의 발달 프로세스 추적 및 정량화 C. 엘레 오픈 소스 도구를 사용하여

Summary

여기에서는 예쁜꼬마선충의 발달 과정을 추적하고 정량화하는 방법을 보여줍니다. 제시된 방법은 쉽게 구현할 수 있는 오픈 소스 도구를 기반으로 합니다. 3D 세포 모양 모델을 재구성하는 방법, 세포 내 구조를 수동으로 추적하는 방법, 피질 수축 흐름을 분석하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

정량적으로 개발 프로세스를 캡처하는 것은 돌연변이의 표현형을 식별하고 설명하는 기계적인 모델과 키를 유도하는 것이 중요하다. 여기 프로토콜은 배아와 성인 C. 제조되게됩니다 엘레 장단기 시간 경과 현미경 동물과 발달 과정의 추적 및 정량 방법. 제시된 방법은 모든 C.에 기초 쉽게 사용되는 현미경 시스템의 독립적 실험실에서 구현 될 수 Caenorhabditis 엘레 유전학 센터에서 사용할 수 있으며 오픈 소스 소프트웨어에 간스 균주. 모델링 소프트웨어 IMO​​D를 이용하여 3 차원 셀 형상 모델의 재구성, - 형광 표지 된 세포 내 구조물 다목적 이미지 분석 프로그램 Endrov 및 PIVlab를 사용하여 피질 수축 흐름 분석을 사용하여 수동으로 추적 (시분 디지털 입자 화상 유속계 MATLAB에 대한 도구) 표시됩니다. 그것은 T 이러한 방법도 배포 할 수있는 방법을 설명합니다O를 정량적으로 소포 흐름의 추적, 추적 다른 모델, 예를 들면, 세포 추적 및 계보의 다른 발달 과정을 캡처합니다.

Introduction

형광 단백질, 유전자 공학, 광학 현미경, 컴퓨터 소프트 및 하드웨어의 지속적인 개선과 함께, 그것은 전례가없는 시공간 해상도에서 많은 모델 생물의 개발을 기록 할 수있게되었습니다. 이 연구진은 이전에 해결 될 수없는 질문을하거나 간과 측면을 검색하기 위해 알려진 개발 프로세스를 재 방문 할 수 있습니다. 이 진행은 철저한 측정 및 통계 분석에 의해 정량적 모델로 질적, 비공식적 모델 변환을 목표로 양적 발달 생물학의 분야를 촉발했다.

트래킹 셀과 세포 내 구조는 배아 발달, 신경계 활성, 또는 세포 분열 ^1-12 정량적 모델을 도출하는 것이 가능했다. C의 초기 개발 과정에서 세포 분열의 잔재를 추적하여 엘레 배아, 우리는 그들이 스테레오를 따르는 것이 밝혀 최근 수경로를 입력하고 구성하는 중요한 편광는 ^{13,14 요인.}

여기에, 프로토콜은 양적 발달 생물학 비 전문가를위한 접근에 접근 할 것을되게됩니다. 초점은 표준 공 초점 현미경과 컴퓨터에 액세스 할 수있는 모든 실험실에서 구현 가능한 세 개의 직선 앞으로 자유롭게 사용할 수있는 도구에 놓여있다. 이들....

Protocol

C. 1. 준비 엘레 배아는 시간 경과 현미경을위한 마이크로 비드를 사용하여

1. M9 버퍼의 드롭에 웜 픽 (백금선)를 사용하여 임신하는 성인 웜을 전송하고 격렬하게 교반 한 다음 이쑤시개 / 피펫 팁 상에 장착 눈 래시를 사용 M9의 인접 드롭 각 웜 전사 제에 의해 박테리아를 닦아 또는 뾰족한 유리 모세관을 사용합니다.
2. , HPO _4, 5g의 NaCl M9 버퍼 (1 L M9 버퍼 3g의 KH _2를 포함 PO _4, 6 g의 _2- 나에 20 ㎛의 직경의 폴리스티렌 비드 10 배를 함유하는 분산액을 희석하고, 오토 클레이브 (20 분, 120 ℃ 이후 C)는,) 1 M _황산 용액의 추가 1 ml에 추가 할 수 있습니다.
3. 얇은 유리 모세관의 모든 유형에서 입으로 피펫을 확인합니다 (예를 들어, 포인트 모세 혈관이나 모세 혈관 주사 바늘을 ​​당겨하는 데 사용 용융), 고무, 실리콘 또는 유사한 재료 튜브 (이상적으로 투명)의 약 0.5 m 길이의 조각, 200 μl를피펫 팁, 200 ㎕의 PCR 용 튜브의 뚜껑, 작은 주사기 소수성 필터 (예., 0.2에서 0.45 사이 μm의 공....

