동시에 두 광자 생체 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

Summary

이 비디오는 Thy1-GFP 형질전환 라인에서 생체 내 2광자 현미경을 사용하여 마우스 후비장 피질의 뉴런을 만성적으로 이미징할 수 있는 개두술 절차를 보여줍니다. 이 접근법은 mCherry 발현 아데노 관련 바이러스를 배측 해마에 주입하는 것과 결합됩니다. 이러한 기술을 통해 RSC에서 경험 의존적 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다.

Abstract

이 비디오는 Thy1-GFP 형질전환 마우스 라인에서 생체 내 이광자 현미경을 사용하여 마우스 후비장 피질(RSC)의 뉴런을 만성적으로 이미징할 수 있는 개두술 절차를 보여줍니다. 이 접근 방식은 생체 내에서 신경 세포 형태의 변화와 행동 조작의 상관 관계를 조사할 수 있는 가능성을 만듭니다.

두개골 창 이식 절차는 배럴 필드와 같이 쉽게 접근할 수 있는 피질 영역에만 국한되는 것으로 간주되었습니다. 우리의 접근 방식은 고도로 혈관화된 RSC의 뉴런을 시각화할 수 있습니다. RSC는 공간 기억을 담당하는 뇌 회로의 중요한 요소로, 이전에는 생체 내 이광자 이미징에 문제가 있는 것으로 간주되었습니다.

RSC 위의 두개골 창 이식은 mCherry 발현 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV^mCherry)를 등쪽 해마에 주입하는 것과 결합됩니다. 발현된 mCherry는 해마에서 RSC까지 축삭돌기로 퍼져 피질의 시냅스전 축삭돌기와 시냅스후 수지상 가시 모두의 변화를 시각화할 수 있습니다.

이 기술을 사용하면 RSC에서 경험 의존적 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다.

Introduction

이광자 현미경 살고 동물 행동에서 뇌 활동의 관찰 혁명. 1990 년 출시 이후 빠르게 인기를 얻고 지금은 생체 내 ^1,2에서 뇌 활동의 다양한 측면의 검토를 향해 가장 흥미롭고 혁신적인 접근 방법의 하나로서 구현된다. 이러한 애플리케이션 및 신경 세포의 형태 (칼슘 수준 지표 또는 즉각적인 초기 유전자의 발현을 사용하여, 예), 혈류 측정, 신경 활성을 포함한다. 실험실의 증가는 생체 뇌 영상을위한 새로운 표준으로 과학 세계 기술을 구현, 두 광자 현미경을 사용합니다.

표준 접근법은 뇌 창 주입 배럴 또는 마우스 뇌의 시각 피질 ³ 이상 (커버 유리 피복 두개의 원형 구멍)를 포함한다. 다음으로, 실험 프로토콜에 따라 각서SE 시간 걸쳐 ^4,5- 뇌 신경 활성 및 형태의 변화를 모니터링 할 수 있도록 시각화 행동 훈련 일련 겪는다. 두 경우 모두 개두술은 봉합을 횡단하지 않고 정수리 뼈에 영향을 미친다. 주로 기술의 주요 단점은 배럴 또는 시각 피질로 쉽게 접근 대뇌 피질에 제한된 응용 프로그램입니다 것으로 생각된다. 다른 지역에 걸쳐 두개골 창 주입으로 인해 과도한 출혈 및 / 또는 공간 방해로 어려움을 많이 포즈.

본 논문에서는 생체 현미경 ^(6)의 두 광자에 대한 관심의 또 다른 가능한 영역과 retrosplenial 피질 (RSC) 위의 두개골 윈도우의 주입을 제안한다. RSC는 공간 기억 형성을 담당 뇌 회로의 중요한 소자이다. 해부학, RSC는 대뇌 피질, 해마, 시상 영역 ^(7)를 연결하는 신경 네트워크의 일부입니다. 그것은이다주로 이러한 공간 학습 및 소등과 탐색 공간 ^(6)과 같은 행동의 범위에 포함했다.

