특정 게놈 지역과 enChIP으로 관련 분자의 식별의 분리

요약

관심 있는 특정 게놈 영역과 관련된 분자의 식별은 이러한 영역의 기능 조절 메커니즘을 이해하는 데 필요합니다. 이 프로토콜은 특정 게놈 영역과 관련된 단백질 및 RNA를 식별하기 위해 엔지니어링된 DNA 결합 분자 매개 염색질 면역침전(enChIP)을 수행하는 절차를 설명합니다.

초록

관심 있는 특정 게놈 영역과 관련된 분자의 식별은 이러한 영역의 기능 조절 메커니즘을 이해하는 데 필요합니다. 관심 있는 특정 게놈 영역과 상호 작용하는 분자를 편향되지 않게 식별할 수 있도록 하기 위해 당사는 최근 엔지니어링된 DNA 결합 분자 매개 염색질 면역침전(enChIP) 기술을 개발했습니다. 여기에서는 enChIP를 사용하여 특정 게놈 영역을 분리하고 관련 단백질 및 RNA를 식별하는 방법을 설명합니다. 먼저, 관심 게놈 영역에는 transcription activator-like(TAL) 단백질 또는 촉매 비활성 형태의 Cas9와 가이드 RNA로 구성된 클러스터된 규칙적으로 interspaced short palindromic repeats(CRISPR) 복합체로 태그가 지정됩니다. 그 후, 염색질은 초음파 처리에 의해 가교되고 단편화됩니다. 그런 다음 태그가 지정된 유전자 자리는 면역침전되고 교차결합이 역전됩니다. 마지막으로, 분리된 염색질과 관련된 단백질 또는 RNA는 각각 질량 분광 분석 또는 RNA 염기서열분석 분석을 받습니다. 이 접근 방식을 통해 관심 게놈 영역과 관련된 단백질 및 RNA를 성공적으로 식별할 수 있습니다.

서론

관심의 특정 게놈 영역과 관련된 분자의 동정은 이러한 전사 및 후생 유전 학적 조절 게놈 기능 조절 메커니즘을 이해하기 위해 필요하다. 여러 기술들이 특정 게놈 영역 ^1-7의 생화학 적 분석을 위해 개발되었지만, 이들은 때문에 이러한 제한된 애플리케이션 (예에만 반복으로 높은 카피 수 궤적 또는 유전자좌에 대한)과 같은 그들의 본질적인 문제로,이 단계에서 널리 사용되지 너무 많은 시간과 노력이 필요합니다.

쉽게 특정 게놈 영역의 생화학 적 분석을 수행하기 위해, 우리는 ^14-17 개의 궤적 특정 염색질 면역 (칩) 기술, 즉 삽입 성 온칩 (iChIP) ^8-13 및 설계 DNA 결합 분자 매개 칩 (enChIP)을 개발했다 . iChIP에서 관심의 궤적이 같은 렉스와 같은 외래 DNA 결합 단백질의 삽입 인식 서열에 의해 태그가A. 궤적은 다음 태그 DNA 결합 단백질을 이용하여 친 화성 정제에 의해 격리됩니다. enChIP에서, 아연 손가락 단백질, 전사 활성제와 같은 (TAL) 단백질과 같은 DNA 결합 분자를 설계하고, 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR) 단지는 (그림 1) 관심의 궤적을 태그하는 데 사용됩니다. 그 후, 게놈 영역은 태그 DNA 결합 분자의 친 화성 정제에 의해 격리됩니다.

iChIP 위에 enChIP의 장점 중 하나는 외래 DNA 결합 단백질의 인식 서열의 삽입이 필요하지 않다는 것이다. Cas9 (dCas9)의 촉매 비활성 형태로 구성된 CRISPR 건물 및 가이드 RNA (gRNA)를 사용하여 궤적의 타겟팅 TAL 아연 손가락 단백질을 사용하여 iChIP 또는 enChIP에 의해이 지역의 대상보다 훨씬 쉽다. 여기서, 우리는 질량 분석 및 RNA 서열과 결합 enChIP 단계별 프로토콜을 서술 (RNA-SEQ)는 궤적-소시아를 식별테드 단백질과 RNA를 각각.

