이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

를 사용하여 기능성 복제

8.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53518

⸱

2016년 1월 30일

 ,  , 
1Department of Biology, Shepherd University, 2Department of Biology, University of Virginia

이 논문에서

요약

우리는 유능한 외배엽에서 반응을 유도할 수 있는 유전자의 발현을 위한 Xenopus 난모세포 및 동물 캡 시스템을 설명하고 이러한 유전자의 후속 분석을 위한 기술에 대해 논의합니다. 이 시스템은 광범위한 유전자 산물의 기능적 식별에 유용합니다.

초록

배아 유도를 담당하는 유전자의 확인은 여러 가지 도전을 제기합니다. 몇 가지 예를 들자면, 분비된 관심 분자는 풍부하지 않을 수 있고, 분비되지 않고 신호 세포에 묶여 있을 수 있으며, 결합 파트너 또는 상위 조절 분자의 존재를 필요로 할 수 있습니다. 따라서 유능한 외배엽에서 초기 수정체 유도 반응을 유도할 수 있는 유전자 산물을 찾기 위해 부분비 또는 병치환 인자뿐만 아니라 전사 또는 기타 조절 단백질을 식별할 수 있는 발현 클로닝 시스템을 활용했습니다. mRNA 풀을 Xenopus 난모세포에 주입하고 반응 조직을 난모세포에 직접 배치하고 공동 배양했습니다. 렌즈가 장착된 동물 캡 외배엽에서 초기 수정체 플라코드 마커 foxe3의 발현을 유도하는 능력에 기초하여 신경판 단계 cDNA 라이브러리에서 ldb1을 기능적으로 복제한 후, mRNA 발현 패턴을 특성화하고 ldb1의 과발현 또는 녹다운에 따른 발달 진행을 분석했습니다. 이 시스템은 유능한 조직에서 기능적 반응을 사용하여 유도 물질 또는 그 업스트림 조절 분자를 식별하고자 하는 매우 다양한 상황에 적합합니다.

서론

기능 또는 기능 상실을 통해 관심 유전자를 식별하는 순방향 유전적 접근방식 1,2은 발달 과정에서 복잡한 패터닝 이벤트를 이해하는 데 필수적인 부분입니다. 3-5 점점 더 확장되는 시스템 및 연구자들이 이용할 수 있는 강력한 역유전 기술과 함께, 이제 경로에서 핵심적인 기능적 역할을 하는 유전자를 식별한 다음 세포 수준에서 그리고 다른 유전자 산물과의 상호 작용에서 해당 기능을 규명할 수 있습니다. 과거에 많은 중요한 발견을 산출한 관심 유전자를 기능적으로 식별하는 한 가지 방법은 발현 클로닝입니다6,7.

우리의 최근 목표8은 척추동물의 수정체 유도 과정의 초기 단계가 가스트룰라 단계부터 일어난다는 것이 입증되었기 때문에 초기 렌즈 유도 요인을 식별하는 것이었습니다. 이를 위해 우리는 유도를 위한 반응 조직으로 Xenopus 배아의 일시적인 렌즈 기능을 가진9 동물 모자 외배엽(11-11.510기)을 사용하고, 유도 인자를 위한 생산 원으로 VI기 Xenopus 난모세포를 사용했습니다.

다음 프로토콜은 Smith 및 Harland6,7의 표현식 복제 및 sib 선택 프로토콜을 기반으로 하며, 다른11-13에서도 성공적으로 사용되었습니다. 당사의 난모세포 발현 시스템(Lustig 및 Kirschner14에 의해 유도 인자 생산에 처음 사용됨)에서 동물 뚜껑 외배엽에서 렌즈 유도 반응을 유도하는 인자를 직간접적으로 유발할 수 있는 주입된 전사체 풀을 선택하고 식별합니다. 이 시스템은 분비 유도 분자를 직접 발현하는 데 유용하기 때문에(난모세포 주입 INHBB mRNA는 중배엽 수용 동물 캡 외배엽8에서 중배엽 유도를 유발함) 원래 스크리닝 절차가 주로 부분비 인자를 식별하는 데 유용할 것으로 예상했습니다. 그러나 스크리닝에서 핵 인자(ldb18)를 확인했기 때문에 이 시스템을 사용하여 전사 또는 번역 조절 인자, miRNA, 보조 인자 또는 병치형 인자와 같은 다양한 분자를 식별할 수 있음이 분명합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

모든 실험 절차는 버지니아 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었습니다.

