컴퓨터 원호 비디오 및 디지털 이미지 분석을 사용하여 수성 구리의 급성 노출에 대한 응답에 물고기가 수영 동작을 정량화

요약

물고기의 행동에 환경 오염 물질의 영향을 측정하는 것은 종종 주관적이고 치사 엔드 포인트를 다룰 때 특히 도전이다. 우리는 동안 구리 다양한 농도의 96 시간 급성 노출 후 초기 생활 단계 흰 철갑 상어 (인 Acipenser transmontanus)의 수영 동작을 정량화하는 비디오 기술을 포함하는 방법을 설명합니다.

초록

환경 오염 물질에 대한 수생 생물의 행동 반응은 생존, 성장 또는 번식과 같은 다른 효과의 전조가 될 수 있습니다. 그러나 이러한 반응은 미묘할 수 있으며 측정이 어려울 수 있습니다. 이 논문은 구리에 노출된 어린 흰철갑상어(Acipenser transmontanus)를 사용하여 컴퓨터 지원 비디오 및 디지털 이미지 분석을 사용하여 행동 반응을 정량화하는 데 사용되는 기술을 보여줍니다. 이전 연구에서는 구리에 급성 및 만성 노출되는 동안 초기 생애 단계의 흰 철갑상어에서 수영 행동의 심각한 손상이 관찰되었습니다. 철갑상어의 행동은 급격히 손상되었고, 물고기가 하류로 휩쓸리거나 포식자에게 쉽게 포획되기 때문에 들판에서의 생존이 위태로워질 정도였습니다. 이 조사의 목적은 일련의 급성 구리 노출 동안 수영 활동을 정량화하여 초기 생애 발달 기간 동안 영향을 받는 시간을 결정하고 이러한 취약한 초기 생애 단계 물고기의 생존과 관련하여 이러한 반응의 중요성을 이해하는 프로토콜을 설명하는 것이었습니다. 사망률은 시간 연속체에 있기 때문에 구리가 수영 능력에 처음 영향을 미치는 시점을 결정하는 것은 개체군 수준 효과에 대한 의미를 이해하는 데 도움이 됩니다. 사용된 기술은 다른 유기체 및 스트레스 요인을 사용한 실험 설계에 쉽게 적용할 수 있습니다.

서론

오염 물질 노출이 행동에 영향을 미칠 수있는 방법을 이해하는 것은 시간에 매우 도전적이고 주관적이다. 동작은 전형적으로는 중추 신경계를 통해 작동하고, 생존, 성장 및 재생하도록 유기체있게 명백한, 관찰, 전신 활동의 시리즈로서 정의된다. 생존 ^1에 비해 인한 독성 물질에 노출 행동의 변화는 환경 스트레스 종종 10 ~ 100 사이 배 더 민감의 가장 민감한 지표 중입니다. 이러한 연구의 대부분은 활동, 환기 수영, 물고기 ^2,3,4의 행동을 구하고 조사했다. 활동을 수영 독성 시험 ^(5)에 오염 물질에 대한 응답으로 행동 변화를 결정하는 가장 자주 사용 치사 엔드 포인트입니다. 수영 변수는 주파수와 여행 운동 속도와 거리의 지속 시간, 빈도와 회전 각도, 위치 물 열에서 수영의 패턴을 포함한다. 실내 활동은수영 동작의 효과 측정 수생 독성의 책을 기본으로 랜드 ^(6)에 의해 제 9 장에서 제안 된 기준에 따라 독성 물질에 대한 민감도를 평가.

이 논문은 초기 개발의 여러 단계에서 초기 생활 단계 흰 철갑 상어 구리의 독성 (인 Acipenser transmontanus) 물 전용 수영 동작을 평가 하였다 철갑 상어에 대해 익스포저 방법의 예로서 독성 학적 연구를 제시하고 수영을 정량화하는 방법을 보여줍니다 행동.

이전의 연구에서, 이상 행동 반응은 구리에 대한 급성 및 만성 노출의 처음 몇 일 동안 조기 발병에 분명했다 및 노출 시간과 농도 ^{7, 8, 9를} 통해 점진적으로 더 심각했다. 이러한 크기 및 행동 반응의 개시의 타이밍은 장기 생존율을 제한하기에 충분한 가능성이있어 recrui 대한 영향 주어진 관심있는tment 실패 ^10. 정확하게 금속 노광 방법 및 절차에이 감도의 의미를 해석하기 위해, 구리의 농도에 대하여 행동 장애의 시간 경과와 정도를 정량화하기 위해 개발되었다.

행동 기능과 개발을위한 시험 프로토콜이 노출 챔버에서 철갑 상어의 오버 헤드 비디오 샘플을 분석하여 설립되었다. 비디오 샘플의 노출 기간에 걸쳐 구리 처리 구간 발전 기능 질적 평가를 제공 하였다. 행동과 쉼터 추구 활동에 영향을하고 조정, 균형, 호흡 수영, 쉼터 추구, 무기력에 영향을 미치는 손상의 시간적 순서를 특성화하는 시간을 결정하는 수성 구리 농도에 노출시 평가 하였다. 또한, 비디오 녹화 정량적 문서화 자발 수영 ACTI의 목적으로 복제 각각으로부터 서브 샘플링 철갑 만들어졌다vity. 이 엔드 포인트는 시간 측정치를 포함하거나 시간은 속도 및 거리가 시판 디지털 영상 분석 소프트웨어 패키지를 사용 ^{5,11 여행} 수영 이동 보냈다. 이 소프트웨어는 시야 내의 각 화상의 윤곽선을 정의하고, 이로부터 각 화상의 중심을 정의한다. 소프트웨어는 이동 경로를 결정하기 위해 프레임 연속하여 프레임의 각 중심의 위치를​​ 추적 할 수있다.

