Ciliopathy 마우스 돌연변이 달팽이관의 평면 셀 극성 표현형의 평가

요약

일차 섬모는 다양한 신호 경로에 영향을 미칩니다. 포유류 달팽이관은 평면 세포 극성(PCP) 신호 전달을 검사하는 데 이상적입니다. 섬모 기능 장애는 달팽이관 성장, 세포 패터닝 및 유모 세포 방향, PCP 판독에 영향을 미칩니다. 우리의 목표는 표현형 분석, 면역조직화학 및 주사 전자 현미경을 통해 마우스 달팽이관의 PCP 신호 전달을 분석하는 것입니다.

초록

최근 몇 년 동안 원발성 섬모는 수많은 신호 경로에 영향을 미쳐 발달 및 질병의 핵심 조절자로 부상했습니다. 섬모 기능과 관련이 있는 것으로 밝혀진 가장 초기의 신호 경로 중 하나는 평면 세포 극성(PCP) 신호라고도 하는 비표준 Wnt 신호 경로였습니다. 척추동물 발달 중 평면 세포 극성(PCP) 신호의 영향을 연구할 수 있는 가장 좋은 장소 중 하나는 포유류의 달팽이관입니다. 마우스 달팽이관의 PCP 신호 전달은 달팽이관 성장, 세포 패터닝 및 유모 세포 방향을 방해하며, 이 모든 것은 섬모 기능 장애의 영향을 받습니다. 이 프로토콜의 목표는 표현형 분석, 면역조직화학 및 주사 전자 현미경을 통해 발달 중인 포유류 달팽이관에서 PCP 신호 분석을 설명하는 것입니다. 수렴 및 확장의 결함은 달팽이관의 단축 및/또는 세포 패턴의 변화로 나타나며, 이는 발달하는 마우스 돌연변이에서 해부된 후 정량화할 수 있습니다. 입체섬모 다발 방향 및 키노실리아 길이 또는 위치의 변화를 관찰하고 면역형광 또는 주사전자현미경(SEM)을 사용하여 정량화할 수 있습니다. 세포 신호 경로 및 기타 생물학적 현상에서 섬모 단백질의 역할에 대한 심층적인 통찰력은 세포 및 발달 생물학에 대한 이해와 표적 치료 전략의 개발에 매우 중요합니다.

서론

차 섬모는 대부분의 포유 동물 세포의 표면에서 연장 긴 미세 소관 기반의 부속 기관입니다. 차 섬모는 종종있는 항상 셀 당 여러가, 운동성 섬모와 혼동하고, 그 목적은 막 표면에서 유체를 이동하는 것입니다 수 있습니다. 차 섬모 대조적으로, 감각 역할을 채택하고 그 결과 또한 감각 섬모라고합니다. 일단 오래 잊고,이 세포 기관은 최근 인간의 유전 질환 ^1의 다수와의 연결의 결과로 '재발견'되고있다. 이상적 신호 소기관으로 위치 된 일차 섬모 수많은 시그널링 조직 항상성 및 질병뿐만 아니라 중요 이는 많은 경로,뿐만 아니라 ^개발이 과정을 조절하는 것으로 나타났다.

섬모 기능 장애와 연관되는 것으로 도시 제 1 시그널링 경로 중 하나가 평면 셀 극성 (PCP) 경로라고도 비정규 Wnt 신호 전달 경로이었다 > 3. 처음 초파리에서 확인이 신호 캐스케이드, 배아 중요하다; 통합 및 확장 프로세스 특히와 상피 ^(4)의 평면에서 세포의 올바른 방향에 대해. 조절 단백질의 집합 코어의 연속 신호는 궁극적으로 세포 골격 재 배열로 이어질 및 평면 ⁵ 상피 세포의 조정 편광 될 방향 신호를 변환합니다. 융합과 확장의 과정은 절대적으로 연장하는 인공 와우 덕트과 올바른 휴대 패턴 ^(6)이 필요합니다. 이것은 PCP 경로의 활성화를 통해 조절된다으로 달팽이관 PCP 돌연변이의 가장 눈에 띄는 표현형 하나 무질서 감각 상피 ⁷ 단축 인공 덕트이다. 규제이 밝혀지지 남아 정확히 어떻게하지만 마찬가지로, 또한, 속눈썹이 부족 마우스 돌연변이는 이러한 통합 및 확장 표현형 ^8,9을 나타낸다.

