방법 논문

공액 고분자에 의해 세포를 전기적 활동을 생활의 광 제어

DOI:

10.3791/53494

⸱

2016년 1월 28일

 ,  ,  ,  , 
1Center for Nano Science and Technology @PoliMi, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Dipartimento di Fisica, Politecnico di Milano

이 논문에서

요약

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유기 반도체 폴리머의 사용을 기반으로 가시광선으로 체외 세포 배양 전기 활성을 자극하는 방법이 설명됩니다.

초록

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유기 반도체와 생체 조직 간의 하이브리드 인터페이스는 in-vitro 및 in-vivo 응용 프로그램을 위한 새로운 도구를 나타냅니다. 특히, 공액 고분자는 우수한 생체 적합성, 우수한 기계적 특성, 저렴하고 쉬운 가공 기술, 가볍고 얇고 유연한 기판에 증착 가능성과 같은 생물학적 시스템의 기판으로서 몇 가지 최적의 특성을 나타냅니다. 이러한 재료는 신경 프로브, 신경 활동의 여기 및 기록을 위한 트랜지스터, 약물 방출을 위한 바이오센서 및 액추에이터와 같은 세포 인터페이스에 사용되었습니다. 최근의 실험은 또한 세포의 전기적 활동의 전광학적 변조를 위해 공액 폴리머를 사용할 수 있는 가능성을 보여주었습니다. 1차 신경 세포, 성상 세포 및 2차 라인 세포를 포함한 여러 체외 연구 사례가 보고되었습니다. 또한, 유기 고분자에 의해 매개되는 신호 광전달은 퇴화된 망막에서 광 민감도를 회복시키는 것으로 나타났으며, 이는 이러한 장치가 향후 인공 망막 보철물에 사용될 수 있음을 시사합니다. 대체로 빛에 민감한 복합 고분자는 세포 활동의 광학 변조를 위한 새로운 접근 방식을 나타냅니다.

이 작업에서는 살아있는 세포의 광 여기를 위한 생체 고분자 계면을 제작하는 데 필요한 모든 단계를 설명합니다. 활성 계면의 기능은 빛 자극을 세포막 전위의 조절로 변환하는 것입니다. 체외 연구에 유용한 연구 사례로, 폴리티오펜 박막을 기능성 흡수층으로 사용하고, 인간 배아 신장(HEK-293) 세포를 계면의 생물학적 구성 요소로 사용합니다. 서로 다른 지속 시간의 광 펄스로 자극할 때 세포막 전위를 성공적으로 제어하는 실제 사례가 제공됩니다. 특히, 세포막에 대한 탈분극 및 과분극 효과는 모두 광 자극의 지속 시간에 따라 달성될 수 있음을 보여줍니다. 보고된 프로토콜은 일반적으로 유효하며 다른 생물학적 제제로 간단하게 확장될 수 있습니다.

서론

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정확한 공간 및 시간 해상도를 갖는 세포 활성을 조작 할 가능성이 신경 과학 연구 및 신경 및 정신 장애의 치료에있어서 중요한 방법을 나타낸다. (1) 전통적인 방법은 근접 또는 접촉 위치 된 전극을 이용하여 세포의 전기 자극에 기초 (생체 내 뇌 조직, 단일 셀, 셀룰러 네트워크, 뇌 조각) 다른 복잡성이 될 수있는 대상 시스템, 2. 과거 세기 동안에는, 패치 클램프, 금속 기판 전극 일체형의 사용은 생리학 및 단일 뉴런 및 신경 네트워크의 작동 메커니즘의 병태 생리의 상세한 그림을 제공했다. 그러나, 전기 자극은 중요한 제한에서 겪고있다. 첫번째 인해 쉽게 적응 될 수없는 고정 된 전극 및 그들의 형상의 물리적 치수에 일반적으로 열악한 공간 분해능에 관한 것이다생체 조직 같은 복잡한 조직 시스템. 또한, 전극 임피던스 자극 및 기록 시스템 사이의 크로스 토크 (cross-talk)의 관련 문제는 측정의 최종 신호 대 잡음비를 저하 할 수있다. (3) 한편, 자극 광의 사용은 많은 한계를 극복하는 데 도움이 될 전기 접근. 우선, 그것이 가능한 특정 세포 유형 또는 서브 셀 구획을 대상으로 만들고, 전례없는 공간 (<1 ㎛) 및 시간 해상도 (<1 밀리 초)를 제공한다. 그것은 관심의 조직과 물리적 접촉을 방지하고 녹화에서 자극을 disentangles 때문에 또한 그것은 매우 비 침습적이다. 또한, 광 강도와 파장 모두 정확하게 조절 될 수 있고, 따라서 다양한 자극 프로토콜을 적용 할 수있다. 3,4