동물 복지법 규정 (9 CFR)의 최종 규칙의 모든 해당 섹션으로 문화와 실험 기간 동안 시험 생물의 인도적인 처리를위한 모든 제도적 가이드 라인을 준수이 연구. 연구 종료되면, 모든 물고기는 미국 지질 조사를위한 기관 동물 관리 및 사용위원회, 컬럼비아 환경 연구 센터에 의해 승인 된 적절한 가이드 라인에 따라 안락사시켰다.

프로토콜

수성 구리 농도에 애벌레 철갑 상어 노출 1. 설치 희석

1. ASTM 국제 ^{13,14,15하여} 가이드 라인을 다음과 같은 수정 마운트 및 Brungs ⁽¹²⁾ 희석 시스템과 같은 흐름을 통해 시스템을 사용하여 설정 노출.
2. 효과는 4-6 μg의 / L의 주위에 관찰되었다 이전의 테스트 결과를 바탕으로 높은 구리 농도 25 μg의 / L를 선택합니다. 시약 등급의 구리 II 황산 수화물 (> 98 % 순도)를 사용하여 시험 원액을 혼합한다.
   참고 : 노출에 대한 예 농도 시리즈는 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.0625, 0 μg의 / L이다. 높은 농도 25 μg의 / L로부터 50 % 희석액을 사용하여, 행동 장애를 일으키는 것으로 관찰 된 농도의 범위를 대상으로한다.
3. 을 사용하여 희석 혼합 챔버를 제공하기 위해 스파이크 노광 개시 48 시간 전에 메스 플라스크에 시험 원액을 준비하고 설정할자동 주사기 디스펜서.
4. 희석 혼합 챔버는 시험 스톡 용액 1 ㎖와 함께 급증하는 경우, 25 μg의 / L의 구리 농도를 초래할 것이다 탈 이온수 1 L에 첨가되는 화학 물질의 무게를 결정하기 위해 스프레드 시트 템플릿을 사용한다.
   참고도 1은 희석 독성 실험 화학 스톡 제조 스프레드 시트 템플릿의 일례를 도시한다.
5. 분석 저울을 사용하여 시약 등급의 구리 II 황산 수화물 195 mg의를 달아 1 L 부피 플라스크에 부어 48.65 ㎎ / ℓ의 주식 농도 탈 이온수 1 L로 혼합한다.
6. 시험 원액으로 자동 주사기 디스펜서에서 흡입 튜브를 놓고 1ml를에 스파이크 볼륨을 설정하고 전원 스위치를 내리고으로 희석을 켜고 48 시간 동안주기가 스타킹에 앞서 대응하는 구리 농도 평형을 허용하자 철갑 상어.
7. 인라인 4 방향 유동 분배기를 첨부 16. 중력은 물을 공급. 사이클을 통해 희석 물로 희석 전원이 켜질 때, 솔레노이드 밸브는 물 희석 탱크로 흐르도록 개방된다. 15 ° C로 냉각 장치를 설정하고 희석 물을 욕조에 물을 순환시키는 워터 펌프의 전원을 켭니다.
   참고 :이 프로세스는 자동화 된 타이머의 사용에 의해 조절된다.
8. 자동 타이머를 이용하여 사이클마다 30 분 희석을 설정하고 각 하루 12 부피 첨가의 결과로, 각 사이클 시험 250 ml의 물을 제공하는 시험 챔버를 복제.
9. 철갑 상어의 크기에 따라 선택 노광 시험 챔버는 임의의 주어진 시간에 허용 가능한 임의의 챔버로드 인 속도 <10g 물고기 습식 중량 / L를 유지한다. 예를 들어 30 하루 후 해치 (DPH) 흰 철갑 상어 (그램에 평균 무게 0.17 g) 12 X를 사용과 노출을 수행하는측면에서 4cm 구멍 21.5 cm ² 유리 항아리. 시험 물을 통해 흐름을 허용하는 30 마이크론 메쉬 스테인레스 스틸 화면이 측면을 커버. 노광 항아리 시험 물의 부피는 1 L.
10. 12 샘플의 총 각 농도에서 두 복제에 50㎖의 물 샘플을 100 mL의 유리 비이커에 시험 물 분배와 용존 산소 (DO), 온도, 전도율의 pH, 알칼리도, 경도를 측정 한 50㎖ 플라스틱 주사기를 사용하여, 총 암모니아, 주요 양이온, 주요 음이온 및 용존 유기 탄소 표준 상용 장비를 사용하고 제조업체의 지침을 따르십시오.
    참고 : 샘플이 시작과 노출의 말에주의해야한다.
11. 화학 분석을 위해 서브 샘플을 수집하려면, 대신 바늘의 주사기에 부착 된 sipper 빨대를 사용하여 노출 챔버에서 테스트 물 약 24 mL로 작성, 25 ml의 플라스틱 주사기를 사용합니다.
12. SY에서 sipper 빨대를 제거ringe는 폴리 프로필렌 필터 카트리지 하우징을 플라스틱 주사기에 0.45 ㎛의 세공 크기, 폴리 에테르 설폰 막을 놓고.
13. 필터를 통해 테스트 물 4 mL로 누르고 폐기하십시오.
14. 산 세정 폴리에틸렌 병에 필터를 통해 시험의 잔류 물 20 ㎖를 분주하고 1 % 부피 / 고순도로 볼륨을 최대 3 개월간 저장 16 M 질산으로 산성화.
    참고 : 화학 분석을위한 샘플 구리 농도를 확인하기 위해 시작, 중간 및 노출의 말에주의해야한다.
15. 미국 환경 보호국 방법 6020a ⁽¹⁷⁾ 다음 유도 결합 플라즈마 질량 분석기를 사용하여 화학 분석을 수행
16. 모든 물 샘플을 채취하고, 희석이 각각 주식 10 (랜덤, 우연히) 철갑 상어를 순환 한 후 테스트 챔버를 복제합니다. 그들은 작은 메쉬 비 마모성 그물을 사용하여 수납되어 배양 탱크에서 철갑 상어를 수집합니다. 작은 bucke에 철갑 상어를 배치배양 물 t. (240) 물고기의 총 노출을 시작하는 데 필요합니다.
17. 노출 동안 물고기를 먹이를하지 마십시오.
    참고 : 희석 레이아웃의 시각적 설정에도 1을 참조하십시오.
18. 노출과 기록 물고기 사망률의 기간 동안 매일 테스트를 읽고 행동을 수영 모니터링 할 수 있습니다.
    참고 : 다른 엔드 포인트가 혼수, 균형 상실, 호흡의 변화, 색소 침착의 변화를 포함 찾기 위해이 위치 물고기 활동과 시각적으로 식별 할 수있는 다른 이상을 숨기고, 물기둥에 있습니다.
    참고 : 일관성을 위해 매일 같은 시간에 시험을 읽으십시오.
19. 시판 디지털 추적 소프트웨어 프로그램을 사용하여 (시각 물고기, 이동 속도 및 소비 이동 거리)를 측정 수영 활성을 정량화.