프로토콜

대상 궤적을 인식 엔지니어링 DNA 결합 분자의 1. 디자인

1. CRISPR 착체를 사용 enChIP 들어, 앞서 설명한 바와 같이 ¹⁸ 관심 게놈 영역 후보 gRNA 표적 서열을 확인하기 CRISPRdirect 웹 도구 (http://crispr.dbcls.jp)를 사용한다. 이 웹 도구는 형태의 23 bp의 게놈 사이트를 반환 5'-N ₍₂₀₎ NGG-3 '대상 지역 내.
2. U6 프로모터 서열 및 5'-N _(20)의 시퀀스를 사용하여 상용 서비스 5'-N ₂₀ NGG-3 '을 포함 gBlock 합성 ^{19, 20} (도 2 참조). 목적을 서브 클로닝, gBlock 외부 적당한 제한 효소 부위를 포함한다.
3. 이전 ^{16 설명} 된대로 적절한 벡터에 gBlock를 삽입합니다. gBlocks에 대한 몇 가지 레트로 바이러스 벡터는 (자료 참조)을 사용할 수 있습니다.
4. TAL 단백질을 사용 enChIP 들어 TARG 인식 TAL 단백질 설계등의 궤적. 상용 서비스를 사용 TAL 단백질을 암호화하는 플라스미드를 생성합니다. 앞서 설명한 바와 같은 ¹⁵ × 3의 FLAG와 같은 하나 또는 그 이상의 태그들과 융합 TAL 단백질을 포함하는 발현 벡터를 생성한다.

enChIP 분석을위한 세포의 2. 설립

1. 3 × FLAG-dCas9 및 gRNA (CRISPR 기반 절차) 또는 익스프레스 3 이전에 ^{14 ~ 17} 설명 된대로 × FLAG-TAL 세포 (TAL 단백질 기반의 절차가) 분석합니다.
   1. 형질 전환 효율이 높으면 일시적인 형질 감염을 사용한다. 3 × FLAG-dCas9 및 CMV 프로모터를 포함하는 발현 벡터 (자료 참조)를 사용할 수 있습니다.
   2. 일시적 트랜 스펙 션 효율이 낮은 경우에는 통상적 인 방법을 사용하여 안정한 형질 전환을 확립 고려한다. gBlock에 대한 상기 레트로 바이러스 벡터에 추가하여, 3 × FLAG-dCas9의 레트로 바이러스 벡터는 (자료 참조)을 사용할 수 있습니다.
2. 앞서 설명 된 바와 같이 ^14-17 항 FLAG 항체 (AB)를 사용하여 면역 블롯 분석에 의해 형질 감염된 세포에서 3xFLAG-dCas9 또는 3xFLAG-TAL 단백질의 발현을 확인한다.
   주 :이 태그 된 단백질의 발현과 같은 항 - FLAG-FITC 및 후속 FACS 분석으로 세포 염색에 의해 확인 될 수있다. 세포 내 염색을위한 프로토콜은 홈페이지 (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html)에서 다운로드 할 수 있습니다.
3. 표준 RT-PCR 기술에 의해 gRNA의 발현을 확인합니다.
4. 관심의 게놈 영역과 상호 작용하는 단백질의 정량 확인을 위해, 세포 배양 (SILAC) enChIP (enChIP-SILAC)와 결합 분석에 아미노산에 의해 안정 동위 원소 표지의 사용을 고려한다.
   참고 : SILAC 분석을위한 미디어는 상용 공급 업체에서 구입하실 수 있습니다. SILAC 특정 상호 작용을 검출하는 강력한입니다.
   1. SILAC 무거운 배지에서 배양 세포. 세포 cultu 준비음성 대조군으로 SILAC 광 매체에 빨간색. (무거운 또는 빛) 각 SILAC 매체 적어도 5 × 10 ⁷ 세포를 사용합니다. 효율적인 라벨은 모두 L- 라이신 - 2HCl, ¹³ C _6, L 아르기닌 - 염산, SILAC 중공업 미디어 ¹³ C _6, ¹⁵ N _4를 추가합니다. 참고 : 적어도 5 세포 분열이 라벨 단백질이 필요하다.
      1. 예를 들어, 안정적 라이신 2HCl 플러스 L- 아르기닌 - 염산 (라이트 배지) SILAC위한 DMEM 배지 및 투석 된 소 태아 혈청에서 37 ° C, 5 % CO _2에서 3xFLAG-dCas9 및 gRNA 발현 배양 인간 섬유 육종 HT1080 세포 또는 ¹³ C ₆ L- 라이신 - 2HCl 플러스 ¹³ C ₆ ¹⁵ N ₄ L 아르기닌 염산 (헤비 매체) ⁽¹⁶⁾ (자료 참조). 매체의 500 ml의 빛 또는 무거운 L- 라이신 - 2HCl과 L- 아르기닌 염산 50 mg을 추가합니다.
      2. 세포가 지수 growt을 유지하도록를 Trypsinize 및 replate 세포는 그들이 합류되기 전에시간.