참고도 1은 실험 과정의 개략도를 나타낸다.

난자 1. 준비

  1. 사전 프라임 (X) 난 모세포의 분리에 앞서 임신 마레 혈청 성선 자극의 150 U (PMSG) 약 1 주일와 여성을 laevis의. 29 G 바늘 1 CC 멸균 주사기 등의 림프 낭에 1 ml의 150 U / ㎖의 PMSG를 주사.
  2. 난 모세포 주입 및 난자 동물 캡 분석을위한 솔루션을 준비합니다.
    1. 칼슘을 준비 ++ / 마그네슘 + + - 무료 OR2 (OR2-) : 82 mM의 염화나트륨, 2.5 밀리미터의 KCl, 1.5 밀리미터 나 2 HPO 4, 50 mM의 HEPES pH가 7.2.
    2. OR2- 플러스 1 mM의 염화칼슘 2, 1 밀리미터의 MgCl 2 : OR2를 준비합니다.
    3. 60 % 라이 보 비츠 L15, 0.4 ㎎ / ㎖ BSA, 100 μg의 / ㎖ 겐타 마이신, pH가 7.8 : OCM을 준비합니다.
    4. 사전1X MBS 깎다 : 88 mM의 염화나트륨, 1 mM의 KCl을을 0.7 mM의 CaCl2를, 1mM의 황산, 5 mM의 HEPES (PH 7.8), 2.5 mM의 NaHCO3을.
    5. 1X MBS의 3 % 피콜을 준비합니다.
    6. 1X NAM을 제조 : 110 mM의 염화나트륨, 2 밀리미터의 KCl, 1 mM의 칼슘을 (NO 3) 2, 1mM의 황산, 0.1 mM의 EDTA, 1mM의 NaHCO3을, 2 mM의 나트륨 3 PO 4, pH가 7.4.
  3. 0.1X MBS 에틸 -3- 아미노 벤조 에이트, 메탄 술폰산 염을 0.03 % 용액 (MS222)으로 여성 마취위한 용액 개구리 배치하여 (제 10 ml의 95 % 에탄올 중의 0.3 g의 MS222을 용해하고 1 L 0.1X의 MBS에 희석) 10-15 분 또는 응답하지 않는 때까지.
    1. 그 마취가 응답하지 않도록 (불완전 마취 된 개구리가 사지를 움직이거나 몸을 뒤집)하기 위해 다시에 마취 된 개구리를 돌려 완료 확인합니다.
  4. 수술 집게로 난소 조직을 분리, 메스 블레이드와 피부 및 신체 벽을 통해 복부 절개를하여 난소 조각을 분리가위. OR2-에 난소 조각을 놓습니다. 24mm 곡선 바늘에 3-0 실크 봉합사와 신체 벽을 닫고 같은 봉합 별도로 피부를 닫습니다. 물에 1g / L 수족관 소금에 여성의 복구를 허용합니다.
  5. (- 20 난자 10) 조각과 신선한 OR2-로 전송 작은으로 미세 집게, 눈물 난소 조직을 사용.
  6. 1 시간 동안 진탕 기에서 부드럽게 교반 신선한 콜라게나 제에 전송하고 하나의 추가 시간 동안 교반하여 OR2- 2.0 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제에 Defolliculate 난소 조각.
  7. 워시 작은 난자를 폐기 OR2에 [칼슘 + + / 마그네슘 + +를 ​​포함하는 10 번, 난자.
  8. OCM에 두 번 난자를 세척하고 신선한 OCM에 전송합니다. 육안 검사에 크기에 따라 단계 VI 난자를 분리하고 미숙 (작은) 난자를 폐기 : 단계 VI 난자는 동물 반구도 색소 침착과 미성숙 난자보다 큰 약 직경 1.2-1.4 mm이다.
  9. 20 ° C 형 I - 18에서 난자를 유지주입하기 전에 N OCM. 주 : 아가 로스 코팅 페트리 접시는 접시 난자의 점착을 최소화하기 위해 사용될 수있다.