2. 노출 동안 관찰 및 사망률 카운트

1. 시각적으로 각 테스트 채널을 검사황색 및 참고 사망률 바람직 아침에 96 시간 노출 동안 매일 약 동시에 규격서에 행동 점검표 (표 1)를 이용하여 비정상적인 행동을 관찰.
   참고 : 막히게, 이례적으로, 주관적으로, 컨트롤에서 질적으로 다른 이상이 고려된다 동작. 최적의 관찰자는 치료를 인식하지 못합니다.
   참고 : 평형의 손실을 물 컬럼 내에서 수직 위치를 유지하는 물고기의 무능력으로 정의하고 부동이 이동하거나 prodded하지 않는 수영하는 물고기의 무능력으로 정의된다. 이러한 무기력, 과잉 행동, 증가 또는 호흡의 감소, 색상 변경, 떨림, 경련, 부풀어 복부, 위치 물기둥과 다른 특이한 수영 패턴과 같은 다른 이상은 데이터 시트에 기록되어야한다.
   참고 : 비정상의 예는 비디오 1을 참조하십시오행동.
2. 기록과 매일 죽은 철갑 상어를 제거합니다.
3. 프로브와 용존 산소 (DO) m 핸드 헬드를 사용하여 데이터 시트에 각각 노출 농도 및 기록의 두 복제 시츄 기록 수온 용존 산소를 측정한다.

3. 찍고 수영 활동

1. 휴대용 비디오 카메라를 이용하여 캡처 된 비디오 데이터 샘플 행동 이상을 문서화 테스팅 챔버의 바로 위에 위치하는 삼각대에 장착.
2. 수영 활동을 정량화하기 위해, 직경 PVC 파이프 13 센티미터의 조각을 잘라 높이 13cm 테스트 분야 (그림 1)로 사용할 수 있습니다. 각각의 대응 구리 농도에 노출 탱크 내의 희석에 PVC 파이프를 놓습니다. 철갑 상어가 자유롭게 수영을하기에 충분한이 큰 그대로 시험 무대로 PVC 파이프 내에서 영역을 사용합니다.
3. 96 시간 노출의 끝에서, 무작위로 각 동 concentratio에서 철갑 상어 생존 5 표본N 수영 활동에 대한 측정과 작은 메쉬 그물을 사용하여 테스트 분야에에 배치합니다.
   주 : 철갑 사망률 많았고 높은 시험 농도에서, 남아있는 생존 철갑가 수영 활성을 측정하기 위해 사용되어야하며, 경우에 따라서 5 미만이 될 수도있다.
4. 테스트 경기장에서 물고기를 배치 한 후, 물고기가 30 분 동안 적응 할 수 있습니다.
   참고 : 성공, 비디오의 오류 무료 분석은 모호하거나 물고기의 이미지를 숨길 수있는 구조의 최소 배경에 물고기의 높은 콘트라스트 이미지를 필요로한다. 물고기의 이미지는 좋은 초점이어야하며 표면 눈부심의 무료 또는 희석 시스템의 전원이 켜져 있어야하므로 물을 이동으로 인해 왜곡이 없어야합니다.
5. 30 분 후, 비디오 카메라를 ON하고 2 분 동안 수영 활동을 기록하도록 REC로 설정.
6. 수 결정하기 위해 비디오 녹화를 촬영 한 후 물고기를 안락사havior.
7. 아가미 운동의 중단을 허용하기 위해 적어도 10 분 동안 tricaine의 메탄 (MS222)의 물을 농축 된 용액에 철갑 상어를 놓습니다.
   참고 : 적어도 250 ㎎ / ℓ의 농도가 권장되며, 특정 종에 대한 훨씬 높은 수 있습니다.
8. 나중에 처분​​ 냉장고에 플라스틱 지퍼 잠금 가방과 장소에서 안락사 철갑 상어를 놓습니다. 비디오 카메라 끄고 디지털 추적 소프트웨어를 사용하여 후 처리를 위해 컴퓨터에있는 모든 비디오 파일을 전송할 수 있습니다.

