Method Article

Imaging- 및 유동 세포 계측법 기반의 셀 위치의 분석 및 3D 흑색 종 회전 타원체의 세포주기

DOI:

10.3791/53486

⸱

December 28th, 2015

 ,  ,  ,  , 
1The Centenary Institute, 2Sydney Medical School, University of Sydney, 3The University of Queensland Diamantina Institute, Translational Research Institute, The University of Queensland, 4Department of Dermatology, Royal Prince Alfred Hospital, 5Discipline of Dermatology, University of Sydney

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

형광 유비퀴틴화 세포 주기 지표(FUCCI)와 이미지 분석 또는 유세포 분석을 사용하여 3D 스페로이드의 내부 G1 정지 및 외부 증식 영역에서 세포를 식별하고 분리하는 두 가지 상호 보완적인 방법을 설명합니다.

Abstract

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3차원(3D) 종양 스페로이드는 기존의 2차원(2D) 세포 배양에 비해 생체 내 종양 미세환경의 보다 정확한 모델로 암 연구에 활용됩니다. 스페로이드 모델은 세포-세포 상호 작용, 저산소증 및 영양 결핍, 약물 침투의 영향을 모방할 수 있습니다. 이 모델의 한 가지 특징은 G1 정지 세포의 고리로 둘러싸인 괴사 코어의 발달이며, 스페로이드의 바깥 층에 증식하는 세포가 있습니다. 암 분야에서 흥미로운 것은 스페로이드의 다양한 영역이 약물 요법과 유전적 또는 환경적 조작에 어떻게 반응하는지입니다. 여기에서는 흑색종 스페로이드 내부의 위치와 관련하여 세포의 세포주기 상태를 특성화하기 위해 상용 소프트웨어를 사용한 세포 분석 및 이미지 분석과 함께 형광 유비퀴틴화 세포 주기 지표(FUCCI) 시스템의 사용에 대해 설명합니다. 이러한 방법은 시간이 지남에 따라 다양한 조건에서 종양 스페로이드의 다른 하위 영역에서 세포주기 상태, 유전자/단백질 발현 또는 세포 생존력의 변화를 추적하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

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다세포 차원 타원체는 그러나 그들이 많은 고형암에 대한 체외 모델로 일반적인 사용에 온 것이 최근이다, 수십 년 동안 종양 모델로 알려져있다. 그들은 점점 복잡, 고가이며 시간 소모적 인 비보 모델에서와 간단한 저비용 차원 단층 모델 1-6 사이의 중간으로 높은 처리량 약물 발견 화면에 사용하고있다. 2D 문화 연구는 종종 생체 내에서 복제 할 수 없습니다. 많은 종류의 암의 회전 타원체 모델은 성장 특성, 약물 감수성, 약물 침투, 세포 - 세포 상호 작용, 고형 종양 6-11 생체 내에서 볼 산소 및 영양분과 괴사 현상의 제한된 유용성을 모방 할 수있다. 스페 로이드는 회전 타원체 (7)의 주변부 괴사 코어, 코어를 둘러싸는 대기 또는 G1 체포 영역 및 세포 증식을 개발한다. 이들 영역의 개발세포 밀도, 증식 속도 및 회전 타원체 (12)의 크기에 따라 달라질 수있다. 그러나, 이들 서로 다른 서브 - 지역에서 보이는 세포 이질성은 암 치료 용 저항 (13, 14)에 기여할 수 있음을 가정하고있다. 따라서, 이들 영역에서 세포를 분석하는 기능은 별도 이해 종양 약물 반응에 중요하다.

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Protocol

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1. FUCCI 형질 도입 및 세포 배양

  1. FUCCI 전달
    1. 안정적으로 FUCCI을 표현 세포 라인을 만들기 이전에 7 설명한 바와 같이 렌티 바이러스 공동 전달을 사용 mKO2-hCdt1 (30-120) 및 MAG-hGem (1-100) (15)를 구성한다.
      참고 : FUCCI 시스템은 현재 상업적으로 사용할 수 있습니다.
    2. 단일 셀 정렬하여 밝은 형광과 서브 클론을 생성합니다. 96 웰 플레이트에 형광 활성화 세포 선별에 의한 AG 및 KO (노란색) 모두 긍정적 정렬 단셀은 앞서 설명 7,16.
  2. 흑색 종 세포 배양
    1. 문화 C8161 인간의 흑색 종 세포는 이전에 7,17을 설명했다.

2. 3D 회전 타원체의 형성 (로 이전 3,9 설명)

  1. 아가로 오스 플레이트 준비
    1. 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS) 또는 인산염 buffere 100 ml의 1.5 % 아가로 오스 (또는 귀금속 한천)를 용해소용돌이와 3 ~ 5 분 동안 전자 레인지에 끓는로 D 식염수 (PBS).....

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Results

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종양 구 상체를 제조하는 몇 가지 방법이 프로토콜은 세포가 아가 또는 아가로 오스 3,7,9에 배양 비 - 부착 성장 법을 사용있다. (1) 한천 3 일후 C8161 흑색 타원체의 일례를 도시한다. C8161의 타원체 (500)의 직경이 일반 크기의 타원체 형성 - 600 μm의 후 3 일 (= 565, SD = 19, N = 3을 의미). 타원체를 형성 할 다른 흑색 종 세포 라인은 다음과 같습니다 : WM793는, WM983C는, WM983B는, WM164는, 1205lu (이 셀 라인을 형성 타원체가 불규칙하고 19 밀도가 낮은 있습니다).

