방법 논문

망막 리본 시냅스에서 막 수용체의 고해상도 양이 Immunogold 분석

DOI:

10.3791/53547

⸱

2016년 2월 18일

 ,  ,  , 
1Synaptic Physiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Advanced Imaging Core, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

postembedding immunogold 방법은 특정 분자의 세포 내 국소화에 대한 고해상도 분석을 제공하는 가장 효과적인 방법 중 하나입니다. 여기에서는 망막 리본 시냅스에서 글루타메이트 수용체를 정량적으로 분석하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

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망막 신경절 세포(Retinal ganglion cell, RGC)는 양극성 세포로부터 흥분성 글루타메이터성 입력을 받습니다. 망막 신경절 세포의 시냅스 여기(synaptic excitation)는 NMDA 수용체(NMDAR)와 AMPA 수용체(AMPA receptor, AMPARs)에 의해 시냅스 후 매개됩니다. 생리학적 데이터에 따르면 망막 신경절 세포의 글루타메이트 수용체는 시냅스후뿐만 아니라 시냅스주위 또는 시냅스외막구획에서도 발현됩니다. 그러나 망막 신경절 세포(RGC) 시냅스에서 글루타메이트 수용체의 정확한 해부학적 위치는 결정되지 않았습니다. 중앙 시냅스에서 글루타메이트 수용체에 대한 고해상도 정량 분석이 널리 사용되지만 이 방법은 망막에서 제한된 성공만 거두었습니다. 우리는 막 수용체 분석을 위한 postembedding immunogold 방법을 개발하여 망막 리본 시냅스에서 이러한 수용체의 수, 밀도 및 가변성을 추정할 수 있게 했습니다. 여기에서는 1) 망막 고정의 성공적인 준비, 2) 동결 치환, 3) 면역금 전자 현미경(EM) 면역세포화학(EM) 삽입 후 및 4) 리본 시냅스에서 글루타메이트 수용체의 정량적 시각화에 필요한 도구, 시약 및 실제 단계에 대해 설명합니다.

서론

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글루타메이트는 망막 1에서 주요 흥분성 신경 전달 물질이다. 바이폴라 전지 (2)로부터 글루타메이트 시냅스 입력을 수신하는 망막 신경절 세포 (망막 신경절 세포)는, 뇌 영상 정보를 전송 망막의 출력 뉴런이다. 생리 학적 연구는 망막 신경절 세포의 시냅스 여기가 NMDA 수용체 (NMDARs)와 AMPA 수용체 (AMPARs) 3,4,5에 의해 postsynaptically 매개되는 것으로 나타났다. 망막 신경절 세포의 흥분성 시냅스 후 전류 (EPSCs)가 AMPARs 및 NMDARs에 의해 매개되어 있지만 망막 신경절 세포에 3,5,6,7,8, 자연 미니어처 EPSCs (mEPSCs)는 만 AMPARs 매개 구성 요소 4,5,9을 나타낸다. 그러나, 글루타메이트 흡수를 감소시키는 것은 RGC의 수상 돌기에 NMDARs이 흥분성 시냅스의 외부에 위치 될 수 있음을 시사 자발적인 EPSCs 5 NMDAR 구성 요소를 한 것으로 밝혀졌습니다. 막 - 관련 구아닐산 키나제 등 PSD-95 (MAGUKs)이 글루타메이트 수용체 이온 채널을 포함한 클러스터 신경 전달 물질 수용체시냅스 부위에서의도 구별 subsynaptic 10,11,12,13,14 발현 패턴을 나타낸다.

최근 수십 년간, 촛점 면역 사전 매립 전자 현미경 (EM) 면역 위에 막 수용체 발현을 연구하기 위해 사용되었다. 촛점 면역 수용체 발현 넓은 패턴을 보여준다하더라도, 그 해상도가 낮은 것이 불가능 세포 내 위치를 구별하는 데 사용할 수있다. 포유 동물의 망막에 사전 내장 EM 연구는 NMDAR의 서브 유닛이 콘 바이폴라 전지 리본 시냅스 15, 16, 17에서 시냅스 요소 내에 존재 함을 나타냅니다. 이것은 생리 학적 증거 명백 대조적이다. 그러나, 반응 생성물의 확산을 미리 매립 immunoperoxidase 방법에서 공지 된 이슈이다. 따라서,이 방법은 일반적으로 통계적으로 신뢰할 수있는 데이터를 제공하지 않습니다 및 extrasynaptic 막 18,19,20,21 대 시냅스 막에 현지화 사이의 구별을 제외 할 수 있습니다. 에다른 한편으로는, 생리 및 해부학 적 데이터는 망막 신경절 세포 3,5,7,9,22에 AMPARs의 시냅스 현지화과 일치한다. 따라서, 망막 리본 시냅스에서 글루타메이트 수용체와 MAGUKs는 시냅스에뿐만 아니라 perisynaptic 또는 extrasynaptic 막 구획뿐만 아니라 현지화됩니다. 그러나, 망막 리본 시냅스에서 이들의 막 단백질의 고해상도의 정량 분석​​이 여전히 필요하다.