통합 및 확장 프로세스가 인공 와우 덕트의 부산물 및 인공 와우 덕트 내의 감각 상피의 세포 패터닝 중요하기 때문에 ve_content는 ">, 개발 달팽이관은 척추 개발하는 동안 PCP 신호를 검사 할 수있는 이상적인 기관이다.의 기관 코르티, 인공 와우 덕트, 균일 ^(10)를 작동하는 달팽이관을 위해 지향해야 비 감각지지 세포와 mechanosensory 유모 세포로 구성되어 줄 전문 감각 상피에 주어진 용어입니다. mechanosensory 유모 세포 그렇게 때문에의 호출 cuticular 판에서 연장 stereociliary 번들 각 감각 헤어 셀 ^(11)의 (선 단면). mechanosensation 및 stereocilia 그들의 명칭에도 불구하고 차 트랜스 듀서로서 이러한 행위는 실제로 수정 액틴 필라멘트 기반의 미세 융모로 구성된다. 각 갈매기 모양의 머리 내 번들은, stereocilia의 세 행이 높은 주문 및 일반 PA로 구성됩니다계단 경우와 같은 방식으로 ttern. 리얼 미세 소관 기반 섬모가 되나 kinocilia는 stereociliary 번들 ^(12)의 발전 방향에 대해 요구된다. 각 머리 셀에, 하나의 kinocilium 물리적 stereocilia의 가장 높은 행 중앙에 인접하여 위치, stereocilia 번들에 부착된다. kinocilium의 정확한 기능은 명확하지 않다, 하나의 가설은 미세 융모 ^{(12)로부터} 성숙 kinocilium 모양으로 stereocilia를 '당겨'이다. 척추 동물에서, 달팽이관에 kinocilia은 일시적으로 만 존재하고 ^{11,13,14 청각의} 발병하기 전에 쥐의 유모 세포에서 후퇴.

심각하게 단축 인공 와우 덕트의 개발 달팽이관 결과에 섬모의 전체 손실, 잘못을 형성하고 stereociliary 번들뿐만 아니라 잘못된 위치에 기초 몸 ^8,9 잘못이 지향. 기능 섬모는 단지 섬모 axoneme 구성되어 있지 않습니다. 섬모와 관련된 많은 단백질기능은 기초 신체, 전이 영역, 또는 섬모 axoneme ¹⁵ 섬모 관련 하위 도메인에 지역화 단지에서 발생합니다. 중심체의 어머니 중심 소체에서 파생 된 기저 몸은 또한 세포체로 떨어져 섬모에서 연장 미세 소관에 대한 미세 소관 조직화 센터 및 세포 내 인신 매매뿐만 아니라 섬모 인신 매매를 규제 할 수 있습니다. 섬모 전이 영역은 섬모 기능이 섬모 화합물 ^(16)의 가져 오기 및 내보내기를 조직의 관점에서 규제되고 또 다른 영역이다.

정확한 메커니즘은 명확하지 않지만 ¹⁷ 여러 연구는 섬모 및 비표준의 Wnt (PCP 신호) 사이의 연결을 확인 하였다. 섬모와 PCP 유전자의 중복과 일반 세포의 이상으로 세포 극성의 감도, 어려운 직접 PCP 별 적자에 돌연변이를 링크 할 수 있습니다. PCP 시그널링 리드 아웃 중 하나가 기부 본체와 PRIMAR의 포지셔닝y를 섬모 따라서 보조 결함 차를 분리하는 도전이다. 제브라 피쉬와 마우스 돌연변이의 일부 연구는 ^{18 ~ 20 신호} 섬모와의 Wnt 사이에 연결을 제안 없었다. 데이터의 불일치 종, 조직, 또는 Wnt 신호으로 섬모 기여금 시간에 의존하는 차이를 반영 할 수있다. 기초 몸은 기능을 유지하는 경우 또한, 정상의 Wnt 응답 성이 유지 될 수 있습니다. 세포 신호 전달 경로와 다른 생물학적 현상의 섬모 단백질의 역할에 대한 깊은 통찰력 우리 세포 및 발생 생물학 이해뿐만 아니라 표적 치료 전략의 개발이 매우 중요하다.

프로토콜

사용하여 가장 일반적으로 CO ₂ 흡입 자궁 전위를 통해 기관 및 정부 지침과 규정에 따라 모든 동물을 안락사.

시약 1. 준비

참고 : 이전 시작에, 분석 수준의 화학 물질을 사용하는 모든 시약을 준비합니다. 달리 명시되지 않는 한 증류 분자 학년과 탈 이온수를 사용하여 솔루션을합니다.