포름 알데히드와 세포의 3. 가교

1. 현탁 배양 세포에서, 전사 2 × ¹⁰⁷ 3xFLAG-TAL 단백질 또는 3xFLAG-dCas9 플러스 gRNA을 발현하는 세포와 50 mL의 원심 분리 튜브에 일정한 배지 30 ㎖에 서스펜드. 이상의 셀이 사용될 때, 비례 시약의 양 및 양을 증가시킨다. SILAC 실험에, 무거운 매체 또는 광 매체 (5 × ¹⁰⁷ 세포 당)에서 배양 세포를 혼합하여 2 × ¹⁰⁷ 세포를 함유하는 튜브 (5)에 1 × ¹⁰⁸ 세포의 총 나눈다.
2. 세포 현탁액 (1 % 최종 농도)의 30 mL의 37 % 포름 알데히드의 810 μl를 첨가하고 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다. 부착 세포에 직접 배지 30 ㎖에 37 % 포름 알데히드 810 μl를 첨가하여 배양 접시에 세포를 고정한다.
3. 1.25 M 글리신 용액 (최종 농도 127 mM)을 3.1 mL를 첨가하여 가교를 중지실온에서 10 분 동안 품어.
4. 원심 분리 (4 ℃에서 5 분 300 ×의 G)에 의해 세포를 수집합니다. 조심스럽게 상층 액을 포함하여 포름 알데히드를 무시하고, 적절한 폐기 용기에 보관하십시오.
   1. 부착 세포의 경우, 50 ㎖ 튜브에서 셀 스크레이퍼로 세포를 수확 분리하고,이 단계에 기재된 바와 같이 세포를 수집한다.
   2. SILAC 실험에, 무거운 매체 또는 광 매체 (5 × ¹⁰⁷ 세포 당)로 배양 분리 세포를 혼합 2 × ¹⁰⁷ 세포를 함유하는 5 튜브에 1 × ¹⁰⁸ 세포의 전체를 분할하고, 이것에 기재된 바와 같이 세포를 수집 단계.
5. 튜브에 두 번 PBS의 30 mL를 세포 펠렛을 씻으십시오. 조심스럽게 포름 알데히드를 포함하여 상층 액을 제거하고 화학 물질 안전 지침에 따라 포름 알데히드 폐기물 bottle.Handle 적절한 폐기에 저장합니다. 고정 된 세포는 동결 및 -80 ℃에서 저장 될 수있다.

염색질 4. 준비 (당 2 × 10⁷ 세포)

1. 세포 용해 완충 용액 10 ㎖ (10 mM 트리스 (PH 8.0), 1 mM의 EDTA, 0.5 % IGEPAL의 CA-630, 그리고 1 × 프로테아제 억제제)에 고정 된 세포를 중단하고 10 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
2. 원심 분리기 샘플 (8 분 4 ° C에서 830 ×의 g)을 조심스럽게 상층 액을 버린다.
3. 핵 용해 완충액 10ml에 펠릿을 정지 (10 mM 트리스 (PH 8.0), 1 mM의 EDTA, 0.5 M의 NaCl, 1 % 트리톤 X-100, 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 0.5 % lauroylsarcosine 및 1X 프로테아제 억제제). 10 분 동안 얼음에 품어 모든 2 ~ 3 분 소용돌이.
4. (830 ×을 샘플을 원심 분리기 8 분 4 ° C에서 g)을 조심스럽게 상층 액을 버린다.
5. PBS 10ml에 펠렛을 씻으십시오. 펠렛 (염색질 분획)을 액체 질소에서 즉시 냉동 후 -80 ℃에서 저장 될 수있다.

염색질 5. 초음파 처리 (2 × 10 ⁷ 세포 당)

1. 800 μL의 염색질 부분을 일시 중단변성 용해 완충액 3 (10 mM 트리스 (PH 8.0), 1 mM의 EDTA, 150 mM의 염화나트륨, 0.1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 0.1 % SDS, 및 1X 프로테아제 억제제) 및 1.5 ㎖의 튜브에 옮긴다.
2. 출력 : (원료 참조) 초음파기를 이용하여 염색질 및 다음의 조건 (3)을 초음파 처리; 의무 : 100 % (연속) 시간 : 무료. 10 초 동안 초음파의 10-18 사이클을 수행하고 20 초 동안 얼음에 냉각. 과도한 난방을 피하기 2 분마다 5 ~ 6주기 동안 얼음에 샘플을 품어. 발포 방지하기 위해, 0.5 cm 튜브 바닥 상기 초음파 프로브의 선단의 위치를​​ 유지한다.
3. 원심 분리기에서 샘플 (10 분 동안 4 ℃에서 16,000 ×의 g) 및은 1.5 ML 튜브에 뜨는을 전송합니다. 초음파 염색질은 액체 질소에서 즉시 냉동 후 -80 ℃에서 저장 될 수있다.