그러나 동물 세포의 대부분은 광에 특정 감도를 제시하지 않는다. 광학 stimulatio을위한 몇 가지 전략N 따라서, 어느 근처 또는 셀들 내에 감광 분자 매개체를 이용하거나, 상기 셀에 가까운 외부에 배치 된 광활성 소자를 이용하는 제안되어있다. 전 카테고리가 표시 또는 적외선 (IR​​) 등을 통해 자극뿐만 아니라, 광분해 / 광 이성화 화합물 또는 감광성 고분자 액추에이터 (optogenetics)의 유전 적 표현 중 하나를 사용하는 등의 내생 적 메커니즘을 의미한다. 후자의 클래스는 무기 나노 / 마이크로 입자 또는 감광 실리콘 기판의 사용에 의해 달성 외인성 자극하기위한 기술을 포함한다. 5 역시, 이러한 모든 시스템들은 밝은 측면과 단점이있다. 특히, 가시 범위에서 세포의 내인성 흡수 약하고을 안정적이며, 반응성 산소 종의 발생을 수반하는 세포에 유해 할 수있다. 일반적으로, IR은 흡습에 의한 로컬 열 유도 가열을 위해 사용되지만, 물 흡광 계수는 따라서 성을 필요로하는 작고표준 현미경 광학을 통해 제공 할 및 생체 응용 프로그램에 대한 안전 문제를 일으킬 수 어렵다 (수십에서 W / mm 2의 수백) 룽 적외선. 한편, 광 스위칭 caging 화합물은 시간 제한 동작을 종종 인해 제한된 조직 침투를 제공하기 어렵다 UV 광을 필요로한다. 또한 그들은 조명 영역 외부 광분해에 따라 활성화 된 화합물의 확산 문제를 겪고 있습니다. 마지막으로, optogenetic 도구는 특정 세포 모집단 및 하위 구획을 대상으로 과학자를 허용하고 신속하게 신경 과학적 연구의 핵심 기술 중 하나로 부상하고있다. 그러나, 바이러스 성 벡터를 통해 외래 DNA 세그먼트를 삽입하는 것은 특히 인간 환자에 채택의 관점에서, 중요한 안전 문제를 제기한다. 이러한 이유로 5, 6, 세포 광학 조작 할 수있는 새로운 재료와 장치에 대한 연구는 매우 뜨거운 주제입니다.

최근, 새로운효율적으로 세포의 전기적 활성도 조절에 광 자극 형질 도입 할 감광 공액 폴리머의 사용에 기초한 접근법이 제안되었다. 7 그들은, 생체 적합성 부드럽고 컨 포멀하고 기계적 유연성은 조직과 친밀한 인터페이스를 할 수 있습니다, 그들은 가시 광선 영역에서 빛을 본질적으로 구분 : 폴리머 광 여기에 의한 세포 자극 (CSPP는) 기술은 전형적인 유기 반도체의 많은 주요-수 있도록 기능을 이용 시험관 내 및 생체 8-10 둘. 그 외에도, 그들은 쉽게 더 나은 프로빙과 능력을 감지, 특정 여기 수 있도록 살아있는 세포와 인터페이스에 적응하고 작용 될 수있다. (11, 12)는 또한, 그들은 조합에 이상적, 이온 수송뿐만 아니라 전자 지원 전자 광고 생물학. 흥미롭게 13,14, 이들은 외부 바이어스 F를 적용 할 필요가 없도록, 광전지 모드에서 작업 할또는 효율적인 세포 광 자극. (15)