여기서는 콜레라 독소 소단위 B를 사용하여 라벨 (CTB)를 래트 망막 신경절 세포 상 시냅스에서 이들 단백질의 개수 밀도 변동을 추정 하였다 NMDAR 소단위, AMPAR 소단위와 PSD-95 subsynaptic 현지화를 검사 postembedding EM의 immunogold 기술 개발 역행 추적 방법.

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프로토콜

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관리 및 동물의 처리는 NIH 동물 관리 및 사용위원회의 가이드 라인에 따라했다. 12 시간 빛 : 출생 후 하루 (P) 양측 우수한 둔덕을 통해 1-1.2 % CTB를 주입 15-21 흰쥐는 12 일 유지 하였다 어두운주기를.

1. 망막 조직 고정

  1. 해부 현미경, 아주 좋은 팁, ​​가위, 셀룰로오스 필터 종이, 플라스틱 피펫과 현미경 슬라이드 2 집게 다음 재료 및 도구를 조립합니다.
  2. 2.0 ml의 할로 탄 (흡입 마취제)와 밀폐 된 챔버에 쥐를 마취. 발가락 핀치, 또는 깜박임 반사의 부족 후 후방 발의 철회의 부족 :이 방법으로 적절한 마취를 결정합니다. 그런 다음 단두대 즉시 목을 베다. pH가 7.4에서 0.1 M 인산 완충액 (PB)에 4 % 파라 포름 알데히드를 포함하는 유리 접시에 홍채 가위 쌍의 장소 눈을 제거합니다.
  3. 해부 현미경을 사용하면, 옥수수를 제거안구의 전면을 차단하여 개. 집게와 내부 망막 표면에서 렌즈와 유리체를 제거합니다.
  4. 망막이 아이 컵에서 분리 될 때까지 두 집게로 공막 껍질.
  5. 면도기 200 μm의 두께 스트립, pH의 변화 고정 대상 - (100)에 즉시 망막을 잘라.
  6. 실온에서 20 분 - 10의 pH 10.5에서 30 분 다음에 4 % 파라 포름 알데히드를 더한 0.01 %의 글루 타르 알데히드 - 20 pH가 6.0에서 0.1 M PB 4 % 파라 포름 알데히드의 망막 스트립을 수정합니다.
  7. (4 ℃에서의 pH 7.4), 0.15 mM의 CaCl2를 가진 PB 여러 회 세척 한 후에 0.1에서 (30 %의 O / N 후, 10 %, 20 %, 30 %로 각각 60 분) M 글리세롤 망막 스트립 cryoprotect 대체를 동결하기 전에 PB.

2. 동결 대체

참고 :이 동결 대체 방법은 이전에 게시 된 프로토콜 (19, 20)에서 수정됩니다. 또한, 악기 (장갑을 착용) 매우 추운 것을 매우 중요하다; 영형악기를 터치하면 therwise, 조직을 부분적으로 해동 수 있습니다. 이 단계의 모든 AFS 챔버 내에서 수행되고 악기는 챔버의 가장자리 위의 이동이 허용되지 않습니다. 유사하게, AFS에 사용 된 모든 화학 물질의 적절한 냉각이 필요하다.

