모세관 튜브 및 Creamatocrit에 의한 우유 지방 함량의 평가를 사용하여 쥐의 우유 컬렉션

요약

우유는 신생아의 주요 영양 공급원입니다. 우유 성분을 분석하면 자손의 건강에 영향을 미치는 모계 요인에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 수유생쥐에서 우유 샘플을 수집하는 수동 방법을 설명하며, 이는 추가 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.

초록

우유는 갓 태어난 포유류의 유일한 영양 공급원으로서 자손의 성장과 발달에 필요한 영양소와 에너지를 제공합니다. 또한 신생아의 발달에 큰 영향을 미치는 수많은 생리 활성 화합물을 함유하고 있습니다. 우유 성분 분석은 모계 대사 및 건강을 자손의 성장 및 발달과 연결하는 핵심 요인을 밝히는 데 도움이 될 것입니다. 실험용 쥐는 모계 연구를 위한 인기 있는 모델 유기체를 대표하며, 쥐 우유는 모유 성분에 대한 다양한 모계의 생리적, 영양적, 약리학적 개입의 효과를 조사하는 데 사용할 수 있으며, 이는 자손 건강에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에서는 단일 조사자가 수행할 수 있는 수유생쥐로부터 우유를 수동으로 채취하는 간단한 방법이 설명되며, 특수 진공 또는 흡입 장비가 필요하지 않으며 후속 다운스트림 분석을 위해 충분한 우유를 제공합니다. creamatocrit로 알려진 우유 샘플 내 크림의 비율을 측정하여 우유의 지방 함량을 추정하는 방법도 제시됩니다. 이러한 방법은 궁극적으로 모자 건강에 대한 통찰력을 높이고 자손의 적절한 성장과 발달에 관여하는 모계 요인을 밝히는 데 사용될 수 있습니다.

서론

우유는 신생아 포유 동물, 유아의 성장과 발전의 ^{1, 2에} 대한 에너지와 영양분을 제공하는 영양의 유일한 원천입니다. 우유는 주로 세포, 지질, 및 단백질을 ^1로 구성되지만, 또한 효소, 탄수화물, 호르몬, 항체, 성장 인자, 사이토 카인, 엑소 좀, 마이크로 소포, 소형의 RNA 등을 포함 자손 초기 생명 현상을 조절하는 생리 활성 물질의 과다를 포함 마이크로 RNA ^{1, 2} 등. 유아 질병 ^2에 덜 민감하다 모유 증거와 결합 면역 자손과 장 건강 ^(3)의 설립에 산모 우유의 기본적인 역할은, 생애 초기에 질병 과정과 관련된 우유 성분과 관련된 분자 메커니즘을 식별의 중요성을 강조 자신의 행동에. 개발 쥐 다양한 영양, 생리 학적 효과를 조사하는 인기 모델이며, 초기에 화학 개입- 생활 개발 ^4. 쥐 우유의 분석은 따라서 산모와 자손의 건강에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 수있다.

현재 과학적 진보는 이제 건강과 질병에 대한 구체적인 우유 성분의 효과에 대한 심층적 인 연구 기회를 증가 제공합니다. 예를 들어, 우유 박테리아 프로필의 순서는 유아의 창자 ^5의 초기 장 식민지에서 자신의 역할을 규명 한, 우유 올리고당의 질량 분석 분석은 산모 다이어트 ^6, 분비 마이크로 RNA의 깊은 시퀀싱을 통해 우유 올리고당 프로파일의 변화에 대한 통찰력을 제공하고 있습니다 모유의 지방 구체는 유전자 전사, 신진 대사, 면역 기능 ^7에서 가능한 역할을 강조한다.

쥐 모델은 산모의 연구 ^8,9에서 사용되는 가장 인기있는 모델 생물 중 하나를 나타냅니다. 하나의 장점은 approximat 지속 그들의 짧은 임신 및 수유 기간입니다엘리 이십일일 각; 따라서 수유 임신 개시로부터 총 시간은 중요 데이터가 생성 될 수있는 짧은 시간을 나타낸다. 마우스에 비해 쥐의 큰 크기는 우유 컬렉션의 맥락에서, 우유 및 수집의 용이성의 부피에 대하여 상당한 이점을 제공 할 수있다; 마우스에서의 우유 생산은 예를 들어, ¹⁰ 개 우유 ^생산 무거운 쥐 전체 체중에 의존하는 것으로 보인다.

