레이저에 의한 맥락막 신생 혈관에 대한 마우스 모델

Summary

여기에서는 신생혈관 연령 관련 황반변성(AMD)의 혈관 특징을 재현하는 실험 모델인 마우스 레이저 유도 맥락막 신생혈관화(CNV) 프로토콜을 제시합니다. 일단 마스터하면 다양한 실험 측정을 테스트하기 위한 모델 시스템으로 CNV를 안정적이고 효과적으로 유도할 수 있습니다.

Abstract

마우스 레이저 유도 맥락막 신생혈관형성술(CNV) 모델은 신생혈관 연령 관련 황반변성(AMD) 연구의 중요한 주류 모델이었습니다. RPE와 Bruch's membrane에 표적 레이저 손상을 투여함으로써 이 절차는 혈관 신생을 유도하여 신생혈관 AMD에서 관찰되는 특징적인 병리학을 모델링합니다.

인간이 아닌 영장류에서 처음 개발된 레이저 유도 CNV 모델은 다른 많은 종에도 구현되었으며, 그 중 가장 최근에는 쥐가 있습니다. 마우스 실험은 유리하게 더 비용 효율적이고, 실험은 훨씬 더 빠른 타임라인에서 실행될 수 있으며, 다양한 형질전환 모델을 사용할 수 있습니다. 그러나 마우스 눈의 소형 크기는 절차를 수행할 때 특별한 문제를 제기합니다. 망막을 시각화하기 위해 눈을 조작하려면 레이저를 작동하기 위한 손-눈-발 동시 협응력뿐만 아니라 정교한 손재주 기술의 연습이 필요합니다. 그러나 일단 숙달되면 이 모델을 적용하여 분자 메커니즘, 유전자 조작의 영향 및 약물 치료 효과와 같은 신생혈관 AMD의 여러 측면을 연구할 수 있습니다.

레이저에 의한 CNV 모델은 유용하기는 하지만, 이 질병에 대한 완벽한 모델은 아닙니다. 야생형 생쥐의 눈은 그렇지 않으면 건강하며, 맥락막-망막 환경은 인간 AMD의 병리학적 변화를 모방하지 않습니다. 또한, 손상에 의한 혈관신생은 AMD에서와 같이 노화 관련 및 만성 질환 상태에서 발생하는 혈관신생과 동일한 경로를 반영하지 않습니다.

단점에도 불구하고 레이저 유도 CNV 모델은 신생혈관 AMD의 쇠약 병리학을 연구하는 데 현재 사용할 수 있는 가장 좋은 방법 중 하나입니다. 이 요법의 구현은 AMD의 발병 기전에 대한 더 깊은 이해로 이어졌을 뿐만 아니라 현재 사용 가능한 많은 AMD 치료법의 개발에 기여했습니다.

Introduction

연령 관련 황반변 성 (AMD)는 50 ^{~ 3} 세 이상의 개인 실명의 주요 원인 중 하나입니다. AMD는 두 가지 형태로 분류 할 수있다 : 위축성 ( "건조") AMD와 신생 혈관 ( "습식") AMD. 전자는 후자의 누설, 출혈 및 섬유증을 유발하는 외부 망막 층으로 맥락막에서 비정상적인 혈관의 침윤을 특징으로하면서, 망막 색소 상피 (RPE), 맥락막 모세, 감광체의 지리적 위축을 특징으로하고, 궁극적 실명 ^1,2 선도. 2 가지 형태로, 혈관 신생 AMD는 시력 상실 ^(1)의 대부분을 차지한다. 그것의 위축 대응은 의학적 치료 ^(3)을 입증 반면 다행히,이 형태는 다수의 효과적인 약물 관리 옵션이 없습니다. 신생 혈관은 쉽게 형태의 동물 모델에서 다시 항복되었으므로 더욱이, 그것은 기본적 접근에 더 넓게왔다소설 요법 ^(4)를 개발하기 위해 기본 병리학 적 메커니즘을 탐구 MD의 연구.

실험 맥락막 신생 혈관의 첫 번째 동물 모델은 라이언 등의 알에 의해 개발되었다. 인간이 아닌 영장류 ^5. 신생 혈관 AMD에서 본 것과 유사한 결과 혈관 로컬 염증 반응을 야기 광응고술 통해 부르크 막 파열이 모델 유....

Protocol

모든 동물은 실험 동물의 관리 및 사용 2013 에디션의 가이드에 따라 처리되며, 비전 및 안과 (ARVO) 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 문에 연구 협회 및 기​​관 동물에 의해 승인 관리 및 노스 웨스턴 대학에 대한 사용위원회.

참고 : 다음 절차는 하나의 연산자를 완전히 수행 할 수 있습니다; 따라서 작업으로 분할하지만, 훨씬 더 효율적 개의 연산자를 행한다.