1. 인산염 완충 식염수 (1X PBS)는 : H ₂ O 1 L에 PO ₄ 8g의 NaCl, 0.2의 KCl, 1.44g 나 ₂ HPO ₄ 0.24g KH _2를 용해하여 1X PBS의 1 L합니다 HCl을 7.4로 pH를 조정합니다. PBS 멸균 될 필요가없고, 실온에서 저장 될 수있다. 이 버퍼는 염화칼슘 _2의 MgCl _2없이 유의하십시오.
2. 파라 포름 알데히드 (4 % PFA는) : 환기 흄 후드에 1X PBS에 PFA의 4 % 용액을 준비합니다. 1X PBS의 1 L에 파라 포름 알데히드 분말 40g을 추가합니다. C 약 60 °로, 교반과 열을 용해하기 위해,천천히 수산화 나트륨은 pH를 상승하는 것이 현명 드롭 추가합니다. 분말이 용해되면, HCl로 7.4 pH를 조정 해 주어야합니다. 0.45 μm의 필터를 통해 여과하고, 분취 액을 동결. 각 실험에 대한 신선한 나누어지는을 해동.
3. 트리톤 완충액 : 0.1 M 트리스 -HCl 준비 (PH 7.5), 0.15 M의 NaCl, 0.1 M 트리스 -HCl (PH 7.5)의 1 L에 8.77 g의 NaCl을 용해시켜 0.1 % 트리톤 X-100 용액. 1 ml의 트리톤 X-100을 추가합니다. 용해 저어. 실온에서 보관 트리톤 버퍼입니다.
4. 트리톤 블록 : 트리톤 버퍼 9 ml의 염소 혈청 1 ㎖를 첨가하여 트리톤 완충액 10 % 염소 혈청을 준비한다. 4 ℃에서 보관하십시오. 차단 단계의 트리톤 블록 (200)에서 1의 희석에 항 - 마우스 IgG 팹은 프래그먼트 염소를 추가, 마우스에서 발생하는 일차 항체를 사용하는 경우.
   주 : 계획은 주사 전자 현미경 (SEM)에 대한 샘플을 사용하는 경우 아래와 같은 추가적인 시약을 준비한다.
5. 칼슘과 마그네슘 행크스 '균형 소금 솔루션 (HBSS)는 : 원액의 희석하여 HBSS의 1 배 솔루션을 확인하십시오멸균 증류수 H ₂ O에 HBSS 버퍼가 복잡하게 관여하고 위험이있는 바와 같이, 사전 제작 배 스톡 용액을 주문하는 것이 바람직하다. 일상적으로 사용 된 버퍼 HBBS의 최종 농도는 다음과 같습니다 : 1.26 mM의 _CaCl2를, 0.49 밀리미터의 MgCl ₂ -6H2O, 0.41 mM의 _황산 -7H2O, 5.33 밀리미터의 KCl, 0.44 mM의 KH ₂ PO _4, 4.17 밀리미터의 _NaHCO3, 137.93 mM의 NaCl을 , 0.34 mM의 나 ₂ HPO _4, 5.56 mM의 포도당.
6. 헤 페스 버퍼 : 1 L 1X HBSS 버퍼에 23.8 g의 HEPES를 용해하여, 1X HBSS에 0.​​1 M 헤 페스 솔루션을 준비합니다.
7. 주사 전자 현미경 정착액 (SEM 수정은) : 헤 페스 버퍼에 전자 현미경 수준의 글루 타르 알데히드 (2.5 %)과 파라 포름 알데히드 (4 %)을 희석하여 SEM에 대한 정착액을 준비합니다. 10 mM의 최종 농도 _{CaCl2를 추가.}
8. 1 % 사 산화 오스뮴 (OSO ₄₎ HEPES 완충 단계; 1 % 오스뮴 테트 록 사이드 물 : HEPES 완충의 산화 오스뮴의 원액을 희석 한 separatel무균의 Y는 1 %의 최종 농도로 H _{2 O를} 증류. 사 산화 오스뮴은 매우 독성이며, 가장 일반적으로 4 % 용액으로 판매된다.
9. (V / W) 탄닌산이 1 % : 50 ml의 0.5 g 타닌산을 녹여 멸균 증류수 H ₂ O 필터 0.45 세공 크기 필터를 통해 여과하여 멸균.
10. 등급 에탄올 용액 시리즈는 30, 50, 70, 90 및 95 % 에탄올 솔루션을 만들기 위해 멸균 증류수 H ₂ O 200 증거 에탄올을 희석. 최종 에탄올 린스를 들어, 100 % 에탄올 (200) 증명이 필요합니다. 마지막 헹굼 200 증거 에탄올 갓 열린 병을 사용합니다.

조직의 2. 선택

1. 이상적으로, 배아 일 16.5 (E16.5) 및 출생 후 하루 3 (P3)의 세 사이의 배아 또는 젊은 새끼를 검사합니다.
   참고 : 뼈 미로와 시간적 뼈의 골화는 마우스가 성숙 해부가 점진적으로 더 도전합니다. 또한 kinocilia은 유일하신 참 미세 소관 기반의 섬모는 인공 와우 유모 세포에서 발견개발 과정에서 후퇴 더 이상 성인 쥐에 없습니다.
2. 고정 후, 석회 성인 cochleae. 회전 3-4일의 microcentrifuge 관에서 2 ml의 EDTA (PBS의 4.13 %), pH를 7.3로 (3 절 참조) 뼈 미로, 해부 놓습니다. 매일 EDTA를 보충. 조직을 부드럽게 한 후, 증가 교반 nutator에 5 분 동안 1.5 ml의 이상 PBS 3 회에 헹군다.