도서관 성적 증명서 2. 사출

  1. 개발의 적절한 단계 (예를 들어, 신경 판 단계 14 10)에서 추출 방향 cDNA 라이브러리 (15) 사용하여 RNA를 준비합니다. cDNA 라이브러리를 구입하거나 아래의 4 단계 개요 당 상용 키트를 사용하여 하나를 구축합니다.
    1. 폴리 (A) + RNA (재료의 표 참조) 풍부하게 제품을 사용하고 제조업체의 지침에 따라 약 5 μg의 mRNA의를 격리합니다. 주 : 사체 (원하는 조직의 미세 절제 다음과 같은 신경 판으로) 유도 조직에 한정 될 수있다 cDNA 라이브러리를 생성하기 위하여 사용되는, 또는 특정 단계에서 전체 배아 일 수있다.
    2. 제조업체의 지침에 따라, 상용 키트의 cDNA를 생성합니다.
    3. vecto로 cDNA를 NG 약 20 결찰R은 상용 키트 또는 다른 적절한 벡터에 포함. 적절한 플라스미드 벡터는 mRNA의 안정성 등 5 'β-글로빈 3 폴리 (A) 시퀀스 (PCS2 +, pTnT, pCS105)에 대한 시퀀스를 포함한다.
    4. 열충격 형질 전환 공급자의 권장 프로토콜을 사용하여 능력 균체 내로 결찰 변환.
      참고 : 또는 오픈 리딩 프레임 (ORFeome) 클론의 수집이 시판되고 주입 전 사체를 생성하기 위해 사용될 수있다.
  2. 10 4 복잡성 (10월 4일에서 10월 5일까지 총 복잡성) 10 (3)의 플라스미드 (10) 풀을 준비합니다. 10,000 식민지 각 - 이것은 1000 10 판을 나타냅니다.
    1. 37 ℃에서 18 시간, 7 ㎖의 (LB)에 유리 스프레더와 부드러운 압력에 의해 각에서 식민지를 수집 - 플레이트 도서관 문화 10 15-CM LB-암피실린 플레이트 상에, (12)을 성장
    2. 0.5 ml의에서 글리세롤 주식을 준비합니다 (-20에서 0.2 ml의 멸균 글리세롤 및 저장에 추가# 730; C), 및 표준 제조사의 지침에 따라 시판중인 DNA 미니 프렙 키트 DNA를 제조 6.5 mL의 나머지를 사용한다.
  3. 1.5 시간 - 효소 (1) 37 ℃에서 16 다이제스트 적절한 제한과 - (2.0 μg의 1.0) 풀링 된 플라스미드 DNA를 선형화. 사용 된 RNA 폴리머 라제 키트의 사양에 물 및 에탄올 침전에 재 부유 한 다음 페놀 / 클로로포름 추출과 선형화 된 DNA를 분리. 제조업체의 지침에 따라 상업 RNA 중합 효소 키트 센스 RNA를 합성.
  4. 약 20 μm의 직경 (유리 모세관 튜브와 바늘 풀러를 사용하여) 미세 주입 용 바늘을 준비; 교정 된 안구 마이크로 미터와 복합 현미경에 바늘 끝을 측정한다. 참고 : 니들 풀러 설정이 미세 집게로 깨진 경우 원하는 팁 크기를 얻을 수 있도록 좋은 팁 바늘을 생산하는 경험적으로 결정되어야한다.
  5. (에 점토를 밀어를 준비접시의 바닥)에 균일 한 층 점토 늘어선 35 X 10mm 미세 주입하는 동안 장소에 난자를 유지하는 병렬 홈으로 배양 접시를; 불꽃의 끝에서 융합 쇼핑몰 프로브 또는 파스퇴르 피펫으로 홈을 생산하고 있습니다. 점토에 대한 대안으로서, 엘라스토머 (17)와 톱니 형을 아가로 요리를 준비한다. 점토 늘어선 요리의 행에 1X MBS의 3 % 피콜 (약 2 ㎖)에 넓은 구멍 피펫으로 전송 난자.
  6. 마이크로 인젝터를 사용하여, 1 NG / NL RNA와 바늘을 작성하고 (난자 세포질의 그리기 방지하기 위해) 약간의 긍정적 인 압력을 생산하기 위해 균형을 조정합니다.
  7. 적도 지역에서 약 20 NL RNA와 난 모세포를 주입한다. 다음, 피콜-MBS에 남아 1X MBS에 부드럽게 전송 주입 난 모세포에 대한 1 시간을 허용합니다. 이전에 동물 캡 분석에 20 ℃에서 24 시간 - 8 품어.