염색질 조각화 6. 평가

1. 증류수 85 μL와 조각난 염색질의 10 μl를 섞는다.
2. 4 μl를 추가5 M의 NaCl 65 ° CO / N에 품어.
3. 10 ㎎ / ㎖의 RNase의 1 μl를 추가하고 45 분 동안 37 ° C에서 품어.
4. 의 0.5 M EDTA (pH 8.0), 1 M 트리스 (PH 6.8)의 4 μL, 20 mg을 1 μL / ㎖ 테 K 2 μl를 추가하고 1.5 시간 동안 45 ℃에서 배양한다.
5. 이러한 SYBR 그린과 같은 염색 염료를 포함하지 않는 1 % 아가 로스 겔에서 전기 영동에 의해 분리 된 샘플 10 μL.
6. 단편화 된 염색질의 길이의 분포를 평가하는 겔을 염색. 0.5 KBP (0.2-4 KBP의 범위)의 평균 길이를 생성 조건이 좋습니다.
7. 페놀 - 클로로포름 추출에 의해 또는 DNA 추출 키트 (자료를 참조)를 사용하여 나머지 샘플로부터 DNA를 정제 하였다. 정제 된 DNA는 enChIP 분석의 수율 (8.11 참조)를 추정하기 위해 입력 DNA로 사용할 수있다.

항체와 Dynabeads 공역 7. 준비 (2 × 10 ⁷ 세포 당)

1. 사전두 개의 1.5 ml의 튜브, 정상 마우스의 IgG를 사용하여 미리 청소 하나는 안티 - 플래그 Ab의와 배양을위한 다른 깎다. 각각의 튜브에 단백질 G - 복합 자석 구슬 150 μl를 (자료 참조)를 추가합니다.
2. 자석 스탠드에 튜브를 넣고 3 분을 기다립니다. 피펫으로 상층 액을 버린다.
3. PBS는 0.01 % 트윈 20 (PBS-T)를 함유하는 1 ㎖의 비드를 중단. 자기 스탠드에 튜브를 넣고 2 분 동안 기다립니다. 피펫으로 상층 액을 버리고, 다음 단계를 반복합니다.
4. 0.1 % BSA를 포함하는 PBS-T에 1 ㎖ 구슬을 정지.
5. 정상 마우스의 IgG 또는 안티 - 플래그 Ab의 15 μg의 추가 4 ° CO / N로 회전.
6. 다음, 간단히 스핀 다운 자석 스탠드에 튜브를 넣고 3 분을 기다립니다. 피펫으로 상층 액을 버린다.
7. PBS-T에 1 ㎖ 구슬을 정지. 샘플을 여러 번 전환 간단히 스핀 다운. 다음 피펫으로 상층 액을 버리고, 자석 스탠드에 튜브를 넣고 3 분을 기다립니다. 세탁을 반복PBS-T (세 세척 단계의 총)을 두 번 더.

8. 염색질 면역 침전 (2 × 10 ⁷ 세포 당)

1. 부피의 1/5 5 % 트리톤 X-100 (1 % 트리톤 X-100의 최종 농도)를 함유하는 개질 된 용해 완충액 (3)의 (약 200 μL)에 5.3에서 제조 단편화 염색질) (약 800 μL)을 혼합한다.
2. 일반 마우스 IgG가 결합 단백질 G - 복합 자석 구슬을 준비했다있는 튜브로 염색질 솔루션을 추가합니다. 1 시간 동안 4 ° C에서 회전합니다.
3. 자석 스탠드에 튜브를 넣고 3 분을 기다립니다.
4. 안티 - 플래그 Ab의와 결합 단백질 G - 복합 자석 구슬을 준비했다있는 튜브에 뜨는을 전송합니다. 4 ° CO / N로 돌립니다.
5. 자석 스탠드에 튜브를 넣고 3 분을 기다립니다. 피펫으로 상층 액을 버린다.
6. 저염 완충액 (20 mM 트리스 (PH 8.0), 2 mM의 EDTA, 150 mM의 염화나트륨, 1 % 트라이 1 ㎖에 구슬을 정지톤 X-100, 0.1 % SDS, 및 1X 프로테아제 억제제)과 5 분 동안 4 ℃에서 회전한다. 자석 스탠드에 튜브를 넣고 3 분을 기다립니다. 피펫으로 상층 액을 제거하고 세척 단계를 반복합니다.
7. 두 배 높은 소금 버퍼 (20 mM 트리스 (PH 8.0), 2 mM의 EDTA, 500 mM의 NaCl을, 1 % 트리톤 X-100, 0.1 % SDS, 및 1X 프로테아제 억제제)와 구슬을 씻으십시오.
8. 두번의 LiCl 완충액 (10 mM 트리스 (PH 8.0), 1 mM의 EDTA, 250 mM의 LiCl을, 0.5 % IGEPAL CA-630을, 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트 및 1X 프로테아제 억제제)과 비드를 세척 하였다.
9. 한 번 TBS-IGEPAL CA-630 (50 mM 트리스 (PH 7.5), 150 mM의 NaCl을, 0.1 % IGEPAL의 CA-630, 및 1X 프로테아제 억제제)와 구슬을 씻으십시오.
10. 용출 완충액 200 μL의 구슬을 정지 (50 mM 트리스 (PH 7.5), 150 mM의 염화나트륨, 0.1 % IGEPAL의 CA-630, 1X 프로테아제 억제제, 및 500 μg의 / ㎖ × 3 FLAG 펩티드)과는 37 ° C에서 배양 20 분. 자석 스탠드에 튜브를 넣고 3 분을 기다립니다. 새로운 1.5 ML 튜브에 뜨는을 전송하고 엘 루트를 반복이온 공정.
11. 페놀 - 클로로포름 추출에 의해 또는 DNA 추출 키트를 사용하여 용출의 DNA를 작은 부분에서 (예를 들면, 5 %)로 정제 (자료를 참조). 정제 된 DNA는 특정 프라이머 enChIP는 이전에 설명한 바와 같이 단계 ^{(14, 16)에서} 제조 한 6.7 입력 된 DNA와 비교하여 분석 수율을 추정하는 설정으로 PCR에 사용될 수있다.

