를 사용하여 기능성 복제<em&gt; Xenopus의</em&gt; 난자 발현 시스템

요약

우리는 유능한 외배엽에서 반응을 유도할 수 있는 유전자의 발현을 위한 Xenopus 난모세포 및 동물 캡 시스템을 설명하고 이러한 유전자의 후속 분석을 위한 기술에 대해 논의합니다. 이 시스템은 광범위한 유전자 산물의 기능적 식별에 유용합니다.

초록

배아 유도를 담당하는 유전자의 확인은 여러 가지 도전을 제기합니다. 몇 가지 예를 들자면, 분비된 관심 분자는 풍부하지 않을 수 있고, 분비되지 않고 신호 세포에 묶여 있을 수 있으며, 결합 파트너 또는 상위 조절 분자의 존재를 필요로 할 수 있습니다. 따라서 유능한 외배엽에서 초기 수정체 유도 반응을 유도할 수 있는 유전자 산물을 찾기 위해 부분비 또는 병치환 인자뿐만 아니라 전사 또는 기타 조절 단백질을 식별할 수 있는 발현 클로닝 시스템을 활용했습니다. mRNA 풀을 Xenopus 난모세포에 주입하고 반응 조직을 난모세포에 직접 배치하고 공동 배양했습니다. 렌즈가 장착된 동물 캡 외배엽에서 초기 수정체 플라코드 마커 foxe3의 발현을 유도하는 능력에 기초하여 신경판 단계 cDNA 라이브러리에서 ldb1을 기능적으로 복제한 후, mRNA 발현 패턴을 특성화하고 ldb1의 과발현 또는 녹다운에 따른 발달 진행을 분석했습니다. 이 시스템은 유능한 조직에서 기능적 반응을 사용하여 유도 물질 또는 그 업스트림 조절 분자를 식별하고자 하는 매우 다양한 상황에 적합합니다.

서론

기능 또는 기능 상실을 통해 관심 유전자를 식별하는 순방향 유전적 접근^{방식 1,2}은 발달 과정에서 복잡한 패터닝 이벤트를 이해하는 데 필수적인 부분입니다. ^3-5 점점 더 확장되는 시스템 및 연구자들이 이용할 수 있는 강력한 역유전 기술과 함께, 이제 경로에서 핵심적인 기능적 역할을 하는 유전자를 식별한 다음 세포 수준에서 그리고 다른 유전자 산물과의 상호 작용에서 해당 기능을 규명할 수 있습니다. 과거에 많은 중요한 발견을 산출한 관심 유전자를 기능적으로 식별하는 한 가지 방법은 발현 클로닝입니다^6,7.

우리의 최근 목표⁸은 척추동물의 수정체 유도 과정의 초기 단계가 가스트룰라 단계부터 일어난다는 것이 입증되었기 때문에 초기 렌즈 유도 요인을 식별하는 것이었습니다. 이를 위해 우리는 유도를 위한 반응 조직으로 Xenopus 배아의 일시적인 렌즈 기능을 가진⁹ 동물 모자 외배엽(11-11.5¹⁰기)을 사용하고, 유도 인자를 위한 생산 원으로 VI기 Xenopus 난모세포를 사용했습니다.

다음 프로토콜은 Smith 및 Harland^6....

프로토콜

모든 실험 절차는 버지니아 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었습니다.

참고도 1은 실험 과정의 개략도를 나타낸다.

난자 1. 준비

1. 사전 프라임 (X) 난 모세포의 분리에 앞서 임신 마레 혈청 성선 자극의 150 U (PMSG) 약 1 주일와 여성을 laevis의. 29 G 바늘 1 CC 멸균 주사기 등의 림프 낭에 1 ml의 150 U / ㎖의 PMSG를 주사.
2. 난 모세포 주입 및 난자 동물 캡 분석을위한 솔루션을 준비합니다.
   1. 칼슘을 준비 ⁺⁺ / 마그네슘 ^{+ +} - 무료 OR2 (OR2-) : 82 mM의 염화나트륨, 2.5 밀리미터의 KCl, 1.5 밀리미터 나 ₂ HPO _4, 50 mM의 HEPES pH가 7.2.
   2. OR2- 플러스 1 mM의 염화칼슘 _2, 1 밀리미터의 MgCl ₂ : OR2를 _{준비합니다.}
   3. 60 % 라이 보 비츠 L15, 0.4 ㎎ /....

결과

동물 캡 조직 응답, 난자에 주입의 mRNA의 발현에 대응하여 현장 하이브리드 (그림 2, 표 1)에 의해의 Otx2의 발현을 측정 하였다;의 Otx2이 렌즈 placode를 통해 신경관 폐쇄에서 추정 렌즈 외배엽 (PLE)로 표현된다 농축 ^(19). 도의 Otx2 PLE 외부 전방 신경 외배엽뿐만 아니라 비 - 신경 외배엽 헤드 표현이기 때문에,이를 신경과 placodal 반응 모두와 연관된다. foxe3 신경 판으로부터 PLE 표현되므로 foxe3의 사용은 발현 클로닝의 목적에 더 구체적인 접근을 허용 가능한 렌즈 유능한 동물 캡 외배엽의 렌즈의 유도 반응을 생성 할 수있는 유전자 산물의 라이브러리를 선별 할 인접 placodal 지역에 존재하지만 neuroectoder 결석 단계와 렌즈 소포 형성