3. 동물 모자 분석

  1. 미세 집게, 헤어 루프, 곡선 coverslip에 조각, 점토 늘어선 DIS 3 / 4 배 NAM을 준비하고 획득컵 모양의 톱니와 HES는 난자를 개최합니다. 곡선 부분을 생산, (4 MM - - 2 MM × 2 약 1)과 가장자리 광택과 처지까지 불꽃을 통과하는 작은 조각으로 커버 글라스를 따로 끊어서 곡선 coverslip에 조각을 확인합니다.
  2. X를 기름지게 laevis의 달걀 체외 또는 자연 교배와 단계 낭배하는 문화를 통해 18 - 이전 단계에 의해 정렬에 0.1X MBS (10 실온에서 11 시간 포스트 수정을); 10 배아 - 중간 낭배 (11.5 단계 11)를 수집합니다.
  3. 3 / 4 배 NAM와 약 반 전체 배양 접시로 전송 배아. 미세 집게 두 쌍을 사용하여, gastrulae에서 수정 (난황) 막을 제거합니다.
  4. 전송 점토 늘어선 요리 3 / 4 배 NAM (약 2 ㎖)에 난자 홈이 상기 된 개별 배아를 수용하기 위해 인상을 생산, 점토의 개별 노출에 고정.
  5. 점토 늘어선 요리로 전송 배아 및 G 오프 동물 모자를 잘라astrulae 잘 포셉 두 쌍을 사용하여. 만 아니라 적도 조직 (18) 동물 모자 외배엽을 분리주의하십시오.
  6. 난자와 접촉하는 동물 캡의 내부 표면과 각 난자의 동물 반구에 동물 캡을 놓습니다. 8 시간 이상 - 6 난자의 표면에 노출 된 내부 층으로 열려있다 (커버 슬립 연락처 동물성 캡 점토 외배엽 평탄화, 곡면 유리 커버 슬립 단편을인가하고, 유리로 하향 압력을인가하여 재조합을 함께 보유 ).
    , 또는 위쪽을 향 내면에 점토 들여 쓰기에 동물 캡을 배치하고 뚜껑에 난자를 배치; 참고 : 점토의 작은 확장자를 가진 재조합을 고정합니다.
  7. 20 ° C에서 문화 제어 배아는 분석 무대를 원하는에 도달 할 때까지.
  8. 커버 슬립 / 진흙을 제거하고 집게와 헤어 루프 외배엽을 분리하여 별도의 재조합.
  9. MEMFA에서 1 시간 (3.8 %를 외배엽 조각을 수정(MEM) [0.1 M MOPS의 pH가 7.4, 2 mM의 EGTA, 1 mM의 황산 4]에서 포름 알데히드).
  10. -20 ℃에서 에탄올과 저장소로 MEMFA에서 전송 조각 (및 제어 배아).

에서의 현장 하이브리드 화에 의한 외배엽에서 응답 4. 분석 (ISH)

