumnHigh Performance Liquid ChromatographyReaction Flow PCDConventional PCDBand BroadeningSeparation EfficiencySignal to Noise RatioUV VIS DetectorFlow Rate Optimization

Related Articles