  1. - 플 런지 동결 EM의 냉동 보존기구 (CPC)에서 -184 ° C에서 액체 프로판의 망막 스트립. 좋은 브러시를 사용하여, (브러시를 사용하여 별도의 버퍼를 심지) 급락로드의 끝에 가서 금속 스텁에 부착 된 양면 테이프의 작은 조각에 샘플을 배치합니다.
  2. 액체 프로판으로 봉 런지 약 5 초 동안 거기에 유지하고, 액체 질소로 채워진다 작은 이송 챔버를 이용하여 자동 동결 교체기구 (AFS)으로 전송 ( "LN 2 크라이 이송 컨테이너를 냉각 ').
  3. AFS에 냉동 샘플 및 기기 (집게와 메스)를 배치 한 후, 그 자체에 대한 실에서 악기를 냉각veral 분 조직을 터치하거나 작은 이송 챔버에 몇 초 동안 기기의 팁을 배치하여 이들을 냉각하기 전에 (액체 질소 충전 () LN 2 크라이 이송 컨테이너를 냉각 ').
  4. AFS에서하면 벌금 메스를 사용하여 스텁에서 샘플 테이프를 제거합니다. 또한, 질소 가스의 유량 제어를 유지 TF 이러한 과정에서 오픈 (TF는 'LN이 증발기 용 조정기 제어'라고 기재 함).
  5. (AFS를 설정하기 전에, IE) 평면 매립 홀더에 고정 된 조직을 배치하기 전에, 투명 플라스틱 시트 얇은 원형 절단 각 웰의 바닥 라인하도록 홀더의 하부에 배치. 완료 할 때 중합 시험편 블록 비교적 쉽게 제거 할 수있다.
    참고 : 이전에, 우리는 두 번 라이 헤르 + 젤라틴 캡슐 (Petralia와 Wenthold, 1999 참조) 사용하는 평면 삽입 홀더에 다른 방법을 사용하고, 20.
  6. = 4 ° C / 시간 (11.3 시간), T2에 의해 32 시간, S1은 = 증가 온도 T1 = -90 ° C ~ -45 ° C ~ 50 시간, S2에 대한 : AFS (악기 용어를 사용)에서 다음 자동 시퀀스를 사용하여 = 5 ° C / 시간 (9 시간), (총 = 142.3 시간) 40 시간 동안 T3 = 0 ° C로 증가 온도. 이전에 Timed 시퀀스를 시작하기 (-90 ° C에서) AFS에서 샘플을 배치하는 4 시간은 2 - 걸릴 수 있습니다.
  7. AFS에서> 32 시간 동안 -90 ℃에서 메탄올 1.5 % 우라 닐 아세테이트에 얼어 붙은 섹션을 담가. 평면 포함 알루미늄 홀더에 일곱 우물의 각 조직 (일반적으로) 두 가지를 놓고 (세 AFS에 맞게).
    1. 우물에서 우라 닐 아세테이트 / 메탄올로 조직 + 테이프를 놓고는 테이프에서 조직을 제거 너무 어려운 경우, 직전에 침투 (예 : Lowicryl HM20)를 시작 포함 매체에, 나중에 테이프를 제거합니다.
  8. 이어서, 온도를 단계적으로 증가 시간 당 -45 ° C (+ 4 ℃로; 자동 순서대로).
  9. 각 플랫 포함 홀더에서 기존의 용액을 제거하기 위해 뾰족한 플라스틱 피펫을 사용하여, 다음 예비 냉각 신선한 메탄올을 추가하는 또 다른 표준 플라스틱 피펫을 사용하여, 미리 냉각 된 메탄올의 샘플을 세 번 씻으십시오.
  10. 1, 2 :이어서, 동일한 방법을 사용하여 예 1의 매체 (HM20은 / 메탄올 매립 낮은 온도 매립 수지 점진적 샘플 침투 2 시간 동안 순수 수지이어서 2 시간 동안 한 각 후 수지를 변경할 등) O / N을 유지합니다.
  11. 단지 웰의 상단에 도달하는 수지의 레벨을 조정 다음날 다시 수지를 변경한다.
  12. 샘플을 중합 (-45 ° C 자동 시퀀스에서 0 ° C로, 시간 당 + 5 ° C) 40 시간 동안 UV 빛.
  13. 그런 다음 AFS에서 샘플을 제거합니다. 일반적으로 샘플 블록은 여전히​​ 색상에 약간의 핑크색을 보여줍니다. RT O에서 화학 물질 흄 후드에서 형광 빛에 가까운 샘플을, 배치 / N 이상 그들이 때까지 앱귀를 완전히 취소합니다.

3. Postembedding EM Immunogold 면역 세포 화학

참고 : 23,24,25 설명 된대로 Postembedding의 면역 세포가 수행된다.