3. 달팽이관 해부

1. 자궁 경부 전위 또는 CO ₂ 흡입을 통해 포스트 euthanization (100 % CO _2), 헤드를 제거합니다. 코에서 시작하여 꼬리 쪽 확장 시상 중간 선을 따라 머리를 해부, 동물의 크기에 따라 위의 메스 블레이드 또는 작은 쌍을 사용합니다. 포셉 한 쌍의 두개골의 각 반에서 뇌를 제거합니다. 내이의 개발 뼈 ​​미로를 포함 시간적 뼈를 식별합니다 (그림 1a에 화살표 참조).
2. 대한 한 쌍을 사용하여CEPS는 조심스럽게 두개골 (시간적 뼈)의 뼈 미로를 분리합니다. 해부 현미경이 작업을 수행합니다. 뼈 미로 아래에 부드럽게 집게를 실행하여 두개골의 뼈 조직을 멀리 Prise. 최대 P4에 동물의 뼈 미로는 여전히 연골하고 쉽게 파괴하지 않고 제거 할 수 있습니다.
3. 해부에 따라, 타원형 및 원형 창문을 취소하고 인공 와우 나선의 정점에 작은 구멍을 만들기 위해 해부 포셉의 팁을 사용합니다. 인공 와우 덕트의 추가 해부하기 전에 뼈 미로를 수정합니다. (3.7 참조​​) tectorial 막 쉽게 제거 할 수 있도록하기 위해 얼음에 5 분 동안 1.5 ml의 4 % PFA에 뼈 미로를 해결.
   참고 : tectorial 막의 제거가 필요하지 않은 경우, 더 이상 고정이 (4.1 참조 - 4.3)를 권장합니다. 이전에 인공 와우 덕트의 해부에 시간적 뼈의 간단한 고정은 해부 과정과 tectorial 멤브레인의 제거를 돕는다. 포스트 해부 및 코르티 기관의 노출, 작고에그녀의 고정이 필요합니다.
4. 또한 다음과 같이 인공 와우 감각 상피를 노출 뼈 미로를 해부하다. 절개를 용이하게하기 위해 PBS를 포함하는 블랙 실리콘 ELASTOMERE 코팅 해부 접시에 뼈 미로를 놓습니다. 필요한 경우 조직을 고정하는 minutien 핀을 사용합니다. minutien 핀을 사용하려면, 위쪽으로 향하게 달팽이 나선형의 복부 측면에 뼈 미로의 전정 부분을 통해 배치합니다.
   참고 : 검은 색 실리콘 ELASTOMERE 요리 : 불투명 한 검은 색을 얻기 위해 가루 숯으로 실리콘 ELASTOMERE의 기본 구성 요소를 섞는다. 경화제를 첨가하고, 하나 이상의 배양 접시 (유리 또는 플라스틱)에 붓는다. 진공 드라이 갇혀있는 공기 방울을 제거합니다. 드라이 요리 사용하기 전에 완전히.
5. 미세 집게는 (# 5) 인공 와우 덕트를 노출 외부 연골을 제거하기 위해 사용합니다. 타원형의 창에서 시작합니다; 타원형 창에 집게의 바닥 끝을 삽입하고 부드럽게 천천히 향해 위쪽으로 이동, 연골을 열고 들어 올립니다꼭대기.
6. 인공 와우 덕트의 노출 후, 복부 표면, Reissner의 멤브레인을 제거합니다. 인공 와우 덕트의 기지에서 Reissner의 멤브레인을 꼬집어 및 상향 모션을 벗겨 포셉의 벌금 쌍을 사용합니다. 감각 상피를 포함하여 인공 와우 덕트의 지느러미 측면을 시각화합니다.
7. (선택 사항) 아래에 설명 된대로 tectorial 막을 제거합니다. SEM 또는 kinocilium의 면역 조직 화학 또는 stereociliary 번들 tectorial 막을 제거합니다.
8. 달팽이관의 기지에 tectorial 막을 끼와 정점을 향해 위쪽으로 벗겨 집게 (# 55 또는 미세한)의 아주 좋은 쌍을 사용합니다.
   주 : tectorial 막은 어려운 식별 할 수있는 광학 분명하다. 보다 더 자주는 아니지만 막은 한 조각에서 떨어져 와서는 쉽게 가시화되지는 않지만이 코르티 노출 된 기관에서 뽑아 바와 같이, 하나는 저항을 느낄 수 있습니다.
9. 코르티 기관을 노출 한 후, 더 D와 같은 조직을 고정아래 escribed. 조직의 더 준비를 돕기 위해 전정 영역을 유지한다.