비디오 재생에서 수영 활동 4. 측정

1. 실험 분석을 위해 데이터 시트 및 비디오 데이터 파일을 찾습니다. 디지털 분석 소프트웨어가 처리 할 수​​있는 호환되는 형식으로 비디오 파일을 변환합니다.
2. 업로드 된 모든 파일은 소프트웨어로 처리한다. 아이콘을 클릭하여 열기 추적 소프트웨어. "새 실험 만들기"오에서 "새 기본 실험"을 클릭합니다메인 화면에 ption.
3. 화면에 나타납니다 "새 실험"대화 상자에서 실험에 이름을 입력합니다. 위치 실험 파일을 선택하여 저장한다. "OK"를 클릭합니다. "비디오 소스"에서 "비디오 파일에서" "설정".Choose에서 "실험 설정"옵션을 선택합니다.
4. "경기장의 수"에 대한 "1"을 선택합니다. "경기장마다 과목의 수"에 대한 "3"을 선택합니다. "추적 기능 '에서'센터 포인트 검출"을 선택합니다. 원하는 단위를 선택합니다.
5. "설정"에서 "시험 목록"옵션을 선택합니다. 화면의 상단에있는 "동영상 추가"를 클릭합니다. 화면에 나타납니다 "동영상 추가"대화 상자의 "정렬 순서"옵션에서 "알파벳 순서"를 선택합니다. "찾아보기"를 클릭합니다. 비디오 파일의 위치 폴더로 이동합니다.
6. 모든 비디오 파일을 선택합니다. "열기"를 클릭합니다. 클릭하여 화면의 상단에있는 "변수 추가". "에"농도 "를 입력레이블 "상자. 입력"설명 "상자"로 "마이크로 그램 / L의 구리 농도.
7. "종류"드롭 다운 목록에서 "수치"를 선택합니다. "미리 정의 된 값"상자를 클릭합니다. 표시되는 "수치 값을 미리 정의"대화 상자에서 옵션 "개별 값을 정의"를 선택합니다.
8. 입력이 "0", "3", "6", "13", "25"및 "미리 정의 된 값"공간 "50". 클릭하여 각 번호 추가 사이에 "추가 >>". 옵션 "다른 값을 허용"선택을 취소합니다. "OK"를 클릭합니다.
9. "시험"을 선택에서 "범위"상자에서 드롭 다운 메뉴. 제공된 상자에 각 시험에 대한 적절한 농도를 입력합니다. 클릭하여 화면의 상단에있는 "변수 추가". 입력 "레이블"상자에 "복제". "설명"상자에 "번호를 복제"를 입력합니다. "종류"드롭 다운 목록에서 "수치"를 선택합니다.
10. P "를 클릭재정의 값 "상자. 선택"수치 값을 미리 정의 "에 옵션"개별 값을 정의 >> ". 공간을 클릭"1 ","2 ","3 "및"4 미리 정의 된 값 "에서" "대화 상자가. 입력"추가 "각각의 숫자 또한 사이. 선택을 취소"다른 값을 허용 "option.Click"OK ".
11. "시험"을 선택에서 "범위"상자에서 드롭 다운 메뉴. 제공된 상자에 각 시험에 대한 적절한 복제 번호를 입력합니다. 화면의 상단에있는 "설정"탭에서 "아레나 설정"을 선택합니다. 제 1 설정 "시험 1"이름을 지정합니다. "아레나 설정 (시험 1)"대화 상자에서 "잡아 배경 이미지"옵션을 클릭합니다.
12. "잡아 배경 이미지"대화 상자의 "찾아보기"를 클릭합니다. 시험 1 비디오 파일을 찾아 "열기"를 클릭합니다. 동영상이 나타난 후 "잡아 배경 이미지"대화 상자에서 "잡아"옵션을 클릭합니다. 화면 숙녀의 상단에있는 흰색 원 아이콘을 클릭합니다"아레나 설정"어.
13. 전체 수영 영역이 원 안에되도록 나타납니다 원을 조작 할 수 있습니다. 경기장 영역이 정의된다 해치 마크가 나타납니다. "아레나 설정"아래 화면의 상단에있는 "교정 규모"아이콘을 클릭합니다. 경기장의 한쪽 가장자리에 클릭을 떠났다. 잡고 경기장의 반대쪽에 이상 드래그 마우스입니다. 왼쪽 클릭을 놓습니다.
14. 입력 "10.5"표시 "보정 거리"대화 상자에서 "실제 거리"상자에서. "OK"를 클릭합니다. 필요한 경우이 원형 경기장의 전체 직경에 걸쳐 있도록 교정 선을 조정합니다.
15. "아레나 설정 (시험 1)"대화 상자의 "유효성 검사 아레나 설정"옵션을 클릭합니다. 설정이 확인되지 않은 경우 문제를 해결합니다. 화면의 왼쪽 메뉴에서 "새"를 선택 마우스 오른쪽 버튼으로 "실험 Explorer의"도구 모음에서 "설정"옵션에서 "아레나 설정"을 클릭합니다.
16. 경기장은 시간을 초기 설정 될 때까지 반복 4.11-4.15 단계각 시험에 대해 생성 된 들이죠. 각각의 시험에 적합한 비디오 파일을 선택해야합니다. 화면의 왼쪽에있는 "실험 Explorer의"도구 모음에서 "설정"옵션에서 "검색 설정 '을 선택합니다.