CSPP 기술의 신뢰도는 이전 차 뉴런 15,16 아스트로 17 이차 전지 라인 (18) 및 이식 된 망막 조직을 포함하여, 몇몇 시스템에서 입증되었다.이 연구에서 16 필요한 단계는 감광 바이오 폴리머를 제조하는데 시험관 시스템의 광 자극에 대한 인터페이스 (19)가 상세하게 설명된다. 역할을 전자 공여체로서 기능 연구의 경우, 지역과 일반 폴리 (3- 헥 실티 오펜)의 전형적인 유기 PV 블렌드 (RR-P3HT), 및 페닐 C61 - 뷰티 산 메틸 에스테르 (PCBM)뿐만 전자 수용체가 사용된다. 생물학적 시스템으로, 인간 배아 신장 (HEK-293) 세포를 사용한다. 전기 생리 학적 측정을 통해 세포 활동의 상대적으로 기록 photostimulation 프로토콜의 예를 제공한다.

기술 플랫폼그러나 일반적으로 유효하며, 용이하게 적절히 세포 배양 프로토콜 변경 요청 절차와 시간을 도금함으로써, 서로 다른 세포 유형 ((제대로 용액 제조 방법 및 증착 변수를 조정함으로써) 다른 공액 중합체의 용도로 확장 될 수있다 세포 파종 및 확산) 및 다른 자극 프로토콜 (빛의 파장, 자극 빈도 및 기간, 광 여기 밀도)를 참조하십시오.

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프로토콜

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광활성 기판 1. 준비

  1. P3HT 준비 : PCBM 솔루션 : 클로로 벤젠 (1 W / W 1) 20g / L의 P3HT 농도. 60 ℃에서 적어도 4 시간 동안 자석 교반기와 용액을 혼합한다. 각각의 기판이 제조 될 때까지 용액을 150 μL의 부피를 고려한다.
  2. 청소 ITO 코팅 유리 슬라이드 초음파기에 탈 물, 아세톤 및 이소프로판올의 연속 욕조 (R S = 10 Ω / 평방, 18 × 18 mm 2, 두께 170 μm의) (각 단계에 대한 10 분). 질소 총을 커버 슬립을 건조. 10 분 동안 100 W의 전력으로 플라즈마 클리너의 샘플을 넣습니다.
  3. 스핀 코팅을 통해 기판에 세정 활성층의 박막을 증착.
    1. 다이아몬드 팁, ITO 코팅 된 기판의 동일한 측 방향 치수 현미경 유리 슬라이드 (≈ 두께 1mm)를 자른다. 핫 플레이트에서 PCBM 솔루션을하고 주위 온도로 냉각 보자 P3HT를 제거합니다.
    2. 두 번째 설정EPS 스핀 코터 프로그램 : I) 800 rpm에서 30 초; ⅱ) 1,600 rpm에서 30 초. 스핀 코터의 척에 슬라이드를 삽입하고 그것을 해결하기 위해 진공을 시작합니다. ITO 코팅 된면이 위쪽을 향하게하여 슬라이드에 아세톤 드롭 한 후 청소 기판을 넣습니다. 과량의 아세톤을 제거하는 스핀 코터의 회전을 시작합니다.
    3. 기판 상 PCBM 용액을 다시 스핀 코터 (1.3.2에 설명 된 것과 동일한 프로토콜을 사용하여) 시작 : P3HT 150 μL 넣어.
    4. 스핀 코터를 완료 한 후, 샘플을주의 깊게 제거하고 유리 슬라이드에서 코팅 된 기판을 분리. 아세톤에 담근 클린 룸 면봉 기판의 뒷면을 청소합니다.
      주 : 사용까지 광활성 기판은 어두운 박스에서 몇 일 동안 저장 될 수있다. 오랜 기간 동안, 불활성 가스와 글러브 박스에 보관하십시오.