Results

프로토콜 2, 3, 4, 야생형 C. 생식선에서의 시간 경과 이미징을 사용하여 엘레 성인이 수행 (변형 OD58 (UNC-119 (ED3) III; ltIs38 [pAA1, 파이-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + UNC-119 (+)), 생식 세포 프로모터에서 막 마커를 발현하는 ). 생식선의 회전을 중심으로, 생식 세포의 3D 모델은 현미경 데이터 (그림 2)에서 생성됩니다. 이 모델은, 세포의 통과는 기단 아암 선단을 형성하는 동안 셀 크기의 변화를 분석 할 수 우축의 조직 및 우축 개별 세포의 접점의 크기를 보여준다 (도 HTTP 참조 : //www.wormatlas한다. 조직 / 자웅 동체 / 세균 % 20line / Germframeset.html).

다음으로, 프로토콜 1, 3, 5 C. 장기간 경과 현미경을 수행하는 데 사용되는 itIs37 [파이-1P :: mChe.......

Discussion

개발 물체 추적을 통해, 특히 핵 추적, 그것은 C. 중앙 패터닝 메커니즘을 규명 할 수 있었다 엘레은 ^1,23,24를 배아. 더 높은 처리량이 전략을 확대, 추가적인 패턴 규칙을 발견하고 패턴을 추론하는 방법을 방법은 드 노보 ⁽¹⁰⁾ 규칙을 제안 최근에 가능했습니다. 많은 돌연변이를 들어, 그러나, 정확한 패터닝 결함은 여전히​​ 알려져 있지 않다. 여기에 설명 된 방법은 자신의 해명하는 수단이 될 수있는 도구입니다. 중요한 것은, 많은 다른 모델 시스템은 다 같은 불변 개발을 수행하지 않지만 것을 최근 몇 년 동안 명백 해졌다 간스, 물체 추적 및 정량적 트래킹 데이터 분석 발달 메커니즘과 질병의 메카니즘을 식별하는 중요한 도구이다.

이 중 하나를 너무 될 경우 여기에 표시된 방법은 상황에 특히 적합하다각각 상업적 소프트웨어 툴을 구현하는 더욱 복잡한 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
실체 현미경	Motic/VWR	OT4005S	해부 및 장착을 위한 실체 현미경
,	Polysciences	18329	배아 장착
20 µ m
폴리비드 폴리스티렌 마이크로스피어,	Polysciences	876	성인 동물 장착
0.1 &마이크로; m
현미경 슬라이드	VWR	631-0902	성인 동물 장착
커버 유리 18x18 mm	VWR	631-1331	배아 / 성인 장착
커버 유리 24x60 mm	VWR	631-1339	배아 장착
메스	VWR	233-5455	배아 해부
실리콘 튜브	VWR	228-1501	구강 피펫용 튜브
30mm PTFE 멤브레인 필터	NeoLab	Jul-01	구강 피펫용 필터
모세관 튜브	VWR	621-0003	구강 피펫용 피펫 팁
Vaseline	Roth	E746.1	배아/성체 장착
Agar	Roth	5210.5	성인 동물 장착
Potassium-di-hydrogenphosphate	Roth	P018.2	M9 버퍼
디 나트륨 - 수소 인산	Roth	P030.2	M9 버퍼
염화나트륨	Roth	3957.1	M9 버퍼
VisiScope 스피닝 디스크 컨포칼 시스템	Visitron 시스템	n / a	컨포칼 현미경