신경 세포의 형태 학적 변화를 시각화하기 위해 우리는 thy1 발기인에서 녹색 형광 단백질 (GFP)를 발현하는 형질 전환 마우스 라인을 사용합니다. 이러한 쥐, GFP는 이광자 현미경 ^8을 사용 피질 축삭 돌기 명확한 시각화를 허용 뇌 신경 세포의 약 10 %에서 발현된다. 우리가 제안하는 또 다른 혁신은 RSC로 돌출 된 뇌의 깊은 구조로 신경 세포 특이 camkii 프로모터 ^(9)에서 적색 형광 단백질 (mCherry)를 코딩하는 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청 형 2/1 (/ 1 rAAV2)의 주입입니다 해마 등. Thy1-GFP 마우스의 해마에서 rAAV2 / 1 ^mCherry의 발현은 hippocampo-cortica의 사전 및 시냅스 요소를 동시에 시각화 할 수 있습니다난 ¹⁰ 시냅스. 단백질이 축삭 터미널에 충분한 수준에 도달 할 mCherry의 rAAV 중심의 표현은 2~3주이 필요합니다. 이 기간은 개두술 회복에 필요한 통상의 시간과 일치한다.

Protocol

아래에 설명 된 모든 실험 절차는 실험 생물학의 Nencki 연구소, 과학 폴란드어 아카데미에서 현지 윤리위원회에 의해 승인되었다.

참고 : 관련 동영상의 장면 중 일부는 가속된다. 속도 계수는이 장면에 표시됩니다.

1. 수술 준비

1. 오토 클레이브에 액체와 면봉을위한 모든 도구, 유리 용기를 소독. 비용 소비 장갑을 사용합니다. 수술 테이블, 정위 프레임과 70 % 에탄올 모든 주변 지역을 청소합니다. 모든 살균 장비에 대한 멸균 공간을 만들기 위해 무균 수술 패드를 사용합니다. 작은 조각으로 gelfoam을 잘라 및 멸균 식염수를 흡수.
   참고 : 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따르면, 에탄올 멸균이나 높은 수준의 소독제도 아니다. 그것은 단지 이전에 멸균 표면 세정 / 탈지 화제로서 사용되어야한다.
2. 일에 동물을 넣어전자 유도 챔버 / 분 2 L의 5 % 이소 플루 란 레벨 및 산소의 흐름을 설정한다. 이 절차는 약 3 분 정도 소요됩니다.
3. 유도 챔버에서 동물을 가져 가라. 동물이 완전히 진정되었는지 확인하기 위해 꼬리 또는 발가락 핀치를 사용합니다.
4. 정밀 트리머가 눈까지 (귀 사이) 머리의 뒤쪽에서 머리를 면도 사용.
5. 정위 프레임에 동물을 배치하고 귀 막대 머리를 안정.
6. 1.5 %의 이소 플루 란과 0.3 L / 분 산소 마취 수준을 설정합니다.
7. 눈 연고를 적용합니다.
8. 각각, 염증, 통증 및 감염을 예방하기 Tolfedine (4 ㎎ / ㎏) Butomidor (2 밀리그램 / kg) 및 Baytril (5 ㎎ / ㎏)을 동물에 피하 주입한다.
9. 뇌 부종을 방지하기 위해 덱사메타손과 동물의 근육 (0.2 ㎎ / ㎏)을 주입한다.
   주 : 덱사메타손 피하 주사 또는 복강 내 근육의 손상을 방지 할 수있다.
10. (S)를 이용하여 피부를 닦아Betadine와 terile 면봉은 70 % 에탄올 하였다.
11. 장갑을 변경하고 70 % 에탄올로 스프레이.
    참고 : 멸균 필드를 터치하지 않는 일회용 장갑을 사용하는 동안. 단지 무균 수술기구 및 멸균 면봉의 팁 동물을 터치합니다.