세포 배양 매체 및 전기 생리학 솔루션 2. 준비

  1. 전체 성장 매체 (CGM)에 대한 준비HEK-293 세포 : 둘 베코 이글의 중간 열 불 활성화되지 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 μg의가 / ml의 스트렙토 마이신이 보충 된 (DMEM)을 수정. 4 ℃에서 0.2 ㎛의 여과 시스템 및 저장 매체와 살균.
  2. (135)의 NaCl, 5.4의 KCl, 5 HEPES, 10 포도당, 1.8 염화칼슘 2, 1의 MgCl 2 : 초순수 (MM의 농도)의 세포 외 솔루션을 준비합니다. NaOH로 7.4으로 산도를 조정합니다. 4 ° C에서 0.2 μm의 여과 시스템 및 저장소와 솔루션을 소독.
  3. (MM의 농도) 세포 내 초순수 용액 준비 : (12)의 KCl, 125 K 글루코 네이트를, 1의 MgCl 2, 0.1 염화칼슘 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-나 2. ATP-나 2 열 구분합니다 마지막에 추가합니다. NaOH로 7.4으로 산도를 조정합니다. -20 ℃에서 0.2 ㎛의 여과 시스템을 가진 용액, 1 mL의 분취 액 튜브 저장 살균.

3. 도금 HEK-293 세포활성 기판에

  1. 유리 비커 알루미늄 또는 밀폐 된 배양 접시로 덮고 멸균 2 시간 동안 120 ℃의 오븐에 넣어의 광활성 기판을 놓습니다. 이후이 순간부터, 멸균 조건에서 모든 작업을 수행 할 수 있습니다. 멸균 후드에 샘플을 넣고 그들이 진정하자.
  2. 코트 접착층과 광활성 기판 표면의 소수성을 감소 및 세포 부착을 촉진하기 위해.
    1. P35 페트리 접시에서 활성 기판 또는 6 멀티 웰 플레이트를 놓습니다. 공액 고분자 층의 소수성을 감안할 때, 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)을 잘 샘플을 수정하고 솔루션을 제한 할 수 있습니다.
      1. 점성 슬러리를 얻었다 유리막 1 비율 : 10 PDMS와 촉매를 혼합한다.
      2. 각 웰의 절반을 커버하기에 충분한 양의 분배, 멀티 웰 플레이트 (6)에 슬러리를 붓는다.
      3. 실온에서 PDMS 중합 기다립니다.
      4. obta에 대한 중간에 경화 된 PDMS를 잘라중합체 샘플의 동일한 크기의 사각형 모양 ining.
      5. 적어도 30 분 동안 70 %의 에탄올 - 물 혼합물에 침지하여 PDMS 웰 멸균.
    2. 잘 PDMS를 사용하는 경우, 웰 세포 배양 한 후 PDMS를 제거 할 때, 전체 층의 박리를 방지하기 위해, 뾰족한 핀셋 웰의 전체 국경 광활성 층을 긁어.
    3. 피브로넥틴 용액 (PBS에 2 ㎎ / ℓ)을 각각의 샘플의 전체 표면을 커버. PDMS 잘 (:의 15x15 mm 2 잘 명확면)을 사용하는 경우 샘플 당 500-750 μL 사이의 볼륨은 충분합니다. 잘 PDMS없이 피브로넥틴 용액을 약 2 ㎖의 샘플을 완전히 젖어 필요한; 솔루션을 추가하는 동안 기판이 부유하지 않음을주의하십시오. 적어도 1 시간 동안 37 ℃에서 샘플을 배양한다.
    4. 유리 피펫 피브로넥틴 용액을 제거하고 PBS 용액으로 2 회 세척 하였다.
  3. 경기 수15,000 세포 / 완전 성장 배지에서 2 cm의 밀도 피브로넥틴 처리 된 샘플들에 HEK-293 세포를 먹었다. 사용 잘 PDMS, 그렇지 않으면 2 ~ 3 ml의 CGM의 필요, 각 샘플에 대해 CGM의 750-1,000 μL의 볼륨을 사용합니다. 24-48 시간 동안 CO 2, 37 ℃에서 세포를 배양한다 5 %.