  1. 1 % 톨루이딘 블루와 1 ㎛을 Ultramicrotome와 부분, 얼룩 부분을 잘라 및 단면 방향을 위해 그들을 검사; 절편의 최적의 횡단면을 달성하기 위해 조직 블록의 방향.
  2. 을 Ultramicrotome 70 nm 두께의 얇은 부분을 잘라 Formvar - 탄소 코팅 니켈 슬롯 그리드에 그들을 수집합니다.
  3. 워시는 TBS 버퍼 세 번 (TBS, 0.05 M 트리스 완충액, 0.7 %의 NaCl, pH를 7.6) 세척 한 다음 증류수 H 2 O에 한 번 메쉬.
  4. 하나 NMDAR 소단위 (항 - 토끼 GluN2A 1:50 항체 : 염소 항 - CTB를 함유하는 혼합물을 20 μL의 방울 (3000 1)의 다음, 30 분 동안 TBS 5 % BSA 20 μL 떨어진다 그리드 부화 및 , GluN2B 1:30)을, 또는 항 - 토끼 GluA2 / 3 (1:30)을2 % BSA와 TBS-트리톤 (TBST, 0.01 % 트리톤 X-100, 산도 7.6) 및 0.02 M NaN이 3 O / RT에서 N.
  5. 5 분 TBS (산도 8.2) 다음 세 가지 별도의 10 TBS 방울 (20 μL) (PH 7.6), 10, 20 분에 세척 그리드.
  6. TBST에 18 나노 금 입자에 결합 된 10 나노 금 입자와 당나귀 방지 염소 IgG에 (1:20)을 수행 결합 당나귀 항 - 토끼 IgG를 (1:20)를 포함하는 혼합물의 방울에 2 시간 (20 μL)에 대한 그리드를 품어 2 % BSA 및 0.02 M NaN의 3 (PH 8.2).
  7. 초순수에 다음, 5, 5, 10 분 동안 TBS의 20 μl의 방울 (PH 7.6)에 그리드를 세척 한 다음 건조.
  8. 어두운 조건 하에서 각각 8 및 5 분 동안 증류하여 H 2 O 5 % 우라 닐 아세테이트 및 0.3 %의 납 시트르산 Counterstain과 그리드.
  9. 트리플 - 표지 실험, 그리드 부화 O / 항 - 염소 CTB의 혼합물 20 μL 방울 (1 : 3000)과 함께 RT에서 N, 항 - 마우스 PSD-95 (1 : 100), 및 항 - 토끼 GluN2A (1 : 50). 그런 다음 2를 2 시간 동안 그리드를 품다2 % BSA 및 0.02 M NaN이 3 TBST에 18, 10, 5 nm의 금 입자에 결합 된 IgG를 혼합 (PH 8.2) 0 μL 방울. 세척 사이에 항체 배양 후으로 대조 이중 라벨과 같은 절차를 유지합니다.
  10. 컨트롤 이차 항체 단독인가 된 수행 하였다.
  11. EM에보기 그리드 및 디지털화 된 이미지. 이 24 필요한 경우에만 밝기 및 대비를위한 어도비 포토샵 6.0에서 최종 수치를 처리합니다.

4. 정량

  1. 수동 8,000X 확대에 구멍이나 균열이없는 내부 얼기 층 (IPL)의 선택 영역은, 무작위 25000 배율에서 IPL의 전체 깊이를 합성 사진.
  2. 그들은) 역행 수송 CTB 신호 (큰 금 입자)가 포함되어, b)을 나타낸다 잘 정의 막은, 갈라진 틈 및 시냅스 밀도, C)는 적어도 두개의 작은 금 부분을 포함 할 때 원뿔 바이폴라 댓구에서 RGC 수지상 식별PSD 내의 icles 또는 extrasynaptic 세포막을 따라 하나 이상의 작은 금 입자.
  3. 정량 분석​​을 위해 상기 기준에 따라, 55 RGC 수지상 - (45)를 수집한다.
  4. PSD 및 NIH ImageJ에 소프트웨어 개별 RGC 덴 드라이트의 extrasynaptic 세포막의 길이를 측정한다. 같은 막 10 nm의 금 입자 내의 카운트 (7)의 평균 두께에 기초하여, 막 - 관련 - 세포막 26 9 내지.
  5. 선형 마이크​​로 미터 (금색 / μm의) 당 금 입자의 수​​가 입자 밀도를 계산한다. 각 금 입자의 중심 (시냅스 위치) PSD의 중간 또는 (extrasynaptic 위치) PSD의 가장자리 사이의 거리를 측정한다.
  6. 소프트웨어에 의해 통계 분석을 수행합니다. 수단을 비교하는 두 꼬리 t-테스트를​​ 사용합니다. 의미 P <0.05 결론 지었다. 달리 명시하지 않으면, 리포트 값으로 ± SEM (18)를 의미한다.