2. 두개골 창 외과

1. 집게로 피부를 들어 올려 마이크로 가위가 눈의 앞 지점에 비스듬히 다음 머리의 기본을 따라 수평으로 피부를 절개하고 사용. 피부 플랩을 제거합니다.
2. 과도한 출혈과 통증을 방지하기 위해 골막에 멸균 면봉으로 리도카인 연고를 적용합니다.
3. 골막을 제거하기 위해 멸균 면봉이나 메스를 사용합니다. 멸균 면봉와 두개골을 건조.
4. 멸균 된 바늘을 사용하여 그들을 고정하고 치과 용 시멘트와의 접촉을 방지하기 위해 피부의 가장자리에 밀도 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용합니다. 접착제가 마를 때까지 기다립니다.
5. t 이상 멸균 3mm의 커브 글라스를하다lambdoid 봉합에 전방 그는 두개골. RSC에서 커버 슬립을 중심 좌표 : AP, 브레 그마 -2.8; ML은 멸균 된 바늘로 두개골 표면을 긁어서 0 표 커버 슬립의 가장자리를 정수리. 70 % 에탄올로 멸균 용기에 다시 커브 글라스를 넣습니다.
6. 3mm 직경의 원형 윤곽을 소경으로 버어 고속 치과 드릴을 사용한다. 멸균 식염수에 담근 면봉와 뼈 먼지 드릴링 사이트를 청소합니다. 가끔 출혈을 중지하고 뼈를 청소 gelfoam을하고 면봉을 사용합니다.
7. 드릴링 사이에서 부드럽게 뼈 원을 터치하고 이동성을 확인하여 미세 집게로 뼈의 두께를 확인합니다. 뼈 봉합의 지역에 두꺼운 있음을 알아 두셔야합니다. 뼈 원 모바일이며 뼈의에도 얇은 층 주상에 남아있는 경우 드릴링 중지. 식염수 담근 면봉에 남아있는 모든 뼈 먼지의 작동 필드를 청소합니다.
8. 드릴 CIR을 포함, 시추 지역에 멸균 생리 식염수를 삭제CLE. 조심스럽게 부드럽게 한 다음 미세 집게와 함께 뼈 원을 올립니다 단단히 위쪽으로 들어 올려 뼈를 제거합니다. 경질의 손상을 방지하기 위해 그것을 해제하는 동안 뼈 원을 왜곡하지 않도록주의하십시오.
9. 조심스럽게 출혈을 멈추게하기 위해 경질에 멸균 생리 식염수에 담가 gelfoam을 적용 할 수 있습니다. 모든 출혈이 완전히 중지 될 때까지 기다립니다. 조심스럽게 응고 과정을 방해하지 gelfoam을 제거합니다.
   참고 :이 시점에서 출혈이 깊은 것을 입증 할 수 있도록 봉합 영역이 매우 혈관이다. 출혈이 완전히 중지하는 것은 충분한 시간 동안 기다릴 필요하다. 얼음에 배치하여 냉각 식염수 젖은 gelfoam을 유지하는 것이 도움이된다.

3. 바이러스 감염

1. 정위 타워에 주입 펌프를 부착하고 컨트롤러를 연결합니다.
2. 주사기에 35G 바늘을 삽입합니다. 그것을 소독 에탄올로 주사기 10 번 세척 및 멸균 식염수 10 회 전자의 흔적을 제거하는thanol. 주사기에서 공기 방울을 제거합니다. 펌프에 주사기를 삽입합니다.
   참고 : 다른 소독제를 사용하는 것이 좋습니다.
3. (10 ~ ¹² PFU 권장) rAAV2 / 1 ^{mCherry 준비의} 단일 투여 량을 해동 얼음에 보관하십시오. 바이러스 솔루션과 주사기를 입력합니다.
4. 브레 그마에 바늘을 중앙에 다음 조심스럽게 다음 좌표를 사용하여 해마에 삽입 : AP -2, ML +/- 1.0, DV -1. 이 좌표는 개두술의 가장자리 근처에 위치한다. 조직 안정화를 위해 5 분 동안 기다립니다.
5. 50 NL / 분의 속도로 rAAV2 / 1 ^{mCherry 용액} 0.7 μl를 주입한다. 바이러스가 완전히 흡착하는 10 분을 기다립니다. 조심스럽게 바늘을 제거합니다. 출혈이 발생하는 경우 gelfoam을 함께시킨다. 반대측 사이트와 반복합니다.