4. 광 자극 프로토콜 및 전기 생리 측정

  1. thermalize 37 ℃의 물을 욕조에 세포 외 용액을 넣어; 세포 내 솔루션을 해동 34 게이지 바늘로 1 ML의 주사기에 넣어와 ATP의 저하를 방지하기 위해 얼음과 접촉을 유지.
  2. 조심스럽게 PDMS를 제거 잘 존재하는 경우, 인큐베이터에서 세포 코팅 된 기판을 가져 가라. 유리 피펫으로 성장 배지를 제거하고 세포 외 용액과 샘플을 헹군다. 세포 분리를 피하기 위해 천천히 진행.
  3. 세포 외 solutio와 전기 생리학 단말기의 샘플 홀더에 넣어 장치n 및 기준 전극. 풀러와 패치 클램프 신선한 유리 마이크로 피펫을 준비합니다 (이상적인 저항하는 범위 2-4 MΩ이다). 세포 내 용액을 피펫의 절반을 작성하고이를 미세 조작기에 탑재합니다.
  4. 장치에 패치를 건강한 세포를 찾습니다. 광활성 기판의 불필요한 자극을 피하기 위해, 현미경 일루미네이터 앞에 장파장 통과 필터 (예를 들어, 절단 파장 λ = 750 nm의 가시광 흡수 중합체를 사용할 수있다)를 배치하는, 이미징 IR 조명을 사용한다.
  5. 선택된 셀을 패치 현미경 (도 1)의 형광의 여기 경로를 통해 샘플에 빛을 제공하여 광 자극에 대한 바람직한 프로토콜을 적용한다. 패치 - 클램프 프로토콜의 상세한 설명은 레퍼런스 20에서 찾을 수있다.
    1. 마이크로 미터 매니퓰레이터와 세포막에 근접 패치 피펫을 위치. 위치 동안 overpressur 적용순서대로 피펫에 E는 팁에 먼지 부착을 방지 할 수 있습니다. 피펫은 셀 위의 몇 미크론해야한다.
    2. 패치 제어 소프트웨어에 피펫 저항을 제어하면서 세포막 피펫을 향해 하강 시작. 피펫 저항은 대략 1 MΩ 증가되면 피펫 및 세포막 사이에 기가 시일을 형성하기 위해, 부드러운 흡입을인가하면서, 피펫에서 과압을 제거 (즉, 측정 된 저항이 1 GΩ보다 큰 값으로 증가한다) .
    3. 봉인을 안정화하기 위해 전위 (HEK293 -40의 잠재력을 셀 MV를 사용할 수 있습니다) 휴식 예상 세포에 가까운 피펫에 부정적인 잠재력을 적용합니다. 인해 패치 증폭기 및 / 또는 패치 제어 소프트웨어에 대하여 명령 피펫 커패시턴스 용량 과도를 보상한다.
    4. 짧고 강렬한 흡입 펄스를인가함으로써 세포질에 전기적 접속을 허용하는 멤브레인을 깰피펫에. 세포막 전위를 추적 (세포 내로 주입없이 전류, 즉 I = 0) 전류 클램프 모드 패치 증폭기를 설정한다. 셀 가능성이 안정되어 있는지 확인하기 위해 몇 분 정도 기다립니다.
    5. 셀에 원하는 조명 프로토콜을 적용하고, 막 전위에 대한 영향을 기록한다.
      주 : 조명 현미경 구조에 따라, 하부 또는 상부로부터 하나의 샘플로 전달 될 수있다.
      1. 물론 활성 물질에 의해 흡수되어 여기 파장을 선택; P3HT의 경우 : PCBM 블렌드 4백50에서 6백까지 nm의 범위에서 파장이 사용될 수있다. 적합한 광 여기 밀도는 10 ~ 100 mW의 범위 / mm 2이다.
        참고 : 결과 (10 ~ 20 밀리 초 이하) 빛의 짧은 펄스를 셀의 일시적인 탈분극에 장시간 조명하면서 빛이 꺼질 때까지 지속 과분극이 관찰된다 (밀리 초 이상 펄스 수백).