  1. ISH을위한 솔루션을 준비합니다.
    1. 1X PBS를 준비 : 0.01 M 인산 완충 식염수, 염화나트륨 0.138 M, pH가 7.4
    2. 제조 PBS-트윈 (PTW) 1X PBS, 0.1 % 트윈 -20
    3. 100 × 덴 하르트의 용액을 제조 하였다 : 2 % BSA, 2 % 폴리 비닐 피 롤리 돈을, 2 % 피콜
    4. 혼성화 완충액을 제조 50 % 포름 아미드, 5 배 SSC, 1 mg의 / ㎖ torula 효모 RNA, 1 μg의은 / ㎖ 헤파린 1X 덴 하르트의 용액, 0.1 % 트윈 -20, 0.1 % CHAPS, 10 mM의 EDTA, DEPC-H 2 O
    5. 제조 말레 산 완충액 (MAB) : 100 mM의 말레 산, 150 mM의 염화나트륨, pH가 7.5
    6. (용해 60 ℃에 열) MAB, 2 % 시약을 차단 : MAB + 블록을 준비
    7. 100 mM 트리스 : 알카라인 포스파타제 (AP) 버퍼를 준비합니다pH가 9.5의 50 mM의 MgCl 2, 100 mM의 염화나트륨, 0.1 % 트윈, DH 2 O
  2. RNA 프로브를 준비합니다.
    1. 1.5 ML 튜브 (50 μL 반응)에 추가, 상업 RNA 중합 효소 키트를 사용하여 혼합 - NTP의 발굴 : 25.5 μL의 DEPC-H 2 O, 10 μL 5 배 전사 버퍼, 2.5 μL 10 배 발굴-NTP 믹스, 5 μL 100 밀리미터 DTT, 2 μL RNAsin, 2 μL 선형화 DNA 주형 (~ 1 μg의 / μL), 3 μL RNA 중합 효소와 90 분 동안 37 ℃를 품어.
    2. 2 μL RNA 중합 효소를 추가하고 60 분 동안 37 ℃를 품어.
    3. 1 % 아가 로스 젤에 반응 2 μL를 확인합니다.
    4. 1 μL의 RQ1 RNA 분해 효소가없는 DNase를 추가하고 20 분 동안 37 ℃를 품어.
    5. 50 μL의 DEPC-H 2 O, 25 ㎕의 10 M 암모늄 아세테이트 및 에탄올 313 μL를 첨가하여 침전물을 프로브. -20 ℃에서 보관 하룻밤 (O / N)은 다음 20 분 동안 13,800 XG에서 원심 분리하여 RNA를 복구 할 수 있습니다. 간단히 회전, 500 μL 75 % 에탄올로 세척, 제거에탄올과 공기 건조에 펠렛을 할 수 있습니다. 추가 50 μL의 DEPC-H 2 O
    6. 0.5 μg의 / μL ~의 최종 농도 하이브리드 버퍼를 추가합니다.
  3. 하이브리드를 위해 조직을 준비합니다. 특별히 언급하지 않는 한, 각 솔루션의 변화를 설명 (약 4 mL)로 정상에 튜브를 입력합니다.
    1. 수평 로커에, 10 분 각 75 % 에탄올 / PTW, 다음 50 % 에탄올 / PTW에 튜브 및 이식란으로부터 에탄올을 제거합니다.
    2. 5 분 로커에 각각 PTW에 세 번 씻으십시오.
    3. 10 μg의 PTW에서 / μL 테 K 처리로 이동; 바위 튜브를 수직으로 15 분.
    4. 수직 바위 튜브 - 0.1 M 트리에탄올 아민 pH가 7.8에 두 번 10 분 각 씻어.
    5. 튜브에 12.5 μL에게 무수 초산을 추가하고 수직으로 5 분 바위. 5 분 동안 추가로 12.5 μL 아세트산 무수물로 반복한다.
    6. 로커에 분 수직 PTW 5 씻으십시오.
    7. 로커에 4 % 파라 포름 알데히드 20 분에 REFIX. 열 하이브리드 버퍼60 ℃에.
    8. 5 분 로커에 각각 PTW에 세 번 씻으십시오.
    9. 250 μL HYB 버퍼를 각 튜브에서 PTW의 모든하지만 ~ 1 ml의를 제거하고 추가; 부드럽게 섞어 튜브를 소용돌이 친다. 락 튜브를 수직으로 5 분.
    10. 60 ℃ HYB 버퍼 (0.5 ml)로 교체하고 60 ℃ 10 분에서 부드럽게 교반. 신선한 HYB 버퍼로 교체하고 60 ℃에서 2 4 시간에서 교반.
    11. 열 프로브 (60) C (3 분)에 (0.5 μg의 HYB 버퍼에 / μL에서 1 ㎖). HYB 버퍼를 제거하고 튜브에 프로브를 추가 할 수 있습니다. O / N은 ​​60 ℃에서 부드럽게 선동.
  4. 항체를위한 조직을 준비합니다.
    1. 60 ℃로 따뜻한 HYB 버퍼 및 배 SSC + 0.1 % 트윈 20 솔루션을 제공합니다.
    2. (- 배 재사용이 -20 ℃에서 프로브를 저장) HYB 버퍼와 프로브 솔루션을 교체합니다. 10 분 동안 60 ℃에서 씻으십시오.
    3. 배 SSC-트윈에서 60 ℃ (20 분 교반과 함께 각)에서 세 번 씻으십시오.
    4. 0.2X SSC-트윈에서 60 ℃ (20 분 교반과 함께 각)에서 세 번 씻으십시오.
    5. 로커에 15 분마다 수평에 대해 MAB (RT)에 두 번 씻으십시오.
    6. 1 ML의 MAB + 블록을 추가합니다. 로커에 수직으로 2 시간을 씻으십시오.
    7. 1 / 2,000 안티 digoxygenin-AP를 포함하는 1 ML의 MAB + 블록에 전송. 4 주 / N에서 수직 바위.
  5. 색상 시약을위한 조직을 준비합니다.
    1. MAB와 항체 솔루션을 교체; MAB 5 분마다 수평 로커에 세 번 씻는다.
    2. MAB 1 시간에 각각의 수평 로커에 세 번 씻으십시오.
    3. AP 버퍼 10 분에 각각 수평 로커에 두 번 씻으십시오.
    4. 여러 웰 플라스틱 트레이로 조직을 이동 AP 버퍼를 제거하고 BM에게 보라색 시약을 추가 (1 ~ ㎖). 반응이 O / N 어두운 5 분에 할 수있게합니다.
    5. 적절한 염색이 달성되면, PTW의 바이알에 조직을 전송. 로커에 PTW에 두 번 10 분 각각을 씻으십시오.
    6. 로커에 4 주 / N에서 Bouin의 솔루션에 고정합니다.
    7. 실온에서 Bouin의 세 70 % 에탄올 / 30 % PTW 세척과를 세척 할 것. T를 진행필요한 경우 18 에피 조명 및 현미경에 장착 된 카메라, 표백을 사용 O 이미지 캡처.