17. "검출 설정 1 검출 설정"대화에서 "제목 확인"에서 각 주제에 대한 다른 채우기 색을 appears.Choose "감지 설정 한 검색 설정"대화 상자에서 드롭 다운 메뉴에서 "방법"에서 "동적 빼기"를 선택 상자.
18. "선택 비디오"를 선택하고에서 "비디오"에서 "샘플 속도"상자에서 시험 1.Click "열기"ALL 기타 사항 서보 -OFF "5.9941"에 대한 비디오를 찾습니다 "검색 설정 : 감지 설정 1"대화 상자. "검출 설정 1 검출 설정"대화 상자에서 "검색"에서 "참조 이미지"옵션 "설정"을 클릭합니다.
19. 클릭 "학습 (C)를 시작합니다4; 참조 이미지를 배울 수있는 프로그램 "참조 이미지"대화 box.Wait에서 옵션을 선택합니다. "참조 이미지"대화 상자에있는 이미지 동물없이 표시되면 클릭하여 대화 상자에서 "취득 설정"에서 "동적 참조 이미지를 사용합니다."
20. "닫기"를 클릭합니다. "검출 설정 1 검출 설정"대화 상자의 드롭 다운 메뉴에서 "어둡게"을 선택에서 "검색"에서 "제목은이다". 검색 설정 (1) "대화 상자"검색 ""검색 설정에서 "어두운 대비"를 "33"으로 적은 수의 큰 숫자 "153"로 설정합니다.
21. "검출 설정 1 검출 설정"대화 상자의 오른쪽 아래에있는 '변경 사항 저장'을 클릭합니다. "재생 컨트롤"대화 상자에서 재생 버튼을 클릭하고 그림자 또는 파편에 반대 해당 소프트웨어가 성공적으로 동물을 추적하고 확인합니다. "어두운 콘트라에 대한 숫자를 조정t "필요.
22. "검출 설정 1 검출 설정"대화 상자 추적 적절한되면, 하단 오른쪽에있는 "변경 사항 저장"을 클릭합니다. 화면의 왼쪽에있는 "실험 Explorer의"도구 모음에서 "설정"옵션에서 "취득"을 선택합니다.
23. "취득 설정"대화 상자에서 "트랙 옆에 계획된 시험"을 클릭합니다. 올바른 재판, 비디오 및 무대 설정은 "인수 설정"대화 상자의 "설정"에 표시됩니다 확인합니다.
24. "수집 제어"대화 상자에서 "검색 속도를 결정한다"옵션을 선택합니다. 인수 과정을 시작하기 위해 흰색 사각형에 포함 된 녹색 원으로 버튼을 클릭합니다. 모든 시험이 추적 될 때까지 반복 4.22-4.23 단계를 반복합니다.
25. screen.Choose "시간"의 왼쪽에 오 "중첩"에서 "실험 Explorer의"도구 모음에서 "분석"옵션에서 "데이터 프로파일"을 클릭"구성 요소"도구 모음에서 pt​​ion. "시간"대화 상자에서 제목 "선택 트랙 시간 간격"에서 "대상"을 "0시 2분 0초"조정합니다. "OK"를 클릭합니다.
26. 화면의 오른쪽에있는 "데이터 프로필"영역에서 "시작"상자와 "결과 1"상자의 "둥지"상자를 드래그합니다. 화면의 왼쪽에있는 "실험 Explorer의"도구 모음에서 "분석"옵션에서 "분석 프로파일"을 클릭합니다. 표시되는 "종속 변수"도구 모음에서 제목 "거리와 시간"에서 "속도"를 클릭합니다.
27. 클릭 "속도"대화 상자의 "추가". 클릭 "종속 변수"도구 모음에서 제목 "거리와 시간 '에서'거리 이동". "거리 이동"대화 상자의 "추가"를 클릭합니다. "개별 행동" "종속 변수"에서 제목 t에서 "운동"을​​ 클릭oolbar.
28. "운동"대화 상자에서 제목 "특이점 필터"에서 "평균화 간격"을 "1"을 조정합니다. "운동"대화 상자에서 제목 "임계 값"아래에 "2.00"과 "정지 속도를" "속도를 시작합니다"를 "1.75"조정합니다.
29. "이동"과 "운동"대화 상자에서 제목 "에 대한 계산 통계"에서 "이동하지"모두 확인란을 선택합니다. 클릭 "운동"대화 상자의 하단에있는 "추가". 화면의 왼쪽에있는 "실험 Explorer의"도구 "결과"옵션에서 "분석 출력 '을 클릭합니다. 화면의 상단에있는 "계산"을 클릭합니다.
30. 종속 변수가 계산되면, 화면의 상단에있는 "내보내기"를 클릭합니다. "내보내기 분석 출력"대화 상자에서 대상 폴더를 선택합니다. "내보내기 분석 Outpu에서"파일 형식 "드롭 다운 메뉴에서"엑셀 "을 선택t "OK"대화 상자가. "를 클릭.
31. 화면 상단의 "파일"탭에서 "저장 실험 '을 클릭합니다. 디지털 추적 소프트웨어를 닫습니다. 스프레드 시트 파일에 데이터를 반입 및 상업용 통계 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석한다.