4. 고정

1. 일반 면역 조직 화학 염색을 위해 2 시간 동안 nutator에 4 ° C에서 1.5 ml의 4 % PFA의 해부 뼈 미로를 해결.
   참고 : 때문에 길이와 고정의 구성에 항체 및 항원 변이를 서로 다른 감도 요구 될 수 있으며, 각각의 항체에 최적화되어야한다.
2. 고정 후, 증가 교반 nutator에 5 분 동안 1.5 ml의 이상 PBS 3 회에 세척하여 샘플을 씻는다. 샘플을 처리하기 전에 몇 주 동안 4 ℃에서 PBS에 저장 될 수있다.
3. SEM에 대한 샘플을 준비하는 경우, 실온에서 2 시간 동안 (1.7 참조​​) SEM 수정에 시간 뼈를 해부 수정합니다. 1.5 ml의 이상 HEPES 완충 증가 교반 nutator에 5 분 동안 3 회에 세척하여 씻으십시오. 추가 처리까지 4 ° C에서 헤 페스 버퍼에 보관할 것. 주 이상 부부 저장의하지 않는 것이 좋습니다.

5. 면역 조직 화학

1. 평평한 바닥 96 웰 플레이트 잘 하나에서 해부 샘플을 면역 조직 화학 염색을 수행합니다. 또한, PCR 또는 microcentrifuge 관을 사용합니다. 이 처리를 용이하게하기 위해 뼈 미로 전정 부분을 보유하는 것이 바람직하다.
2. 교반과 함께 nutator에 RT에서 1 시간 동안 1.5 ml의 트리톤 버퍼에 배양하여 조직을 Permeabilize 하시려면.
3. RT에서 1 시간 이상 동안 0.5 mL의 트리톤 블록에서 배양하여 조직을 차단. 마우스에서 발생하는 일차 항체를 사용하는 경우, 200에서 1의 희석 (섹션 1.4 참조)에 블록 안티 - 마우스 IgG Fab 단편을 추가합니다. 이것은 크게 마우스 조직에 항 - 마우스 IgG의 비특이적 결합을 감소시킨다.
4. 교반과 함께 4 ° C에서 트리톤 블록 O / N에 희석 일차 항체와 조직을 품어. 항체 희석 사용되는 항체 (6.1 절 참조)에 따라 달라집니다. 또는 차 antibodie을 품어실온에서 2 시간 동안의. 이상적으로 0.5 ml의 차 항체 희석 최소한의 볼륨을 사용합니다. 항체가 제한된 경우 완전히 조직을 감싸고 항체 희석액 작은 볼륨을 사용한다.
5. 증가 교반 nutator에, 1.5 ml의 이상 트리톤 버퍼, 15 분 동안 3 회 최소로 세척하여 조직을 씻으십시오.
6. 제조 업체에 희석 형광 염료 복합 이차 항체와 조직을 품어하면 (일반적으로 1 : 200-1 : 1000) 농도를 권장 트리톤 블록에 nutator에 실온에서 1 시간 동안. 0.5 ml의 이차 항체 희석 최소한의 볼륨을 사용합니다.
   1. 3 분 전에 이차 항체 응집체의 비 특이 적 결합을 최소화하기 위해 사용 13,000 XG에 희석 된 이차 항체를 원심 분리기. 형광 염료를 photobleaching에 방지하기 위해 이후이 단계에서 빛으로부터 조직을 보호.
7. 단계 5.5에서와 같이,에서 15 분 동안 1.5 mL의 트리톤 이상의 버퍼, 3 회 최소로 세척하여 직물 세탁증가 교반 nutator. 준비가 될 때까지 4 ° C에서 PBS에 보관 샘플을 탑재.

6. 항체 선택

참고 : 권장 항체 및 희석의 소스는 특정 재료 및 장비의 표에 나열되어 있습니다. 섹션 5에 설명 된대로 항체 배양을 수행합니다.

1. 또는 항 아세틸-α-tubulin에 (1 : 800) : 미세 소관 기반 kinocilium를 시각화하기 위해 안티 Arl13b (1,000 일) 등의 섬모에게 axoneme 마커를 사용합니다. (200 1) 또는 다른 centrosomal 마커 γ-tubulin에 대한 항체를 사용하여 기저 몸을 시각화합니다.
2. 차 항체 보육에 여러 가지 형광 중 하나에 결합 - (1,000 300 1) 액틴 필라멘트 풍부한 stereociliary 번들을 시각화하기 위해, 팔로이 딘을 추가합니다. 또한 각 Phalloidin의 상피 머리 셀의 주위를 둘러싸는 피질골 액틴 필라멘트를 포함하는 다른 필라멘트 액틴 구조 라벨. 이 결정에 도움이됩니다각 머리 셀의 윤곽. 필요한 경우 : 안티 배리-1 (500 1)로 대체 막 마커를 사용합니다.
3. 또는 마이 오신 VIIA (1 : 1,000) : 마이 오신 VI (1000 1)에 대한 항체를 사용하여 인공 와우 유모 세포 레이블. 이러한 달팽이관 길이를 평가하는 경우 사용될 수있다.

참고 : 현미경의 요구 사항에 최적화 된 사용 적합한 형광 염료 복합 이차 항체.