5. SIB 선정 및 복제

  1. 가장 높은 활성을 선택 풀 (외배엽 조직에 가장 큰 응답).
  2. (위의 프로토콜 섹션 2를 사용) 이전 단계의 식민지를 가장 높은 활성을 가진 풀의 글리세롤 주식을 (적절한 밀도 LB로 희석) 약 십분의 일에 열 새로운 판을 판 적정한다.
  3. 활동이 하나의 식민지로 추적 될 때까지 풀의 크기를 줄입니다.
  4. 벡터 표준 프라이머를 이용하여 DNA 서열을 얻습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

동물 캡 조직 응답, 난자에 주입의 mRNA의 발현에 대응하여 현장 하이브리드 (그림 2, 표 1)에 의해의 Otx2의 발현을 측정 하였다;의 Otx2이 렌즈 placode를 통해 신경관 폐쇄에서 추정 렌즈 외배엽 (PLE)로 표현된다 농축 (19). 도의 Otx2 PLE 외부 전방 신경 외배엽뿐만 아니라 비 - 신경 외배엽 헤드 표현이기 때문에,이를 신경과 placodal 반응 모두와 연관된다. foxe3 신경 판으로부터 PLE 표현되므로 foxe3의 사용은 발현 클로닝의 목적에 더 구체적인 접근을 허용 가능한 렌즈 유능한 동물 캡 외배엽의 렌즈의 유도 반응을 생성 할 수있는 유전자 산물의 라이브러리를 선별 할 인접 placodal 지역에 존재하지만 neuroectoder 결석 단계와 렌즈 소포 형성