결과

수동으로 처리 시각 관측 자료 2 일 후 부화 (DPH) 철갑 상어 (그림 2)와 함께 시작 노출의 단지 72 시간 후 증가 구리 농도가 증가 퍼센트 이상을 보여 주었다. 비디오 샘플 철갑 유영에 구리 노출 극단적 충격 (영상 2)를 설명하고 그 결과 행동 장애를 정의하는데 도움. 또 다른 예에서, 30 DPH에서 철갑 상어는 사망률 만에 기초하여 40.3 μg의 / L의 96 시간 평균 치명적인 영향 농도 (LC50) 구리 노출에 민감 입증했다. 그러나, 평형 및 고정 손실의 치사 행동 엔드 포인트가 사망와 함께 포함될 때 2.4에서 5.0 μg의 / L에 이르기까지 약 96 시간 평균 효과 농도 (EC50)와 민감도 증가한다. 기록 된 행동 이상의 비디오 문서 이러한 치사 효과를 포착하고 추가 검증 인간의 관찰노출시. 수영 활동을 분석 할 때 디지털 추적 소프트웨어의 사용은 현저하게 후 처리 시간을 감소시켰다. 물고기 속도, 이동 소요 시간과 거리를 모두 현저히 증가하는 구리 농도 (도 3) 감소 여행. 수영 경로도 증가 구리 농도 (그림 4) 감소했다.

그림 1 :.. 시험 원액의 농도를 목표 농도에 따라 스프레드 시트 템플릿을 사용하여 측정 하였다 희석 독성 시험을위한 화학 재고 준비를 결정하는 데 사용 스프레드 시트 템플릿의 컴퓨터 스크린 샷 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 :. 희석 설정 및 실험 설계 흰 철갑 상어의 다양한 삶의 단계는 구리에 노출되었다. 노광에 사용되는 희석의 크기는 물고기의 크기에 기초하여 선택 하였다. () 초기 생활 단계 철갑 상어는 큰 희석 설정을 사용하여 노출 된 작은 희석 설정 및 (b) 이전의 생활 단계 철갑 상어를 사용하여 노출되었다.

그림 3 : (30 일 후 부화 [DPH] 물고기로 시작하는) 초기 생활 단계 흰 철갑 상어 (인 Acipenser transmontanus) 72 시간 구리 노출 수영 행동의 결과. 흰 철갑 상어 DPH (30) 사이에 운동의 수영 활동 엔드 포인트의 (a) 기간; (b)는 수영의 속도; 및 (c 이동 강한>) 거리를 96 시간 동안 노출 흰 철갑 상어 중 구리 농도가 증가함에 따라 감소 하였다. 별표가 컨트롤에서 유의 한 차이를 나타내고, 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다.

그림 4 :. 초기 생활 단계 흰 철갑 상어 (인 Acipenser transmontanus) 96 시간 동 노출의 결과는 72 시간 후 평형과 고정의 손실을 나타내는 2 DPH 흰 철갑 상어에서 살아 남기 (2 일 후 부화 [DPH] 물고기로 시작) 구리 농도가 증가함에 따라 96 시간 노출. 별표가 컨트롤에서 유의 한 차이를 나타내고, 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다.