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결과

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세포는 P3HT에 쉽게 배양 할 수 있습니다 : PCBM 기판 (설명 프로토콜의 단계 3.2에서 사용되는 피브로넥틴 같은) 적절한 접착 층이 증착되는 것을 제공했다. P3HT : 가시 스펙트럼의 녹색 부분 PCBM 광 흡수 피크; 그러나 다른 감광 공액 중합체는 바람직한 photostimulation 파장 범위 (도 2)에 따라, 선택 될 수있다. . PCBM 막이 도시되어 이들 기판의 생체 적합성은 단지 세포주 뉴런 (15) 및 성상 세포의 일차 배양 물과 같은 HEK-293과 같은 18,21하지만 17 P3HT 배양 건강 HEK-293 세포의 전형적인 현미경으로 입증되었다 도 3. 광활성 기판에 의해 매개되는 세포의 광 자극은 빛 자극 지속 기간에 따라 세포막에 다른 효과가 발생할 수있다. (18)를 광 펄스의 개시시에,(3 M...

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토론

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셀의 광 자극이 주로 감광성 중합체의 선택, 열 살균 파라미터, 광 강도와 자극 시간 염려 체외 대한보고 프로토콜의 중요한 단계. P3HT : 그것은 좋은 시간과 전기 화학적 안정성을 보장하기 때문에 PCBM 박막, 여기에 선정되었다. 그러나, 하나는 모든 감광성 중합체는 조명에보다 구체적으로, (22)를 아날로그 성능을 제공 할 수 있음을 주목해야한다. 또한,이 때의 파라미터는 중합체 광전자 상당한 기능 저하로 연결되지 않는 열 살균을 선택; 그러나주의 경우 살균 법 또는 열처리 매개 변수 변경, 즉, 중합체 특성에 대한 가능한 효과를주의 깊게 평가되어야한다. 또, 공지 된 예를 들면, UV 노광이 빠르게 인해 접합 손실 비가역 중합체 표백 열화로 연결된다. 또한, 다른 어닐링온도 및 시간은, 전하 수송 특성에 부정적인 영향으로, 중합체 표면의 서로 다른 형태 적 순서로 이어질 수있다. 광 여기 프로토콜의 매개 변수는주의 깊게뿐만 아니라 평가되어야한다 : 100 mW의 /

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 작업은 FP7-PEOPLE-212-ITN 316832-OLIMPIA 프로젝트를 통해 EU의 지원을 받았습니다.

Telethon - 이탈리아 (GGP12033 및 GGP14022 부여), Fondazione Cariplo (보조금 ID 2013-0738).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
rr-P3HT시그마 알드리치698989-5G
ITO 코팅 기판나노-CSIT10300100
피브로넥틴시그마 알드리치F1141
클로로벤젠시그마 알드리치319996
PCBM나노-C나노-CPCBM-BF
아세톤 시그마 알드리치270725
이소프로필 알코올시그마 알드리치563935
HEK 세포LGC 표준 srlATCC-CRL-1573
HEPES시그마 알드리치H0887
PBS시그마 알드리치P5244
E-MEMLGC 표준 srlATCC-30-2003
EDTA시그마 AldrichE8008-FBS
LGC 표준 srlATCC-30-2020

참고문헌

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