여기, 수유 쥐에서 우유의 수동 수집에 대한 일반적인 설명이 제공된다. 이 프로토콜은, 최소의 장비를 필요로 저렴 비 침습적이고, 하류의 분석을위한 충분한 양의 우유를 수집하는데 사용될 수있다. 요컨대, 댐 우유 내림 옥시토신에 의해 자극되고, 이소 플루 란으로 마취하고, 우유는 우유의 매뉴얼 식 통해 모세관 튜브로 수집한다. 마지막으로, 우유의 두 가지 주요 구성 요소로 단백질, 간단한 descriptio 지방이며,creamatocrit 측정 ⁽¹¹⁾ 및 표준 단백질 분석을 이용하여 총 단백질 농도의 정량을 사용하여 우유의 지방 함량을 추정 N이 제시된다.

프로토콜

이 프로토콜은 캘거리 동물 관리위원회의 대학 승인 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드를 본했다.

자손 1. 별도의 댐

1. 이전 ¹² 착유 5 분의 최소 그녀의 자손에서 댐을 분리합니다.
   참고 : 댐은 그러나 더 이상 4 시간 이상 분리의 기간은 우유 성분 ^(14)을 변경할 수 있으며, 분리 ^1,6,13 후 5 ~ 6 시간까지 착유 할 수 있습니다. 분리 시간 우유 컬렉션 볼륨 ^(12)에 영향을 나타나지 않지만, 그것은 일관된 분리 시간이 연구에 걸쳐 유지하는 것이 권장된다. 수유 ¹⁵ 걸쳐 변경 될 우유 조성물은, 따라서 시도가 일관된 우유 컬렉션의 일을 유지해야한다. 최대 우유 생산은 수유의 날 (14) ^(12)에서 발생하는 것이 좋습니다.
2. 온난화 챔버를 사용하면, 새끼 적절한 신체 temperatu을 유지 할 수 있도록착유 절차의 기간 동안 자신의 어머니의 존재없이 다시.
   참고 : 아래 제시 한 연구에서, 착유 따라서 더 온난화 챔버는 사용하지 않은, 댐이 22 주 이전했고, 자손 이십일일 된 경우, 이유에서 수행되었다.

2. 설정 및 준비

1. 착유 절차에 필요한 모든 자료를 수집합니다.
   참고 : 모든 재료는 재료 및 장비 테이블에서 찾을 수 있습니다.
2. 착유가 일어날 이하 패드 흡수 벤치 패드를 다룰 것입니다 벤치에 가열 패드를 놓습니다.
3. 마취 시스템을 설정합니다. 시스템에 충분한 산소와 시작하기 전에 이소 플루 란이 있는지 확인하십시오. 기계 초기 마취 유도에 사용되는 마취 마스크를 연결합니다. 인근 초기 마취 마스크와 다른 경우 마취 유지 보수에 사용되는 마스크를 놓습니다.
4. 옥시토신에 대한 1 ML의 주사기에 25 G 바늘을 부착무균 기술을 사용하여 사출.
5. 산모의 체온은 착유 과정에서 유지되도록 가열 패드의 전원을 켭니다. 참고 : 너무 뜨거워 화상을 입을하지 않는 패드를 보장하기 위해 가열 패드의 온도를 모니터링합니다. 대안 적으로, 특정 온도로 설정 될 수 수술대 가열로, 열원을 사용한다.

3. 댐 사용 아이소 플루 란 마취

1. 산소 탱크를 열고 분당 1 리터 (1,000 CC)에 흐름을 켭니다. 이소 플루 란의 흐름을 켜고 5 %로 설정합니다. 주의 : 마취제를 직접 흡입을 피하고 마취 증기의 축적을 방지.
2. 댐을 마취.
3. 필요한 경우 흡수 벤치 패드 댐 부정사 배치, 유지 마스크로 전환. 페달 반사의 부족으로 마취를 확인합니다.
4. 마취의 유지 보수 2-3 %의 이소 플루 란의 흐름을 줄일 수 있습니다. 계속 드 있도록 절차 내내 모니터링 댐호흡의 Pression의가 발생하지 않습니다. 참고 : 마취, 댐의 눈이 건조하거나 상처가되는 것을 눈을 방지하기 위해 멸균 눈 윤활제를 사용하여 보호해야하면.