그림 5 : 초기 생활 단계 흰 철갑 상어의 예 수영 경로 결과 (인 Acipenser transmontanus) 96 시간 동 노출 (30 일 후 부화 [DPH] 물고기)으로 쳐다보고. 철갑 상어의 수영 경로 (N = 5 물고기)와 (b) 높은 치료에서 (50의 (a) 제어 복제에서 디지털 추적 소프트웨어를 사용하여 디지털화 96 시간 노출 후 μg의 / L) 복제 (N = 3 물고기). 일부 물고기의 비활성 있었기 때문에 실 물고기 본의 수를 나타내지 않는 수영 경로의 수를 유의하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

정량화 할 수있는 매개 변수	관측 매개 변수
속도	혼수 / 과잉 행동
거리 이동	평형의 손실
시간의 지속 시간 영역에서 소비	경련 / 진동 / 상승하위
선택 영역 사이의 시간 생물 이동의 영역 전환 번호	물 열에 위치
에 제목 관심 지점을 향해 동물의 경로의 편차를 점 계산	호흡 (고속 / 저속)
제목은 선택한 몸 포인트의 제목을 계산	천연색
두 샘플 사이에 호에 각도 차이를 돌립니다	숨김
각속도 계산 샘플 간격으로 회전 각도를 분할하여
이동 거리만큼 회전 각도를 분할하여 앤더 계산. 다른 속도로 움직이는 동물에서 선회 비교하는 데 사용
시간 이동 소요
모바일도 센트가있는 경우, 전체 면적은 동물이 변화로 감지하는 기간을 상태-계산어 포인트는 동일하게 유지
선택된 신체 점 360 °의 누적 회전 각도를 갖는 경우 회전 한 회전이 완료된다. 무시되는 문턱 미만의 반대 방향으로 회전.
이동성 중심점이 동일하게 유지 되더라도, 검출 된 동물의 전체 영역에 대한 이동도의 비율을 연속 계산한다.
사이의 거리 모든 배우와 선택된 수신기 사이의 거리를 과목-계산
배우 또는 수신기 근방에 있지 않은 시간을 계산하여 근접 -
상대 운동
그들 사이의 거리에 의해 가중 순 가중 이동 - (양극)에 배우의 움직임으로부터 (네거티브) 수신기
가중 이동에서-MoveMe를 그들 사이의 거리에 의해 가중 수신기로부터 배우의 NT.
그들 사이의 거리에 의해 가중 수신기 배우의 이동 대 가중 운동
두 시험 제어 요소의 행사, 또는 요소 내의 사이 시험 관리 상태 - 기간
요소 내의 이벤트는 시험 관리에 정의 된 시험 제어 이벤트 순간이 발생합니다.

표 1 :. 디지털 추적 소프트웨어를 통해 정량화 행동 엔드 포인트는 이러한 엔드 포인트는 개인이나 그룹에 사용되며 노출시 행동 장애의 시각적 관찰 검사에 대한 목록이 될 수 있습니다.

"/www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video1.avi> 비디오 1 ^:. 영향을받는 화이트 철갑 상어에 의해 나타나는 비정상적인 행동의 시각 정의는 매일 관찰 체크리스트는 이상을 기록하는 데 사용되었다 (마우스 오른쪽 클릭하여 다운로드)를. 평형 및 고정의 손실은 노출. Calfee 등으로부터 수정시 관찰되는 가장 일반적인 이상이었다. ⁽⁷⁾

비디오 2 : 화이트 ​​철갑 상어 수영 동작의 예를 강조 비주얼 설명서를 참조하십시오. (마우스 오른쪽 클릭하여 다운로드) 화이트 철갑 상어 수영 활동이 크게 증가 구리 농도에 노출 감소 하였다. 동영상에 도시 철갑 상어 제​​어, 낮은 중간 및 96 시간 수성 구리 끝에 높은 처리 출신노출. 흰 철갑 상어가 여전히 살아 있지만 물고기가 크게 컨트롤에 비해 치료에 장애했다 분명하다. Calfee 등의 수정. ⁽⁷⁾

토론

때문에 오염 물질에 노출 행동의 변화는 종종 서브 치명적인 독성에 대한 엔드 포인트로 사용되지만 측정하기 어려울 수 있습니다. 일반적으로, 동작 응답을 처리하기 위해 많은 시간을 필요로 육안 관찰과 수동 데이터 분석에 의해 측정된다. 그러나 기술 발전으로 정량화 수영 활동 방법은 처리 및 분석 시간을 단축 촬용 ¹⁸ 움직임 분석 또는 디지털 추적 소프트웨어를 사용하는 방법에 초점을 맞추고있다. 영상 분석 동안 너무 철갑 수영 동작을 분석 더욱 효과적이고 효율적인 방법을 제공하는 비디오 데이터 기록 및 물고기 추적 소프트웨어의 사용을 소모 수동 매우 시간했을 수영 변수 정량화 데이터를 캡처. 절차는 간단 수정을 요구 양서류 및 수생 무척추 동물 등의 생물에 대한 정의, 물고기의 행동을 수영 강조하지만. 어떤 행동 endpoin에 따라TS는 실험 설계 및 카메라 시스템은 거의 모든 시판 추적 소프트웨어 패키지와 함께 사용하기 위해 개발 될 수있다, 해결되고있다.