7. 장착 및 이미지

1. PBS를 포함하는 블랙 실리콘 ELASTOMERE 접시에 샘플을 놓습니다. 미세 집게를 사용하여 인공 와우 나선에서 전정 영역을 제거합니다.
2. 아주 조심스럽게 인공 와우 나선의 기본 연골 및 중간 엽을 제거합니다. 나머지 달팽이 나선형 코르티 및 외부 고랑의 내부 고랑, 기관이 포함되어 있습니다.
3. 현미경 슬라이드에 배치 PBS의 드롭에 달팽이 나선형을 전송합니다. 원하는 경우, 한 차례에 해당 조각으로 인공 와우 나선을 분리합니다. 그러나이 단계는 필요하지 않으며, (L)로 이어질 수조직의 OSS. 인공 와우 유모 세포의 선 단면 (stereocilia 측) 커버 슬립을 향해 위쪽으로 향하도록해야합니다.
4. 상피 세포가 이동 자체에 겹치는 경우 심지 멀리 PBS 여과지의 흡착제 조직 또는 조각으로 부드럽게 달팽이 나선형의 위치를​​ 변경.
5. 직접 달팽이관 샘플에 장착 매체의 드롭을 추가하고 부드럽게 공기 방울을 피하기 위해주의하면서 상단에 커버 슬립을 배치합니다. 없음 스페이서가 필요하지 않습니다; 샘플에 직접 coverslip에 배치합니다. 장소에 커버 슬립을 유지하기 위해 추가 단계를 필요로하지 않는 수용성, 비 형광, 반영구적 설치 매체를 권장합니다. 설치 미디어 및 coverslip에 두께 사양을 현미경에 일치해야한다.
6. 인공 머리 셀의 혀끝의 표면의 이미지를 캡처하는 목적 - 높은 개구 수 (1.4 1.2) - 높은 배율 (100X 63)가 장착 된 epifluorescent 또는 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용합니다. 사용 보라WER 목표 (5 - 20 배)는 인공 와우 덕트의 길이를 정량화하는 달팽이 나선형의 이미지를 중첩 촬영합니다. 이차 항체에 사용되는 형광체에 일치 여기 레이저와 방출 필터.

8. 주사 전자 현미경

1. 4.3 절에서 계속합니다. 헤 페스 버퍼에 SEM 고정 샘플을 세척 한 후, 통풍에서 다음 단계를 수행하십시오. 다음 프로토콜 달팽이관 조직에서 잘 작동하고 도전성의 금속으로 스퍼터 코팅의 사용을 피한다.
2. 5 분마다 증류수 1ml를 3 회 세척 한 다음 1 시간 동안 HEPES 완충 1 % OSO ₄ 포스트 픽스. 완전히 조직을 감싸고 OSO _(4)의 최소 용적 독성 폐기물을 최소화하기 위해 사용되어야한다. 더 교반이 필요하지 않습니다.
3. 단계 사이에 5 분마다 1 ml의 증류수로 3 회 세척으로 1 시간 동안 다음과 같은 솔루션을 각각 실온에서 샘플을 품어 : 1 % 타닌산 갓 물과 FIL에서 만든사용하기 전에이 거행; 물에 1 % OSO _4, 물에 1 % 탄닌산, 물에 1 % OSO _4.
4. 30, 50, 70, 90, 95 % 희석 다음 각각 10 분 동안 인큐베이션 등급 에탄올 시리즈를 통해 탈수 샘플. 더 교반이 필요하지 않습니다.
5. (200 시험 에탄올 새로 열린 병) 100 % 에탄올 세 변경 5 분마다 통해 전송 샘플.
6. 제조업체의 지침에 따라 임계점 건조기하지만 샘플을 실행합니다.
7. 전자 현미경의 이미징 전에 SEM 스텁 위에 도전성 탄소 접착제를 사용하여 시료를 탑재. 실체 현미경에서 부드럽게 인공 상피면이 위를 향하도록하여 샘플의 위치를​​ 미세 집게와 붓의 쌍을 사용합니다. '앵커'그루터기에 조직에 샘플의 전정 부분을 사용합니다. 영상까지 데시 케이 터에 보관 샘플. (2012) ²¹ 존스에 설명 된대로 SEM 이미징을 수행합니다.