1. 레이저 및 사전 레이저 역을 준비

1. 쉽게 접근 할 수있는 레이저와 슬릿 램프를 배치합니다. 레이저의 전원을 켜고 설정 매개 변수를 미리 결정 (예 : 75 μm의 스폿 사이즈, 100 mW의 전력을 100 밀리 초 시간).
   주의 : 확인 운영자는 모든 동물과 레이저 안전 개인용 보호 장비는 적절한 레이저 안전 표지판 절차 룸의 외부에 표시됩니다 착용.
   1. 모든 실험 동물을 사용하기 전에, 교정, 비 실험 마우스를 사용하여 최적 매개 변수를 찾을 수 있습니다. 레이저 매개 변수는 사용 된 레이저에 의존 할 것이다. 이상적인 매개 변수가 초점이 때 지속적으로 "거품"형성을 일으키는 가장 낮은 레이저 출력 설정에 의해 정의된다. 적절한 "거품"형성 병변의 예....

Results

맥락막 신생 혈관 병변의 정량화는 맥락막 신생 혈관에 라벨을 면역 형광 염색법을 사용하여 평면에 장착 된 맥락막의 분석을 통해 수행 할 수 있습니다. 조직 준비의 두 가지 가장 자주 사용되는 방법은 바로 내피 세포 마커와 동물의 희생, 또는 사후 면역 염색하기 전에 관류를 통해 수행 FITC-덱스 트란 라벨입니다. 두 방법 모두에서 상세히 ^13,14,21 전술 한 각각 각 1 및도 2의 실시 예를 도시한다. 공 촛점 현미경 이미지 획득, 어느 영역 (2 차원으로) 또는 볼륨 후 (3 차원)을 산출 할 수 있으며, 소프트웨어 또는 ImageJ에 Volocity 가시화. 정량화 외에도 간섭 단층 촬영은 생체 내에서 CNV 병변을 시각화 할 수있다. 얻어진 CNV와 망막의 단면 영상의 예는도 3에 도시된다.

Discussion

성공적인 레이저 유도 한 후 레이저 배달 및 결과 맥락막 신생 혈관 병변의 개발에 영향을 미칠 수있는 여러 요인이있다. 이러한 요소에 대한 제어 및 가장 신뢰할 수있는 결과를 위해 표준화되어야한다. 이들 인자의 대부분은 마우스 적절한 선택 (유전자형, 연령, 성별), 마취제 선택, 레이저를 설정한다.

사용 된 특정 마우스 CNV 모델 개발 과정에 상당한 영향을 미칠 수있다. 가장 널리 사용되는 유전자형은 C57BL / 6 마​​우스이다. 동물로부터 수득 된 벤더 얻어진 CNV의 크기에 영향을 미칠 수있다. 불량 등은. 다른 두 업체 ^4보다 훨씬 더 큰 맥락막 신생 혈관을 개발하는 타 코닉에서 마우스와 잭슨, 찰스 강, 그리고 타 코닉 실험실에서 C57BL / 6 마우스의 최종 맥락막 신생 혈관 병변의 크기가 유의 한 차이를 보여 주었다. 따라서, 한 회사에서 구매와 같은 공급 업체의 모든 마우스를 사용하여 외부의 차이를 최소화하는 데 도움이 될 것입니다CN.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
532 nm (녹색) 아르곤 안과 레이저	IRIDEX	GLx	모든 안과 용 532 nm (녹색) 아르곤 레이저를 사용할 수 있습니다
	칼 Zeiss	30SL-M	와 호환되는 한 모든 슬릿 램프를 사용할 수
tert-amyl alcohol	Sigma	152463-1L
호박색 유리 바이알 + 세프타	Wheaton	WH-223696	트리브로모에탄올 저장
티슈 와이프	VWR	82003-820	기타
1% Tropicamide	Falcon Pharmaceuticals	RXD2974251	동공 확장
0.5% Tetracaine hydrochloride	Alcon	0065-0741-12	국소 마
인공 눈물	Alcon	58768-788-25	수화
열 요법 펌프(동물 온난화용)	Kent Scientific	HTP-1500	동물의 체온
온난화 패드	Kent Scientific	TPZ-0510EA	는 동물의 체온을 유지합니다
. 30G 인슐린 바늘,	BD	328418	IP 마취 주
사 저울	American Weigh Scale	AWS-1KG-BLK	마우스 계량
커버 슬립 (25 mm x 25 mm)	VWR	48366089	각막을 평평하게 하여 마우스 망막을 시각화
취	기관에서 얻은		자일라진
케타민	마취		에서 얻은
기관 Volocity	PerkinElmer		체적 재구성에 사용
ImageJ	이미지 분석에 사용되는	미국 국립보건원(National Institutes of Health