이 방법은 용해 된 구리를 이용하여 증명하지만, 다른 수성 오염이나 온도, 산소 농도 등의 특성에 적용 할 수있다. 이 논문에서 개발되게 프로토콜 기록 장치로서 간단한 디지털 비디오 카메라를 이용했다. 디지털 파일 쉽게 컴퓨터로 전송 및 움직임 분석 소프트웨어에 업로드된다. 방법은 지속적으로 수정 및 정량화 프로세스를 간소화하기 위해 정제되고있다. 비디오 품질 추적 각 물고기를 식별 분석 소프트웨어 위해서는 고해상도 인 것이 필수적이다. 데이터 파일을 처리하는 경우 물고기 대조하지 않는 백그라운드 문제를 일으킬 것이다. 두 차원 영상 추적의 또 다른 일반적인 문제는 식별 개인이다수영 경로가 교차 할 때. 이 경로를 횡단하는 동안 각각의 물고기 식별 소프트웨어 내 경로 세그먼트를 연결하여 수동으로 보정 할 수있다. 대안 적으로, 전체 활성은 그룹 평균 각 복제에 챔버로부터 결정될 수있다. 한 물고기를 포함하는 각 하나에 여러 개별 실 개별 물고기의 움직임을 계산하는보기의 동일한 필드에서 촬영 할 수 있습니다.

현재 우리가 고화질 디지털 비디오 기록 장치 (HD-DVR)에 연결되어 노출 된 상기 챔버 헤드 감시 카메라의 시리즈를 사용하여 업그레이드. 그러나, 고화질 MPEG-4 비디오를 촬영할 수있는 카메라 시스템의 사용 일 것이다. HD-DVR은 지정된 시간에 레코드로 설정하고 최대 7 일 동안 프로그래밍 될 수있다. 접근 방식을 자동화이 손을 놓은 물고기의 행동을 손상시킬 수있는 외부 교란을 최소화하면서 일관성을 유지하는 동시에 여러 동영상의 캡처를 할 수 있습니다. HD-DVR의 정기적 복용단말이 내부 네트워크에 연결하기 때문에 파일의 전송은 비교적 간단하다. 자동 카메라 시스템 수영 동작을 정량화 더욱 향상된 기술이지만, 여전히 독성 시험 동안 행동 장애 문서화와 같은 추가적인 지원 정보를 제공하는 시각적 관찰을 수행하는 것이 유익하다.

1960 년대 초 ^19,20,21로 거슬러 올라가는 금속에 노출로 인한 문학 문서화 변경 물고기의 행동의 오랜 역사이있다. 구리는 이러한 송어 ²² hypoactivity 등의 활동 수준의 변화를 야기하는 것으로 나타났다 (인 Lepomis macrochirus rafinesque)과 전위의 변화와 민물 송어 ^(23)의 먹이 활동 (Salvelinus fontinalis). 적어도 일부 청소년 물고기 감지하고 포식자를 피하고, 구리 유도 화학 감각 부족이 검출 경보 화학 물질 ^24,25,26를 관련 행동에 영향을 미칠 수있는 위해 냄새의 감각에 의존 . 후각 상피 인해함으로써, 방향 감각 상실, 행동 적 회피, 감소 공급 및 후각 ^(27)에 의해 유도되는 다른 행동을 초래할 수 감각 메커니즘에 영향을 미치는 구리 노출로 손상되었습니다. 이러한 변경 행동은 노출 동안 관찰 된 것과 일치했다.

흰 철갑 상어의 수영 동작은 크게 이러한 결과는 행동이 구리의 치사 농도에 영향을 독성 스트레스의 지표로 사용하는 방법을 설명 .. 수성 구리 농도 치사 노출시 영향을 하였다. 비디오 기반의 분석은 수영 동작을 정량화 효과가 입증 또한 구리에 노출 철갑 상어에 심각한 영향의 질적 시각적 문서 역임했다. 분석 소프트웨어는 각종 행동 끝점을 정량화 할 수있다. 목록은 표 1을 참조하십시오. 노광 시스템은 각각의 포인트를 해결하기 위해 변형 될 수있다실시간 모드가 우려 각종 오염물에 대한 노출과 연관된 동작의 차이를 정량화 할 수있다.

수생 독성 연구 행동 엔드 포인트의 이용은 점점 더 채용 적응 행동 함수 환경 손상 ^(9)의 판정에 결정적이기 때문에 오염의 효과를 평가할 때 고려되어야한다. 물고기의 행동에 환경 오염 물질의 영향은 종종 주관적 및 표준 방법의 부재 치사 엔드 포인트를 다룰 때 특히 도전이다 ..

엄밀하게 모니터링 할 수있는 이러한 방법을 사용하여 정량화 활성 수영 유기체 최소 응력 비파괴 및 반복 될 수있다. 동작 수영 표준 독성 시험 ^(5)의 감도를 확장 테스트 프로토콜에 포함되어야 치사 독성 유효 일관된 인덱스이다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
구리 II 황산염 오수화물	시그마 - 알드리치		오염 물질 주
사기 디스펜서	해밀턴 MicroLab 600 시리즈		장치 스파이크 화학 물질
2L 부피 플라스크			용기 저장 용액
24-1.5 L 유리 항아리			테스트 챔버 2 dph 철갑 상어
비디오 카메라	소니 핸디캠 HDR-CX550V
디지털 추적 소프트웨어	Noldus Ethovision
3-17" 평면 스크린 모니터
24개의 감시 카메라	모델 CL101
3-16 채널 디지털 기록 장치
DO 미터	YSI
pH 미터	Orion 940
PH 프로브	오리온
암모니아 미터
암모니아 프로브	오리온
냉각기 장치
재순환 워터 펌프