4. 두개골 창 주입

1. 드릴 원 프레임의 경질의 상단에 살균, 건조 커브 글라스를 놓습니다. forc와 커브 글라스를 잡고분기 EPS 부드럽게 경질을 평평하고 커브 글라스을 가지고 '두개골 표면에 가까운 가장자리.
   참고 : 커브 글라스가 응고와 출혈이 다시 시작을 방해하는 것이 가능하다. 이런 경우, 커브 글라스를 올려 알코올, 건조에 배치 2.9 단계로 복귀.
2. 멸균 된 바늘이 커브 글라스 가장자리에 짙은 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용 사용하면 두개골에 첨부합니다. 접착제가 마를 때까지 기다립니다.
3. 두개골의 앞 부분에있는 고정 바 (M2 너트 또는 사용자 정의 만든 디자인)을 놓습니다. 바의 가장자리에 걸쳐 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용합니다. 접착제가 마를 때까지 기다립니다.
   1. 세션 이미징 동안 두개골 윈도우의 수평 위치를 사용하는 위치에 고정 줄​​을 놓습니다. 창에서 가능한 한 멀리 떨어져 배치합니다. 이 윈도우에 너무 가깝게 배치되는 경우, 맞춤형 홀더를 연결 바 나사 촬상 과정 대물위한 걸림돌 포즈 것이다.
치과 아크릴을 준비하고 유리 주위의 두개골 표면에 적용됩니다. 이 창 주위 분화구 형상을 형성하는 것이 도움이된다. 그것은 물 목적으로 이미징 나중에 적용 물 공동을 생성합니다.
4. 두개골 창 주위의 분화구를 강화, 운영 영역, 피부 가장자리, 고정 줄​​의 나머지 부분을 덮고, 치과 아크릴과 모자를 만듭니다. 치과 시멘트가 경화 될 때까지 기다립니다.
5. 정위 프레임에서 동물을 제거하고 회수 챔버에 넣어.
6. 생리 기능을 관찰하면서 동물이 수술에서 회복까지 기다립니다.
7. 48 시간 동안 수술 후 진통제 (카프로 펜, 10 ㎎ / ㎏) 및 항생제 치료 (baytril, 5 ㎎ / ㎏)을 적용합니다.

5. 이미지

1. 전원을 현미경, 사파이어 레이저 : 티를 시작합니다. 이 실험에 사용 된 시스템은 두 개의 광자 레이저, OPO 시스템과 이중 하나로 이루어질의 PMT를 구비한다.
2. induc에서 동물을 넣어기 챔버 마취를 유도한다.
3. 현미경 가스 마취 마스크 유도 챔버와 장소에서 동물을 제거합니다. 0.3 L / 분의 산소 유량과 1.5 %의 이소 플루 란 농도를 감소시킨다.
4. M2 나사 (또는 다른 사용자 정의 시스템)와 사용자 정의 현미경 프레임에 동물을 고정합니다. 두개골 창을 수준.
   주 : 특정 맞춤 프레임 나은 결과 (개선 된 헤드 안정성 만성 실험 기간 동안 다수의 세션에서 일정한 위치)를 제공하지만 현미경 제조업체 헤드 고정 시스템을 사용하는 것이 가능하다.
5. retrosplenial 피질의 측면 중 하나에 위드 현미경 설정 및 낮은 배율 목표 중심 뷰를 사용하고, 커버 슬립의 표면에 초점을 맞 춥니 다.
6. 분화구 모양의 아크릴 우물에 물 방울을 적용합니다. 장거리 침수 목표로 전환합니다. 물 메 니스 커스 콘 때까지 두개골 창으로 목표를 이동시편과 목표를 nects.
7. 두 광자 설정으로 전환하고 가장 낮은 줌을 사용하여 바닥에 시편 위로를 스캔 시작합니다. 뇌경막의 교차점 높은 비 특정 신호의 섬광으로 볼 수 있습니다.
8. 전체 동적 범위를 커버하기 위해 형광 세포에서의 신호 강도에 따라 두 채널 (GFP 및 mCherry)의 현미경 취득 설정을 조정한다.
9. (다른 세포로부터 분리 된 수지상 나무) 적절한 신경을 찾은 후 가장 낮은 줌과 5 미크론의 Z-거리 만 GFP의 filterset를 사용하여 초기 검사를 수행합니다.
10. 스캔 한 스택의 최대 투사를 구하여 (반전 색상을 사용하여) 주석을 위해 그것을 인쇄 할 수 있습니다.
11. 원하는 형태 세부 이미지에 수의 값으로 줌을 설정합니다. 이미지 기준으로 최대 투사를 사용하여 GFP 및 mCherry 채널의 전체 수지상 나무.