4. 옥시토신 주입

1. 옥시토신을 확인합니다 (20 USP 단위 / ml)을 그 유효 기간을 통과하지 않았습니다. / 알코올 클렌징 패드를 닦아 멸균 알코올 옥시토신의 유리 병을 소독.
2. 무균 기술을 사용하여, 주사기에 옥시토신 2 IU (0.1 ml)에 그려. 착유 할 각 댐에 대한 새 바늘과 주사기를 사용합니다.
   참고 : 옥시토신 투여 량은 일반적으로 1의 단일 주사에서 5 IU ^1,6,12,16에 이르기까지 다양합니다. 대안 적으로, 4 IU / kg 체중의 투여 량은 ^12을 사용할 수있다. 난이도 착유가 발생하면 2 IU의 단일 용량은 한 번 반복 할 수 있습니다.
3. 복강 옥시토신을 주입한다. 각도, 머리쪽으로 바늘 가리키는 복부의 우측 사분면에 바늘을 삽입15-30 °의 약 0.5 cm 깊이.
4. 이전에 주입 음압을 보장하기 위해 플런저를 다시 잡아 당깁니다. 유체 (혈액, 소변, 장내 내용 등)가 주사기 내로 흡인되면, 바늘을 제거하고 새로운 바늘 및 주사기로 주입을 시도한다. 더 유체는 옥시토신을 주입하고, 생물 학적 용기에 즉시 바늘과 주사기를 폐기 흡입하지 않으면.
5. 우유 내림을 자극하는 옥시토신을 위해 약 5 ~ 15 분을 기다립니다.

착유 사이트 5. 준비

1. 우유가 수집됩니다있는 사이트 / 유두를 선택합니다. 우유 ^(12)는 임의의 유두로부터 수집 될 수있다.
2. 모피는 시료 채취에 어려움을 초래할 수 있으므로 조심스럽게 인해 우유의 심지에, 트리머로 착유 할 수있는 유두 주위의 털을 제거합니다. 온화 - 유두 주변의 피부가 매우 민감하고 건조 할 수 있으며, 같은 상처와 눈물에 영향을 받기 쉽다.
3. 유두 I의 살균필요한 아니다, 그러나 모피가 제거 된 후 선택적으로, 미지근한 물과 젖꼭지를 청소하십시오. 두 개 이상의 사이트가 우유 수집을 위해 요구 될 수있는 두 개 이상의 사이트를 준비합니다.
   참고 : 우유 분석은 미생물 프로파일이 포함되어있는 경우, 유두 영역은 요오드 ⁵ 살균이 필요할 수 있습니다.