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결과

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이전 24, 25 설명한 바와 같이 여기에 제시된 결과는 쥐의 망막에서 RGC의 수상 돌기에 현저하게 다른 subsynaptic 현지화 GluA 2/3의 패턴과 NMDARs을 보여줍니다. RGC 수지상 정보에 GluA 2/3 immunogold 입자의 77 %가 가장 중심 시냅스 마찬가지로, PSD (도 1a) 내에 위치 하였다. 그러나 NMDARs은 하나 시냅스 또는 extrasynaptically에 있었다. GluN2A의 immunogold 입자의 83 %가 PSD 국소화되었다 (도 1C, 2A, 2B), 우선적 OFF 시냅스 및 금 입자의 PSD (도 2C)의 중심에서 더 농축 하였다. 반대로 GluN2B (96 %)에 대한 입자 라벨의 대다수는 모서리 180 nm에서 피크 입자 밀도와 주로 extrasynaptic 세포막 따라 분포, PSD

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토론

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우리는 성공적으로 정량 후 삽입 immunogold에게 EM을 네 가지 기술을 설명했다 : 1) 짧고 약한 고정, 2) 동결 대체, 3) 포스트 포함 immunogold 염색, 4) 정량.

EM의 immunogold는 얇은 조직 섹션에서 특정 단백질의 검출을 할 수 있습니다. 금 입자로 표지 된 항체를 직접 EM을 사용하여 가시화 할 수있다. 막 수용체의 subsynaptic 현지화를 검출하는 강력한 반면, EM의 immunogold 기술적으로 도전, 그리고 조직의 고정 및 처리 방법의 엄격한 최적화를 필요로 할 수 있습니다.

막 무결성 및 항원 사이의 최적의 균형을 유지하기 위해, 우리는 다른 고정 방법과 시간을 테스트했다. 예를 들어, 중앙 시냅스 (19, 20)에 postembedding EM NMDAR에 사용되는 성공적인 프로토콜은 망막에서 NMDAR 면역 반응을 감지하지 못했습니다. 이 연구에 부...

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공개 사항

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저자는 공개하지 않았습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 국립 보건원의 난청 및 기타 통신 장애의 신경 질환 및 뇌졸중의 국립 연구소 (NINDS) 및 국립 연구소 (NIDCD), (NIH)의 교내 프로그램에 의해 지원되었다. 우리는 NINDS EM 시설과 지원 NIDCD 고급 이미징 코어 (코드 번호 ZIC DC 000081-03)를 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
파라포름알데히드EMS15710
글루타르알데히드EMS16019
NaH2PO4시그마S9638
Na2HPO4시그마7782-85-6
CaCl2시그마C-8106
BSA시그마A-7030
트리톤 X-100시그마T-8787
NaOH시그마221465
NaN3JT 베이커V015-05
글리세롤Gibco BRL15514-011
Lowicryl HM 20Polysciences15924-1
Tris-BaseFisherBP151-500
TrisFisher04997-100
Anti-GluN2AMilliporeAB1555P희석 1/50
Anti-GluN2BMilliporeAB1557P희석 1/30
Anti-GluA2/3MilliporeAB1506희석 1/30
Anti-PSD-95MilliporeMA1– 046희석 1/100
당나귀 안티 토끼 IgG-10 nm 금 입자EMS25704희석 1/20
당나귀 안티 마우스 IgG-10 nm 금 입자EMS25814희석 1/20
당나귀 안티 마우스 IgG-5 nm 금 입자EMS25812희석 1/20
당나귀 안티 염소 IgG-18 nm 금 입자Jackson ImmunoResearch705-215-147희석 1/20
Formvar-Carbon 코팅 니켈 슬롯 그리드.EMSFCF2010-Ni
우라닐 아세테이트EMS22400-1
메탄올EMS67-56-1
리드 시트레이트라이카
라이카 EM AFS라이카
라이카 EM CPC라이카
초박 절개라이카
JEOL 1200 EMJEOL
액체 질소 Roberts 산소
프로판Roberts 산소
CTB목록 생물학 실험실1041 - 1.2%
Anti-CTB목록 생물학 실험실703희석 1/4,000
라이카

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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