Results

Thy1-GFP 기자 마우스에서 신경 세포의 일부에서 GFP의 발현은 대뇌 피질의 수상 돌기 및 RSC에서 지역 축삭 돌기의 생체 내 이미징에 있습니다. 그림 1a는 눈에 보이는 여러 GFP 양성 수상 돌기 이미지의 스택의 최대 투사를 보여줍니다. 세포체는 동맥에 의해 가려한다.도 1b는도 1a에 표시된 수지상 분기의 단일면 확대 이미지 (디지털 줌 3 배)를 보여줍니다. 수지상 형태 (쪽, filopodia)의 세부 사항은 명확하게 볼 수 있습니다. GFP 채널 대역 방출 500-550 nm의 필터를 사용하여 획득된다.

지느러미 해마에 rAAV2 / 1 ^mCherry의 주입은 RSC에 종료 해마 축삭과 시냅스 부 튼스의 시각화 할 수 있습니다. 이러한 단자 mCh...

Discussion

현재 논문에서 우리는 두개골 창을 통해 RSC에서 시냅스 입력과 시냅스 대상의 생체 내 이미징에서 동시에 두 광자를위한 프로토콜을 제시한다. 주입 절차는 몇 가지 주요 단계로 구성되어 있습니다. 첫째, 동물 깊이 마취 및 정위 프레임에 고정되어, 다음 RSC를 통해 두개골이 표시된 원형 라인을 따라 드릴 원형 뼈를 제거하여 얇게된다. 출혈이 중지되면 rAAV2 / 1 ^mCherry는 해마에 주입하고, 커버 유리 천공 영역 위에 두개골에 고정된다. 마지막 고정 막대가 헤드에 고정되며, 동물은 48 시간 동안 회수 챔버에 배치된다. 약 2~3주 바이러스 발현에 필요한 후, RSC는 가시화 될 수있다. 촬상 프로토콜은 다음과 같은 단계를 포함한다. 첫째, 동물은 마취 현미경으로 고정된다. 다음 위드 현미경을 사용하여 설정되어 초점 시스템이다 SWI이광자 모드 tched 관심있는 채널 (GFP 및 mCherry)이 가시화된다.

발표 기술은 앞에서 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<강력한>약물
이소플루란	박스터	에어라인 8DG9623	수술 전 5-2%
이소플루란	박스터	에어라인 8DG9623	1.5-2% 수술 중
덱사메타손	스캔 수의사	덱사손 2mg/ml	0.2 mg/kg 근육 내
바이	엘	2.50%	5 mg/kg 피하
톨페딘	베토퀴놀	4%	4 mg/kg 피하
Butomidor	Richter Pharma	10 mg/	ml 2 mg/kg 피하
Carprofen	KRKA-Polska	Rycarfa 50mg/ml	10 mg/kg 피하
리도카	인 Jelfa	리그노카이늄	국소 투여
리도카인	Jelfa	20 mg/g
Surgery
Gelfoam	Ethicon	Spongostan 치과; REF MS0005
눈 연고	Dedra	Lubrithal	국소 CA
접착제	Pelikan Daniel	20G Huste
치과 아크릴	SpofaDental	Duracryl Plus
입체 프레임	스톨팅	51500D
Tool
Coverglass	Harvard 장치	: HSE-64-0720	3mm 직경
치과 드릴	Sigmed	Keystone KVet
고정 바	맞춤형	N / A	M2 또는 M3 나사 너트를 사용할 수 있습니다
집게	Renex	PN-7B-SA
마이크로 가위	Falcon	BM.183.180
해부 현미경	KOZO	XTL6445T
Imaging
Holder frame	Custom made	N/A
Two-photon microscope	Zeiss	Upright Axio Examiner Z1	Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm, 광학 파라메트릭 발진기 1050-1300nm. 목표: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 및 LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. 검출: Zeiss 대역통과 필터 BP 500-550 (GFP) 및 BP 570-610 (mCherry)은 560nm에서 빔 스플리터로 분리되고 두 개의 GaAsP 광검출기에 결합됩니다.
Reagent
Virus	gift from K. Deisseroth		CaMK promoter의 통제하에 형광 단백질 mCherry를 발현하는 재조합 아데노연관 바이러스(rAAV)