9. SDS-PAGE, 염색 및 질량 분석

1. 1 2- 프로판올 용액, 3M 아세트산 나트륨 (PH 5.2) 50 μL, 20 ㎎ / ㎖의 5 μL의 글리코겐과 용출 (400 μL)를 혼합한다. -20 ° CO / N에서 염색질을 침전.
2. 원심 분리기 샘플 (30 분 4 ℃에서 16,000 ×의 g) 및 상층 액을 버린다. (10 분간 4 ℃에서 16,000 ×의 g)을 70 % 에탄올과 원심 분리기 다시 1 ㎖와 펠렛을 씻어. 피펫에 의해 완전히 상층 액을 버린다.
3. 배의 샘플 버퍼 (125 mM 트리스 (PH 6.8), 10 % (2) - 용병의 40 μL에 펠렛을 일시 중단aptoethanol, 4 % SDS, 10 % 수 크로즈, 및 0.004 % 브로 모 페놀 블루). 5 분 동안 소용돌이를 완전히 펠렛을 용해하고 단백질을 변성하고, 가교를 반대로 30 분 동안 100 ° C에서 배양.
4. 염료가 잘 1cm 이하에 도달 할 때까지에 대해 SDS-PAGE, 겔 시료 40 μL를 실행. 참고 : 보통 4~20% 구배 겔을 사용하지만, 다른 % 겔이 사용될 수있다.
5. 쿠마 브릴리언트 블루 또는 실버 얼룩 젤 얼룩.
6. 다섯 개 (2 mm 높이)에 젤을 잘라.
7. 앞서 설명한 바와 같이 ^13-16 겔 소화 질량 분석에서 수행한다.
8. 5 × 10 ⁷ 세포 각 (1 × 10 ⁸ 세포의 총)와 SILAC 실험의 경우, 2 배 샘플 버퍼의 40 μL의 초기 다섯 튜브 (그것을 확장 할 필요가 없습니다)에서 펠렛을 일시 중지합니다.

RNA와 RNA-서열 분석 (10) 정제

1. enChIP 후 RNA를 정화하기 위해,의 RNase 억제제의 5 U / ㎖를 추가 (SE완충 용액의 모든 전자 물질), 변성 용해 버퍼 (3) 및 용출 완충액의 RNase 억제제를 제외하는 40 U / ㎖를 추가한다.
2. 5 M NaCl을 16 μL로 용출액 (400 μL)를 혼합하고 2 시간 동안 65 ° C에서 품어.
3. 샘플 산 - 구 아니 디늄 - 페놀 계 시약 1 ㎖를 (자료 참조)를 추가합니다. 다음 15 초 동안 소용돌이와는 5 ~ 15 분 동안 실온에서 품어. 12,000 × g에서 및 RT에서 15 분 동안 샘플을 원심 분리기.
4. 새로운 1.5 ML 튜브에 뜨는을 전송하고 P-bromoanisole의 5 μl를 추가합니다. 다음 15 초 동안 소용돌이와는 3 ~ 5 분 동안 실온에서 품어. 12,000 × g에서 및 RT에서 10 분 동안 샘플을 원심 분리기.
5. 새로운 2 ㎖의 튜브에 상청 (약 1ml)에 전송하고, 2- 프로판올 1 ㎖를 추가한다. 튜브를 전환하고 10 분 동안 RT에서 배양한다. (자료 참조) RNA 정제 키트의 컬럼에 혼합물을로드합니다. 12,000 ×에서 1 분 동안 열을 원심 분리기 g 및 RT.
6. 빨래RNA 정제 키트에서 RNA 세척 버퍼 400 μL (자료 참조) 열입니다.
7. DNase의 I (1 U / μL), 10 ×의 DNase I 반응 버퍼의 8 μL, DNase의 /의 RNase없는 물 3 μL,와 RNA 세척 버퍼의 64 μL의 5 μL의 DNase의 나는 칵테일의 80 μl를 추가 (혼합물 컬럼 RNA 정제 키트 (자재) 참조). 15 분 동안 37 ℃에서 샘플을 인큐베이션 한 후 12,000 × g 및 RT에서 30 초간 원심 분리기.
8. 두 번 RNA 정제 키트에서 RNA 예비 세탁 버퍼 400 μL (자료 참조) 컬럼을 씻으십시오.
9. DNase의 /의 RNA 분해 효소가없는 물을 50 μL와 RNA를 용출시킨다. 용출 된 RNA는 RNA 서열에 대해 사용될 수있다.