9.부량

1. 면역 조직 화학 준비 후, epifluorescent 또는 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 이미지를 획득. SEM 준비 후 이미지 표본 사형 전자 현미경을 사용한다. 이미지 노출 된 인공 와우 유모 세포와 인터지지 세포와 코르티 기관의 선 단면.
2. , 인공 도관을 따라 기지에서와 같은 25, 50, 75 %를 특정 위치를 정의하고 돌연변이 및 제어 샘플 사이의 달팽이관 영역을 비교하려면 다음을 사용합니다. 유전 적 배경의 차이가 인공 와우 표현형을 수정할 수, 분석 및 한배의 새끼 컨트롤과 섬모의 돌연변이를 비교합니다.
   참고 : 코르티 기관이 정점과베이스 모두를 향해 중간 기지에서 확장하는 그라데이션에서 개발하고 있습니다. 마우스에서 발달 P14까지 완료되지이므로 유사한 발달 단계 및 위치 영역들과 비교하는 것이 중요하다.
3. 여보세요 현미경을 동반하는 소프트웨어를 사용하여 촬영 한 사진특정 표현형의 정량에 필요한 와트 (아래 참조). , 길이를 측정 세포 수를 계산하고 아래에 설명 된대로 단백질 현지화를 결정하기 위해 현미경을 동반 같은 이미지 J 또는 소프트웨어로 이미지 분석 소프트웨어를 사용합니다. 그래프 돌연변이 대 제어를 비교하는 막대 그래프, 산포도, 상자 오점 또는 히스토그램, 이러한 데이터입니다.
4. 인공 와우 덕트 (그림 3A)의 총 길이 :
   1. (stereociliary 번들 부호) 모발 세포 마커 또는 팔로이 딘을 사용하여 결정하고 감각 상피의 시작과 끝 위치를 측정한다. 인공 도관의 길이는 대개 섬모 돌연변이로 단축된다.
5. Stereociliary 번들 이상 (그림 3B, D, E, G) :
   1. 다발의 정점과도 3G에 도시 된 바와 같이 다발 '아암'의 양단을 통해 연장 라인의 최단 거리로서 볼록 번들 (높이)를 측정 떠났다. 대안 적으로, 영역을 정량화오른쪽 그림 3G에서와 같이 외부 머리 셀 stereociliary 번들의 팔에 포함. 식별 될 수있는 원형 stereociliary 번들 모발 세포는 모발 전체 세포의 백분율이 계산 경우.
      참고 : 많은 섬모 돌연변이 체에서 번들 이상에 관계없이 번들 방향으로 관찰 할 수있다. 정확하게 stereociliary 번들 이상을 정량화하기 어렵다.
6. stereociliary 번들 (그림 3B, C, G)의 동향 :
   1. 내측 및 외측 유모 세포를 분리 기둥 셀의 행에 수직으로 연장되는 라인에 각 번들의 상대적 방향을 평가. 정상적인 방향으로 셀이 수직 축을 따라 정렬 등 0 °의 회전이됩니다. 0 °에서 360 ° 표기 또는 절대 편차를 사용하여 회전 각도를 결정합니다.
7. Kinocilia 위치 또는 stereociliary 번들 위치 (그림3B, F, H) :
   1. kinocilia 누락 된 세포의 비율을 계산. 번들의 '정점'또는 센터로 kinocilium까지의 거리를 측정한다. 다발의 "정점 '번들 비정상 등 다발의 중심이 대신 이용 될 수 있는지를 정의하는 것이 쉽지 않을 수있다.
8. 각 머리 셀에 위치 그리드를 중첩시키고 kinocilium의 염기 또는 stereociliary 다발의 정점 / 가운데 하나의 위치를​​ 표시하여, 정점 모발 세포 표면 kinocilia 및 stereociliary 번들 위치를 정량화. 그리드의 특정 영역 내에있는 각각의 카테고리에 대한 비율로하고, 하나의 격자 위치에 각각의 마크의 위치를​​ 중첩하여 데이터를 표시.
   주 : 조직 제어에 kinocilia 항상 stereociliary 다발의 정점에 부착된다. 섬모 돌연변이 체에서 kinocilia 종종 여전히 부착, 또는 완전히의에서 분리 아직 mislocalized, 누락tereociliary 번들.
9. Kinocilia 길이 (그림 3I) :
   1. 섬모 axoneme 마커와 라벨에 의해 kinocilium의 길이를 측정합니다. 만 1.5 μm의 공 초점 평면 내에서 평평 kinocilia을 측정한다. 섬모 스캔 조직의 단면도를 관찰하여 평면 누워 있는지 확인한다. kinocilium 개발하는 동안 후퇴 이후 달팽이관의 같은 지역에서 세 일치하는 샘플을 비교.
10. 극성 단백질 Mislocalization :
    1. 이러한 Vangl2 및 Gαi3 같은 극성 단백질에 대한 항체를 사용하여 면역 조직 화학에 따라, 영상을 통해 현지화를 결정한다.

주 : 일부 섬모 돌연변이 체에서, 극성 단백질의 현지화가 중단됩니다. 이들은 Ift20, Bbs8 및 Bbs6 돌연변이 달팽이관에 중단 될 것으로 나타났다 Vangl2 및 Gαi3을 포함한다.

참고 : 계량 및 디스플레이 헤어 셀 polarit하는 방법에 대한 추가의 예Y는 다음의 논문에서 찾을 수있다. 커틴, 등. (2003) 현재 생물학 ^(22), Montcouquiol, 등. (2003) 자연 ^(7), 왕, 등 (2006) 등 신경 과학 ^(23), Montcouquiol의 저널. 분자 생물학 ²⁴ 월-Simera, 등의 (2008) 방법. 분자 생물학 ²⁵ (2012) 방법, 음 등 (2012) PLoS의 한 ^26.