6. 우유 컬렉션

1. 부드럽게 수동으로 수집을 위해 우유를 추방, 유두의 기반을 짠다.
   참고 : 우유 분석은 미생물 프로파일이 포함되어있는 경우, 우유의 처음 몇 방울을 폐기해야합니다.
2. 모세관 충전, 모세관에 우유 방울을 수집한다. 큰 양 (예를 들면, 50 μL) 과정을 쉽게 수용 모세관.
   주 : 우유를 수집하는데 어려움이 발생하면, 옥시토신 제 투여 량으로 투여 될 수있다. 이 용량은 4 IU 총을 초과하지 않는 것이 좋습니다.
3. 무균 마이크로 원심 튜브에 의해 모세관으로부터 우유를 분배microcentrifuge 관의 측면에 유두에서 우유 묘화에 사용 된 상기 튜브의 단부를 터치 - 우유는 모세관 작용을 통하여 모세관 인출되는 관찰.
   주 : 1 ML의 주사기에 부착 된 18 G 바늘을 사용하여 튜브로 유입되지 않은 우유를 '밖으로 불어'.
4. 지속적으로 통증이나 호흡 억제의 징후 댐을 모니터링하고 그에 따라 이소 플루 란의 흐름을 조정합니다.
5. 충분한 우유가 선택한 우유 분석을 위해 수집 된 때까지이 절에 설명 된대로 우유를 수집하기 위해 계속합니다. creamatocrit 단백질 농도 결정에 대하여 설명을 위해, 0.25 ㎖의 우유를 수집한다.
   참고 : 우유 내림 둔화 또는 선택된 사이트가 충분히 우유를 추방하지 않는 경우 다른 착유 사이트를 사용합니다. 동물의 우유 당 약 2.5 ml를 최대 ¹⁷ 수집 또는 유두 당 0.5 ml의 최대 수. 저자는 O, 마취에서 총 시간은 약 45 ~ 60 분으로 제한하는 것이 좋습니다R 착유 45 분.
6. 신선한 우유 샘플들로부터 측정 creamatocrit microhematocrit 튜브로 우유를 수집하고, 점토 실란트와 튜브의 단부를 밀봉. 댐 ID로 microhematocrit 튜브 레이블과 수직 우유 샘플을 저장합니다.
7. 착유가 완료되면, 이소 플루 란과 산소의 흐름을 해제. 댐에서 마스크를 제거하고 깨어 때까지 댐을 모니터링하는 것을 계속한다. 그것은 완전히 의식하지 않을 경우, 댐이 아니라 직접 케이지 침구보다는, 회복 기간 동안 흡수 벤치 패드에 배치해야 흡입 또는 복구 중에 댐의 눈을 긁적되는 침대를 방지하는 것이 좋습니다.
   참고 :이 흉골 recumbancy을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 댐을 두지 마십시오.
8. 더 분​​석이 필요하지 않은 경우, -80 ° C에서 우유를 동결. 다른 사람들은 우유가 -20 ° C ^(18)에서 3 시간까지 4 ° C에서 5 개월 동안 저장 될 수 있음을 제안했다.

7. Creamatocrit 측정

1. 우유 creamatocrit (우유 샘플 크림의 비율) ^(19)를 계산하여 우유의 지방 함량을 추정한다.
   주 : 모유와 측정은 신선 또는 냉동 중 우유 그러나 신선한 우유가 더 높은 상관 관계, creamatocrit 측정에 사용될 수 있음을 보여 주었다 (R R = 0.90 대 = 0.92) 지질 농도 ^11. 해동 우유 creamatocrit에서 작은 감소와 연관된로 creamatocrit 측정 용 신선하거나 냉동 우유의 사용은 ^{11 값,} 연구 일관된 유지되어야한다.
2. 신선한 우유를 들어, microhematocrit 튜브에 유두에서 우유의 샘플을 수집; 적어도 작성 ¾ 전체 (약 15 ~ 20 μl를). 또한, 잘 혼합 한 후 모세관 튜브에 수집 된 샘플에서 신선한 우유를 그립니다. 점토 실란트와 끝을 밀봉합니다.
3. 으로 헤마토크릿 스피너로 모세관 배치밀봉 단부 원심을 보장 바깥쪽으로 향하고 것은 균형이다.
4. 적혈구 용적률 스핀 (13,700 XG에 120 초)을 시작합니다.
   참고 : 회전 시간이나 속도가 사용 원심 분리기의 모델에 따라 변경 될 수 있습니다.
5. 스핀 완료 후 원심 분리기에서 튜브를 제거하고 creamatocrit을 계산하기위한 측정을 수행한다. 크림 층과 클리어 층에 샘플의 분리를 관찰한다.
6. 측정 관 내의 유체의 총 길이 및 지방 (크림)의 길이 또는 캘리퍼자를 사용 층을 기록한다.
   주 : creamatocrit과 같이 계산 우유 샘플 ⁽¹⁹⁾ 내의 크림 층의 백분율로 표현된다 (크림 층의 길이 / 우유 컬럼의 총 길이) (100) (도 1a)을 X. 다음과 같이 creamatocrit 측정에서 지방 농도와 에너지 값을 계산한다 지방 농도 (G / L) = (creamatocrit (%) - 0.59) /0.146 (그림 1B)를 ^19; 에너지 값 (KC알 / L) = 290 + (66.8 * creamatocrit (%) (그림 1C) ^19.