결과

전반적으로, 대상 게놈 영역 1-30 %의. enChIP을 사용하여 정제 3 enChIP의 수율을 보여주는 대표적인 데이터를 포함도 할 수는 텔로미어와 인터페론 (IFN) 규제 요인 1 (IRF-1) 유전자의 프로모터를 대상으로 분석한다. 전형적인 결과, 표 1의 예로서 enChIP-SILAC 표에 의해 식별 IFNγ 특정 방식 IRF-1 프로모터와 연관 단백질 2에는, 질량 스펙트럼과 결합 enChIP 의해 식별 텔로미어 - 결합 단백질 (enChIP-MS) 그리고 표 3 enChIP-RNA-SEQ 의해 식별과 연관된 텔로미어의 RNA.

enChIP 1. 개요를 그림. enChIP 사용 CRISPR (A, B)와 TAL (C, D, E 강한>) 표시됩니다. 관심의 궤적은 TAL 단백질 또는 Cas9 (DCAS)의 촉매 비활성 형태로 이루어진 CRISPR 시스템으로서 설계 DNA 결합 분자 태그 및 (gRNA)에 RNA를 안내한다. 분자의 상호 작용은 포름 알데히드 또는 다른 가교제, 필요하다면 고정되어 있습니다. 이어서, 고정 된 염색질은 초음파 처리 또는 효소 절단에 의해 파편화된다. 태그 게놈 영역은 친 화성 정제에 의해 정제된다. 마지막으로, 가교가 반전되고, 상호 작용하는 분자 (게놈 지역의 RNA, 단백질)이 차세대 시퀀싱 및 질량 분석기를 사용하여 식별됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

gBlock 그림 2. 순서. U6 프로모터 (검은 색), G 염기 B는 efore 가이드 시퀀스 (파란색), 가이드 순서 (빨간색) (gRNA 스페이서), (녹색) 비계 순서, 및 (오렌지) 터미네이터 서열이 표시됩니다.

대표 enChIP 분석 3. 수익률 그림. 타겟 IRF-1 궤적과 비 표적 Sox2이 궤적에 대한 (A) 백분율 입력한다. 타겟 텔로미어 및 비 표적 γ-위성 대 (B)의 백분율 입력한다. 그림은 적응 이전 간행물 ^{(15, 16)에서} 수정되었습니다.

카테고리	단백질
전사	DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo의 동족체, PURβ, 활성화 된 RNA 중합 효소 II 전사 활성제 P15, BTF3, MYB가 결합단백질 1A
히스톤 탈 아세틸 화, corepressor ​​구성 요소	RBBP4, PA2G4, TBL3
아세틸	단백질 아르기닌 N-메틸화 된 1
DNA 토포 아이소 머라	DNA 토포 아이소 머라 제의 2α
히스톤	히스톤 H2A.Z, 히스톤 H3.2

표 1. enChIP-SILAC 의해 식별 IFNγ 특정 방식으로 인간 IRF-1 프로모터 영역과 연관된 단백질의 예는 테이블 ^{(16)로부터} 이전에 발행하도록 구성되었다.