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

유능한 외배엽에서 반응을 유도 할 수있는 유전자의 기능적 클로닝 여기 기재된 방법은 유전자 산물의 넓은 범위를 식별하기 위해 사용될 수있다. 이 방법은 표현의 복제 기술과 조직 유도 분석을 결합하여 과거의 일에 확장합니다. 우리는 RNA 주입 다음, 직접 또는 간접적으로 유도 인자의 생성 소스로서 제노 푸스 난 모세포의 대사 경로를 이용한다. 이것은, 관심 cDNA 라이브러리 또는 클론의 다른 컬렉션으로부터 발생 전 사체의 발현을 사용하여 6,7의 유전자를 클로닝하기위한 확립 된 방법의 사용과 조합하여 배아 관련된 새로운 관심의 유전자를 동정하고자하는 사람들에게 유용한 방법을 제공한다 유도. 새로운 유전자의 기능 식별이 방법의 광범위한 적용은 흥미로운 새로운 역 유전 적 접근 방법에 대한 유용한 보완하고, 또한 높은 THR 사용하여 확인 시험 성적 증명서를 기능적하는 데 사용할 수 있습니다oughput (예 : RNA-서열 등)의 방법 (21).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 Shepherd University Foundation의 C.Z.P.에 대한 Professional Development Grant의 지원을 받았습니다. 저자는 프로토콜에 대한 유용한 토론을 해준 Brett Zirkle과 Malia Deshotel, 그리고 관대한 도움을 준 Carol Hurney 박사에게 감사를 표합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
12/101 항체개발 연구 Hybridoma Bank12/101근육 조직 검출을 위한 단클론 항체
20x SSC 버퍼ISH시그마S6639
Anti-Dig-AP
용시그마A6404
Aurum 플라스미드 미니 키트Bio-Rad732-6400플라스미드 DNA 정제
ISH BM 용차단 시약Roche11096176001
PurpleRoche11442074001ISH
Boekel 혼성화 오븐Fisher Scientific13-245-121ISH
Bouin의 솔루션시그마HT10132ISH
BSA시그마A9647OCM
CHAPS시그마C3023ISH의 경우
Collagenase ARoche10103578001난모세포의 Defolliculation
CysteineSigmaC121800Dejelly 배아
DEPC-H2OFisher ScientificBP5611ISH
용 Dig-RNA 라벨링 믹스Roche11277073910ISH 프로브 Dumont
# 5 집게Vitelline 봉투 용 World Precision Instruments500233 제거
에틸 3-아미노벤조에이시그마A5040MS222 마취제
Ficoll PM 400매체용시그마F4375
겐타마이신 황산염시그마F9037OCM
World Precision Instruments48783.5인치 길이, I,D, 0.530mm
유리 샘플 바이알Fisher Scientific06-408BISH
헤어 루프조직 조작을 위해 파스퇴르 피펫에 부착
된 헤파린 나트륨 염SigmaH4784ISH
인젝터 용 Nanoliter 2010World Precision InstrumentsNanoliter 2010Microprocessor 제어 microinjector
Instant Ocean캐롤라이나972433수족관 소금 개구리 회복
IRBG XGC Xenopus 검증된 전체 길이 캠 cDNA출처 Bioscience989_IRBGcDNA 라이브러리 
100 µ를 가진 LB 한천 판; g/ml AmpicillinTeknovaL5004150mm 사전 주입 LB-Amp 플레이트 sib 선택을 위한
LB Luria BrothTeknovaL8650LB 플레이트에서 sib 선택 및 배양 희석을 위한
자성 mRNA 분리 키트New England BioLabsS1550S폴리(A) 농축 RNA Maleic
AcidSigmaM0375분리용 ISH
수동 Microfil MicromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3310R수동 micromanipulator
너트 믹서Fisher Scientific22-363-152ISH 용 로커
PermoplastNascoSB33495M주입 및 해부 접시
점토 인산염 완충 식염시그마P5368ISH
PMSG시그마G4877난모세포 발달을 자극하기 위해
용폴리비닐피롤리돈시그마PVP40
World Precision InstrumentsPUL-1000마이크로피펫 니들 풀러
용단백질 분해 효소 K시그마P6556
VectorPromegaL5610cDNA 라이브러리 구성
Riboprobe Combination SystemPromegaP1450in vitro 전사
위 첨자 전체 길이 cDNA 라이브러리 구성 키트Life Technologies18248013키트 cDNA 라이브러리 구축
봉합사, 3-0 실크Fisher Scientific19-037-516난모 세포 제거 후 봉합
Torula RNASigmaR3629ISH
용
트리에탄올 아민 시그마 T1502Tween 20SigmaP9416for ISH
Universal RiboClone cDNA Synthesis SystemPromegaC4360alternative kit for cDNA library construction
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome CollaborationSource Bioscience5055_XenORFeomeORFeome Clones
XL2-Blue Ultracompetent CellsAgilent Technologies200150cDNA 형질전환용 세포 도서관
아세트산 무수물용 ISH ISH 용 Roche 11093274910 용 트 주입 ISH 유리 모세혈관용 시그마 G1914 용 수 ISH 프로그래밍 가능한 풀러 ISH pTnT사