8. 단백질 농도 결정

1. 단백질 표준으로 소 혈청 알부민을 사용하여, 이러한 로우리 단백질 검정 ^6으로 표준 단백질 분석법을 사용하여 총 우유 단백질 농도를 결정한다.
   주 : 우유 단백질 측정 분석의 표준 곡선 내에 있도록 우유의 희석이 필요할 수있다.

결과

위 스타 댐으로부터 이유에서 설명한대로 우유 수집하고, 높은 단백질 제어 소비 (5 AIN-93G를, N =) 해당 (무게이 22 주령 350-400g) (40 % 카제인 중량 / 중량, N = 5) 또는 높은 프리 바이오 틱 섬유 (21.6 % 중량 / 중량, 1 : 올리고 프룩 토스 및 이눌린, N = 4의 1 비율) 임신과 수유에 걸쳐 다이어트. 옥시토신 투여 량은 IU 2했다. 우유는 모세관 튜브를 사용하여 수집하고, 하나의 튜브를 따라 지방 농도와 에너지 값을 추정하는데 사용 하였다 creamatocrit (도 1a), 판별 헤마토크릿 스피너를 이용하여 스핀 하였다 : (%를 지방 농도 (g / L) = (creamatocrit을 ) -0.59) /0.146 (그림 1B); 에너지 값 (킬로 칼로리 / L) = 290 + (66.8 * creamatocrit (%) (도 1C)는 ^19. 우유 단백질 농도는 바...

토론

초기 생애 발달 연구에 대한 관심이 높아짐에 따라 모유 성분에 대한 조사가 증가했습니다. 신생아 기간 동안 유일한 영양 공급원인 우유의 생리 활성 화합물은 특히 장 및 면역 건강의 맥락에서 이상적인 성장과 발달에 필수적입니다³. 여기에 제시된 방법은 올리고당^{프로파일링과} 같은 다운스트림 분석에 충분한 양으로 수유 쥐로부터 우유를 수집하는 간단하고 비침습적인 방법입니다6. 이 방법은 특별한 진공 장비가 필요하지 않으며 한 사람이 수행할 수 있습니다.

이 프로토콜은 수유 중 단일 시점에서 사용하기 위한 것이지만, 다른 사람들은 연구 전반에 걸쳐 일련의 우유 수집을 수행했습니다^12,15. 그러나 연속 착유는 우유 구성에 영향을 미칠 수 있으므로¹⁷, 연구자는 관심 있는 결과에 따라 연구에 가장 적합한 우유 수집의 빈도와 수를 결정하는 것이 좋습니다. 또한, 다른 사람들은 쥐의 착유 절차 중에 주사 가능한 마...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
장비 - Milking
1 ml 주사기	BD-Canada	309602
25G 바늘	BD-Canada	305122
18G 바늘	BD-Canada	305196
50 μ l 마이크로 디스펜서 모세관	Fisher Scientific	21-169D
옥시토신 (20 USP 단위/ml)	Bimeda-MTC	1OXY015
PPC Vet Isoflurane 흡입 마취제, 250ml	Fresenius Kabi	M60302	수의사의 주문에 사용
멸균 알코올 준비 패드	Dukal	853
흡수 벤치 언더패드	VWR	82020-845
Maxi-Therm 하이퍼/저체온증 담요	신시내티 Sub-Zero	274
설치류 마취기(기화기 포함	Benson Medical Industries Inc.		개별 실험실의 요구 사항에 따라
Animal Masks	Benson Medical Industries, Inc.	50100/50102
마이크로 원심분리기 튜브	Axygen	MCT-060-C
ChroMini 전문 트리머	Wahl
장비 - Creamatocrit
StatSpin SafeCrit 플라스틱 마이크로헤마토크릿 튜브(미처리)	Fisher Scientific	22-274-914
Critoseal 모세관 실란트 트레이	VWR	470161-478
StatSpin CritSpin Microhematocrit 원심분리기	Beckman Coulter, Inc	X00-004999-001