카테고리	단백질
포유류 텔로미어 결합 단백질	PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1
텔로미어-BI효모에서 찾아내는 단백질 또는 다른 생물	IMP4
와 상호 작용하는 단백질 텔로미어가 결합 단백질 [관련 텔로미어 결합 단백질]	DNA 중합 효소 (α) (POLA1) Cdc13p] ARMC6 [(TRf2), CTBP1 [FOXP2-POT1] exportin-5 [3 급], GNL3L [TRF1] exportin -1- [TERT, 14-3-3 [TERT]
이질에 현지화 단백질	BEND3
단백질은 후생 유전 학적 마크를 조절	KDM5C
그 돌연변이 텔로미어의 기능에 영향을 미치는 단백질	DNA 중합 효소 (α) (POLA1), HAT1, Nup133, CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY, 글루타민산 염 시스테인 리가, glutaredoxin, SMRC1

표 2. enChIP-MS에 의해 식별 마우스 텔로미어와 관련된 단백질의 예로는 표 adapte왔다이전 발행 ¹⁵ D.

카테고리	RNA를
텔로 머라 제의 구성 요소	TERC, Rmrp
텔로미어 RNA를	TERRAs
scaRNAs	Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2
H / ACA snoRNAs	Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a
C / D snoRNAs	Snord17, Snord15a, Snord118
lncRNA	Neat1

표 3 :. enChIP이-RNA-서열 표는 이전 발행 ^17에서 적응 된 식별 마우스 텔로미어와 관련된 RNA를 예.

토론

여기에서는 CRISPR 시스템 및 TAL 단백질과 같은 조작된 DNA 결합 분자를 사용하여 특정 게놈 영역을 정제하고 이러한 게놈 영역에 결합된 단백질 및 RNA를 식별하는 방법을 설명합니다. 조작된 DNA 결합 분자의 게놈 결합은 뉴클레오솜 위치를 포함한 염색질 구조에 영향을 미칠 수 있으며 CRISPR 간섭 실험²¹에 설명된 바와 같이 게놈 기능을 폐지할 수 있습니다. 이러한 잠재적인 비정상적인 효과를 피하기 위해 우리는 표적 게놈 영역을 선택하기 위한 구체적인 지침을 제안합니다. 첫째, RNA 중합효소 및 전사 인자의 모집에 대한 잠재적 억제와 전사 시작 부위 주변의 뉴클레오솜 위치 파괴를 피하기 위해, 프로모터 영역 분석을 위한 표적 영역은 전사 시작 부위의 상류(5')에 있는 수백 개의 염기쌍이어야 합니다. 대조적으로, 인핸서 및 소음기와 같이 뚜렷한 경계를 가진 게놈 영역을 분석할 때 조작된 DNA 결합 분자의 결합이 기능에 영향을 미칠 가능성이 적기 때문에 이러한 영역에 직접 병치된 게놈 영역을 표적으로 삼을 수 있습니다. 또한, 중요한 DNA 결합 분자는 종종 진화적으로 보존된 영역에 결합하고 결합을 억제하면 표적 게놈 영역의 기능을 방해할 수 있기 때문에 서로 다른 종 간에 보존된 표적 영역을 사용하지 않는 것이 가장 좋습니다. 이와 관련하여 enChIP 분석에 사용되는 확립된 세포에서 표적 게놈 영역의 기능이 유지되는지 항상 확인해야 합니다. 여러 gRNA를 쉽게 테스트할 수 있고 서로 다른 표적 게놈 영역을 인식하는 여러 버전의 TAL 또는 아연 핑거 단백질을 생성하는 것이 지루하고 비용이 많이 들기 때문에 CRISPR을 사용하는 enChIP는 다른 단백질을 사용하는 enChIP보다 더 유리합니다.

dCas9는 표적 부위에 결합하는 것으로 나타났지만, 해당 부위에 대한 친화력은 표적 부위에 대한 친화력보다 약할 수 있습니다^22-25. 표적을 벗어난 부위에 결합된 분자의 오염을 관리하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 첫째, 여러 개, 적어도 두 개의 서로 다른 gRNA를 사용하는 것이 좋습니다. 별개의 gRNA를 사용하는 enChIP에서 일반적으로 관찰되는 분자는 진양성이 될 것입니다. 둘째, enChIP에 대한 다양한 조건을 비교하면 비특이적 분자 및 표적 외 부위에 결합된 분자의 오염을 상쇄하는 데 효과적일 것입니다. 이러한 비교 세트의 예로는 (i) 자극(-) 및 (+) 또는 (ii) T 세포 대 B 세포와 같은 다양한 세포 유형이 있습니다. 마지막으로, 후보 분자의 결합에 대한 정량적 분석을 수행하여 표적 부위에 대한 특정 결합을 확인해야 합니다. 음성 대조군으로서 dCas9만 발현하고 gRNA를 발현하지 않는 세포를 제조하는 것이 바람직하다.