참고문헌

  1. Yergeau, D., Kelley, C., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis. Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).
  2. Grainger, R. Xenopus tropicalis. as a Model Organism for Genetics and Genomics: Past, Present and Future. Methods in Molecular Biology. 917, 3-15 (2012).
  3. Nakayama, T., Fish, M., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G., Grainger, R. Simple and Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51, 835-843 (2013).
  4. Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
  5. Zhao, Y., Ishibashi, S., Amaya, E. Reverse Genetic Studies Using Antisense Morpholino Oligonucleotides. Methods in Molecular Biology. 917, 143-154 (2012).
  6. Smith, W., Harland, R. Injected Xwnt-8. RNA acts early in Xenopus. embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center. Cell. 67, 753-765 (1991).
  7. Smith, W., Harland, R. Expression cloning of noggin., a new dorsalizing factor localized in the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
  8. Plautz, C., Zirkle, B., Deshote, M., Grainger, R. Early stages of induction of anterior head ectodermal properties in Xenopus. embryos are mediated by transcriptional cofactor ldb1. Developmental Dynamics. 243 (12), 1606-1618 (2014).
  9. Servetnick, M., Grainger, R. Changes in neural and lens competence in Xenopus. ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Development. 112, 177-188 (1991).
  10. Nieuwkoop, P., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
  11. Lemaire, P., Garrett, N., Gurdon, J. Expression cloning of Siamois., a Xenopus. homeobox gene expressed in dorsal-vegetal cells of blastulae and able to induce a complete secondary axis. Cell. 81, 85-94 (1995).
  12. Lustig, K., Kroll, K., Sun, E., Kirschner, M. Expression cloning of a Xenopus T.-related gene (Xombi.) involved in mesodermal patterning and blastopore lip formation. Development. 122, 4001-4012 (1996).
  13. Hsu, D., Economides, A., Wang, X., Eimon, P., Harland, R. The Xenopus. dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities. Molecular Cell. 1 (5), 673-683 (1998).
  14. Lustig, K., Kirschner, M. Use of an oocyte expression assay to reconstitute inductive signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 6234-6238 (1995).
  15. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE Science Education Database. , (2015).
  16. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. JoVE Science Education Database. , (2015).
  17. Viczian, A., Zuber, M. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932(2010).
  18. Sive, H., Grainger, R., Harland, R. Early development of.Xenopus laevis.: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor. New York. (2000).
  19. Zygar, C., Cook, T., Grainger, R. Gene activation during early stages of lens induction in Xenopus. Development. 125, 3509-3519 (1998).
  20. Medina-Martinez, O., Jamrich, M. Foxe view of lens development and disease. Development. 134, 1455-1463 (2007).
  21. Amin, N., Tandon, P., Osborne, N. E., Conlon, F. RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism. Methods. 66, 398-409 (2014).
  22. Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project. Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).
  23. Karpinka, J., et al. Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).
  24. Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PLoS ONE. , e79469(2013).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

동물극 캡 분석mRNA 주입배아 유도수정체판 마커인시튜 하이브리다이제이션난모세포 분리조직 재조합발생생물학
를 사용하여 기능성 복제
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.