토론

유능한 외배엽에서 반응을 유도 할 수있는 유전자의 기능적 클로닝 여기 기재된 방법은 유전자 산물의 넓은 범위를 식별하기 위해 사용될 수있다. 이 방법은 표현의 복제 기술과 조직 유도 분석을 결합하여 과거의 일에 확장합니다. 우리는 RNA 주입 다음, 직접 또는 간접적으로 유도 인자의 생성 소스로서 제노 푸스 난 모세포의 대사 경로를 이용한다. 이것은, 관심 cDNA 라이브러리 또는 클론의 다른 컬렉션으로부터 발생 전 사체의 발현을 사용하여 ^6,7의 유전자를 클로닝하기위한 확립 된 방법의 사용과 조합하여 배아 관련된 새로운 관심의 유전자를 동정하고자하는 사람들에게 유용한 방법을 제공한다 유도. 새로운 유전자의 기능 식별이 방법의 광범위한 적용은 흥미로운 새로운 역 유전 적 접근 방법에 대한 유용한 보완하고, 또한 높은 THR 사용하여 확인 시험 성적 증명서를 기능적하는 데 사용할 수 있습니다oughput (예 : RNA-서열 등)의 방법 ^(21).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
12/101 항체	개발 연구 Hybridoma Bank	12/101	근육 조직 검출을 위한 단클론 항체
20x SSC 버퍼	ISH	시그마	S6639
Anti-Dig-AP
	용	시그마	A6404
Aurum 플라스미드 미니 키트	Bio-Rad	732-6400	플라스미드 DNA 정제
ISH BM 용	차단 시약	Roche	11096176001
Purple	Roche	11442074001	ISH
Boekel 혼성화 오븐	Fisher Scientific	13-245-121	ISH
Bouin의 솔루션	시그마	HT10132	ISH
BSA	시그마	A9647	OCM
CHAPS	시그마	C3023	ISH의 경우
Collagenase A	Roche	10103578001	난모세포의 Defolliculation
Cysteine	Sigma	C121800	Dejelly 배아
DEPC-H2O	Fisher Scientific	BP5611	ISH
용 Dig-RNA 라벨링 믹스	Roche	11277073910	ISH 프로브 Dumont
# 5 집게	Vitelline 봉투 용 World Precision Instruments	500233	제거
에틸 3-아미노벤조에이	시그마	A5040	MS222 마취제
Ficoll PM 400	매체용	시그마	F4375
겐타마이신 황산염	시그마	F9037	OCM
	World Precision Instruments	4878	3.5인치 길이, I,D, 0.530mm
유리 샘플 바이알	Fisher Scientific	06-408B	ISH
헤어 루프			조직 조작을 위해 파스퇴르 피펫에 부착
된 헤파린 나트륨 염	Sigma	H4784	ISH
인젝터 용 Nanoliter 2010	World Precision Instruments	Nanoliter 2010	Microprocessor 제어 microinjector
Instant Ocean	캐롤라이나	972433	수족관 소금 개구리 회복
IRBG XGC Xenopus 검증된 전체 길이 캠 cDNA	출처 Bioscience	989_IRBG	cDNA 라이브러리
100 µ를 가진 LB 한천 판; g/ml Ampicillin	Teknova	L5004	150mm 사전 주입 LB-Amp 플레이트 sib 선택을 위한
LB Luria Broth	Teknova	L8650	LB 플레이트에서 sib 선택 및 배양 희석을 위한
자성 mRNA 분리 키트	New England BioLabs	S1550S	폴리(A) 농축 RNA Maleic
Acid	Sigma	M0375	분리용 ISH
수동 Microfil Micromanipulator	World Precision Instruments	M3310R	수동 micromanipulator
너트 믹서	Fisher Scientific	22-363-152	ISH 용 로커
Permoplast	Nasco	SB33495M	주입 및 해부 접시
점토 인산염 완충 식염	시그마	P5368	ISH
PMSG	시그마	G4877	난모세포 발달을 자극하기 위해
용	폴리비닐피롤리돈	시그마	PVP40
	World Precision Instruments	PUL-1000	마이크로피펫 니들 풀러
용	단백질 분해 효소 K	시그마	P6556
Vector	Promega	L5610	cDNA 라이브러리 구성
Riboprobe Combination System	Promega	P1450	in vitro 전사
위 첨자 전체 길이 cDNA 라이브러리 구성 키트	Life Technologies	18248013	키트 cDNA 라이브러리 구축
봉합사, 3-0 실크	Fisher Scientific	19-037-516	난모 세포 제거 후 봉합
Torula RNA	Sigma	R3629	ISH
용
트리에탄올 아민 시그마 T1502Tween 20	Sigma	P9416	for ISH
Universal RiboClone cDNA Synthesis System	Promega	C4360	alternative kit for cDNA library construction
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration	Source Bioscience	5055_XenORFeome	ORFeome Clones
XL2-Blue Ultracompetent Cells	Agilent Technologies	200150	cDNA 형질전환용 세포 도서관

아세트산 무수물용 ISH ISH 용 Roche 11093274910 용 트 주입 ISH 유리 모세혈관용 시그마 G1914 용 수 ISH 프로그래밍 가능한 풀러 ISH pTnT사