3D 타원체 모델 내의 개별 세포의 세포주기를 시각화하기 위해서, C8161 흑색 종 세포 FUCCI 시스템 7,15 형질 도입 하였다. 때문에 타원체의 큰 크기 (최대 아가로 오스 3 일 후에 직경 1mm 및 C8.......

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Discussion

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반 - 자동화 영상 분석은 내측 회전 타원체 G1 구속 영역을 식별하고, 외층 증식. 이 방법은 광학 부재를 이용하여 실시간 회전 타원체에 사용할 수도 있고, 고정 된 회전 타원체 부분에서, 서로 다른 영역에서의 세포주기하지만 (면역 통해) 마커의 발현, 세포 사멸 또는 세포 형태뿐만 아니라 변화를 식별하기. 다른 구형 영역 내의 세포 운동성은 정량화 될 수있다 - 셀 추적 이미지 분석 단계와 함께 라이브 촛점 시간 경과 화상이 추가되는 경우. 이미지 분석에 중요한 높은 품질의 Z- 조각 공 초점 이미지가 더 높은 해상도의 이미지는 세포보다 쉽게​​ 식별 할 수 있도록, 얻을 수 있다는 것입니다. 이미지 분석 한 제한은 핵이 너무 조밀 경우 제대로 모든 셀을 찾을 수 없다는 점, 또는 적색 및 녹색 강도가 너무 많은 편차가 존재하는 경우. (초기 G1)에 FUCCI 음성 세포,이 이미지 분석 방법 만 빨간색 (G1)에서 발견 할 수없는노란색 (초 S 상)과 녹색 (S / G2 / M). 여기에 설명 된 이미지 기반의 분석 방법.......

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Disclosures

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PerkinElmer는 출판 비용을 기부했습니다.

Acknowledgements

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기술 지원을 해주신 Ms. Danae Sharp와 Ms. Sheena Daignault에게 감사드립니다. FUCCI 구조를 제공해 주신 일본 와코시 RIKEN의 Atsushi Miyawaki 박사님께, 뛰어난 기술 지원을 제공해 주신 Centenary Institute의 Imaging and Flow Cytometry Facility에 세포주를 제공해 주신 필라델피아 Wistar Institute의 Meenhard Herlyn 박사님과 Patricia Brafford 씨께 감사드립니다. Volocity 소프트웨어 기술 지원에 대해 Chris Johnson 씨와 Andrew Barlow 박사에게 감사드립니다. N.K.H.는 호주 흑색종 및 피부암 연구소(Melanoma and Skin Cancer Research Institute)의 카메론 펠로우(Cameron Fellow)입니다. K.A.B.는 뉴사우스웨일즈 암 연구소(Cancer Institute New South Wales)의 펠로우입니다(13/ECF/1-39). W.W.는 뉴사우스웨일즈 암 연구소(Cancer Institute New South Wales)의 펠로우입니다(11/CDF/3-39). 이 작업은 프로젝트 보조금 RG 09-08 및 RG 13-06(뉴사우스웨일즈 암 위원회), 570778 및 1051996(우선 순위 기반 협력....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
아가로스 저융점Life Technologies16520-050
고귀한 아가르 분할용 SigmaA5431페로이드 제작
용 아가로스Fisher ScientificBP1356-100스페로이드 제조용
0.05% 트립신/EDTALife Technologies25300-054
HBSSLife Technologies14175-103
10% 포르말린SigmaHT5014-1CS주의 : 유해하고 부식성이 있습니다. 개인 보호 장비를 사용하십시오, 하십시오   숨을 쉬지 않습니다 (연기 찬장에서 열려).
IR LifeTechnologiesL10119
vibratomeTechnical Products International, Inc
쿨쳐 컵Thermo-Fisher ScientificSIE936스페로이드 혈구계 절편용 금형
SigmaZ359629
96-well 조직 배양 플레이트InvitroFAL353072
콜라겐분해시그마C5138 
컨 포칼 현미경LeicaTCS SP5
유세포 분석기Becton DickinsonLSRFortessa
volocityPerkinElmer이미징 소프트웨어
flowjoTree Star유세포 분석 소프트웨어
진공 그리스시그마Z273554
마운팅 미디어벡터 LaboratoriesH1000
FUCCI (commercial constructs)Life TechnologiesP36238Transient transfection only
Cell strainer 70 μ mIn VitroFAL352350
둥근 바닥 5ml 튜브 (멸균)In VitroFAL352003
둥근 바닥 5ml 튜브 (비 멸균)In VitroFAL352008
스효소

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 7, 819-830 (2012).
  2. Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. Modeling Melanoma In Vitro and In Vivo. Health....

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Tags

3D Melanoma SpheroidsCell Cycle AnalysisFlow CytometryFUCCI SystemConfocal ImagingImage AnalysisCell Position TrackingSpheroid SectioningNecrotic CoreProliferating Cells

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