enChIP 분석을 사용하여 특정 게놈 영역과 상호 작용하는 다수의 알려진 새로운 분자를 성공적으로 식별할 수 있었습니다(표 1-3)^14-17. 그러나 이 기술은 이러한 영역과 상호 작용하는 다른 알려진 단백질을 감지하지 못했습니다. 예를 들어, STAT1은 IFNγ 자극⁸ 시 IRF-1 프로모터와 결합하는 것으로 보고되었지만, 우리의 enChIP-SILAC 분석은 STAT1을 이 게놈 영역과 상호 작용하도록 유도된 단백질로 검출하지 못했습니다¹⁶. 또한, 텔로미어의 enChIP-MS 분석에서는 텔로미어와 상호 작용하는 것으로 나타난 TRF-1 및 TRF-2¹⁵로 구성된 쉘테린 단백질을 검출하지 못했습니다²⁶. 이러한 불일치에는 몇 가지 잠재적인 이유가 있습니다. 첫째, Stat1과 IRF-1 프로모터의 결합에 대한 화학량론은 매우 낮을 수 있습니다. enChIP-SILAC을 포함한 enChIP-MS가 표적 게놈 영역과 더 풍부하게 관련된 단백질을 검출하는 것이 합리적입니다. 따라서 이러한 단백질을 검출하려면 더 많은 세포의 분석이 필요할 수 있습니다. MS 기기의 민감도가 증가하면 화학량론적 결합이 낮은 단백질의 효율적인 검출에도 기여할 수 있습니다. 둘째, Stat1 및 쉘터린을 포함한 일부 단백질은 MS 분석의 어려운 표적이 될 수 있습니다. 셋째, 텔로미어 결합 단백질¹⁵에 대한 분석에서 텔로미어를 인식하는 3×FLAG-TAL 단백질(3×FN-Tel-TAL)은 경쟁적인 방식으로 텔로미어에 대한 쉘테린의 결합을 차단했을 수 있습니다.

enChIP를 사용하여 특정 게놈 영역에 결합하는 전사 인자를 검출하는 것이 상대적으로 어려운 것과는 대조적으로, enChIP 분석을 사용하여 히스톤 변형 효소와 같은 후성유전학적 조절자를 성공적으로 동정했습니다. 이 기술의 성공은 후성유전학적 조절인자가 광범위한 게놈 영역에 결합한다는 사실 때문일 수 있습니다. 따라서 게놈 영역당 더 많은 단백질을 MS에 사용할 수 있습니다. 후성유전학적 조절인자는 암과 같은 난치성 질환에 대한 약물의 중요한 표적으로 점점 더 인식되고 있기 때문에 enChIP는 후성유전학적 약물 표적을 식별하는 데 유용한 도구가 될 것입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
gBlock 합성 서비스	Life Technologies	Gene Synthesis by GeneArt
gBlock 합성 서비스	IDT (Integrated DNA Technologies)	gBlocks 유전자 단편
pSIR-neo	Addgene	51128
pSIR-GFP	Addgene	51134
pSIR-DsRed-Express2	Addgene	51135
pSIR-hCD2	Addgene	51143
TAL 합성 서비스	Life Technologies	GeneArt Precision TALs
3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1	Addgene	47948
3× FLAG-dCas9/pMXs-puro	Addgene	51240
3× FLAG-dCas9/pMXs-IG	Addgene	51258
3× FLAG-dCas9/pMXs-I2	Addgene	51259
3× FLAG-dCas9/pMXs-neo	Addgene	51260
anti-FLAG M2 Ab	Sigma-Aldrich	F1804
FITC-conjugated anti-FLAG M2	Sigma-Aldrich	F4049
DMEM medium for SILAC	Life Technologies	89985	다른 매체는 Life Technologies
Dialyzed FBS for SILAC	Life Technologies	89986
Life Technologies	의 경우 L-Lysine-2HCl	89987	Light medium
의 경우 L-Arginine-HCl SILAC	Life Technologies	경우 89989	Light medium
L-Lysine-2HCl, SILAC Life Technologies의 경우 13C6		89988	중형
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 SILAC	Life Technologies	경우 89990	중형 매체의
경우 완전, 미니, EDTA-free	Roche 진단	4693159
초음파 분열기 UD-201	Tomy Seiko
ChIP DNA Clean & 농축기	Zymo Research	D5205
Dynabeads-Protein G	Life Technologies	DB10004
RNasin Plus RNase Inhibitor	Promega	N2611
Isogen II	Nippon Gene	311-07361
Direct-zol RNA Miniprep kit	Zymo Research	R2050
LTQ Orbitrap Velos	Thermo Fisher Scientific		MS 분석을 위한 nanoLC-MS/MS 시스템의 구성 요소
nanoLC	Advance, Michrom Bioresources		MS 분석을 위한 nanoLC-MS/MS 시스템의 구성 요소
HTC-PAL 자동 시료 주입기	CTC 분석		MS 분석을 위한 nanoLC-MS/MS 시스템의 구성 요소