결과

와우 해부 및 조직 준비

뇌의 제거 후, (그림 1A, 흰색 화살표)를 시각화 및 제거 할 수 있습니다 뒤에서 본 P0 마우스 머리, 뼈 미로, 사후 중간 라인 시상 해부.도 1b는 인공 머리를 가진 격리 된 뼈 미로를 보여줍니다 위쪽, 복부 (왼쪽)와 뒤에서 마주 지느러미 (오른쪽). 타원형 창에 흰색 화살표 포인트는있는 사람은 외부 연골을 제거 시작할 수 있습니다. 외측 연골이 완전히 제거되면, 노출 된 인공 덕트는, 그대로 (도 1C)을 관찰 할 수있다. 해부를 지원하기 위해 전정 영역을 통해 핀의 위치가 표시됩니다. 서로 다른 각도로 배치 된 두 개의 핀은 또한 조직을 고정하기 위해 사용될 수있다.도 1d는

토론

분석을 위해 인공 조직을 준비 할 때, 명심 할 몇 가지 주요 사항이 있습니다. 우선, 유전 적 배경 차이는 필요한 분석에만 한배 새끼 컨트롤과 비교하게 인공 표현형을 수정할 수있다. 둘째, tectorial 막의 완전한 제거는 면역 조직 화학 최상의 이미지를 얻기 위해 필요한 및 SEM을 위해 필수적이다. tectorial 막은 불투명 한 구조 및 이미지가 더 도전하고, 그 아래에 직접 감각 상피의 세포를 모호하게 할 수 있습니다. 때때로 처리하는 동안, tectorial 막 머리 세포를 폭로, 다시 축소 할 수 있습니다. 이러한 경우에도 제거 강력히 권장합니다. 이 단계는 인내와 연습이 필요합니다. 셋째, 섬모 단백질, 고도로 압축 된 기초 신체에 지역화 특히 사람,에 대한 항체를 사용하여 면역 조직 화학 도전하고 최적화를 요구할 수 있습니다. permeabil을 강화, 항원 검색을 수행하는 것이 좋습니다이 단계 화되거나 또는 고정 농도의 시간을 감소시킨다. P1을 이후베이스 - 정점 구배 - kinocilium (인공 와...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
도구/장비
: 실리콘 엘라스토미어 - Sylgard 184	Sigma-Aldrich	761028-5EA	참고 2 참조
: 마이크로 해부 가위-직선 칼날	다양한
미세 집게(5번 및 55번) 및 무딘 집게	다양한
해부 현미경.	다양한
비코팅 유리 현미경 슬라이드	다양한
현미경 커버 슬립 (22 mm × 40 mm × 0.15 mm)	다양한
트랜스퍼 피펫	다양한
Minutien 핀	Fine Science Tools	26002-10
SEM 샘플 홀더	tousimis	8762
주사 전자 현미경 스터드	TED PELLA	16111
PELCO 탭: 탄소 접착제	TED PELLA	16084-3
형광 현미경	다양한
임계점 건조기	다양한
주사 전자 현미경	다양한
유리 현미경 슬라이드	다양한
유리 커버슬립	다양한
Kimwipe 티슈	다양한
미세 페인트 브러시
시약
1× 인산염 완충 식염수(PBS)	Gibco/Life Technologies	10010023
파라포름알데히드  (PFA) (EM에 필요한 EM 등급)	다양한		1×에 4% 용액을 준비합니다. PBS는 매번 신선합니다. EM에 필요한 EM 등급입니다.
2.5% 글루타르알데히드 Grade1	시그마-알드리치	G5882
트리스-HCl(pH 7.5),	다양한
NaCl	다양한
CaCl, 2
트리톤 X-100
일반 염소 혈청	다양한
AffiniPure, Fab Fragment, 당나귀, 안티 마우스 IgG(H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-007-003
Fluoromount-G 마운팅 미디어	SouthernBiotech	0100-01
10× 행크스의 Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco/Life Technologies	14065
Hepes	Gibco/Life Technologies	15630-080
Osmium tetroxide (OsO4 )	Sigma-Aldrich/Fluka Analytical	75632
Tannic acid	Sigma-Aldrich	403040
Ethanol 200 proof	다양한
항체
항 Arl13b	단백질 기술	17711-1-AP	권장 농도 1:1,000
항 아세틸화 튜불린 (611-B1)	Sigma-Aldrich	T6793	제안 농도 1:800
항 감마 튜불린 (GTU-88)	Sigma-Aldrich	T6557	권장 농도 1:200
항 Zo_1	Invitrogen	40-2300	권장 농도 1:500
Myosin VI	Proteus Biosciences	25-6791	권장 농도 1:1000
Myosin VIIa	Proteus Biosciences	25-6790	권장 농도 1:1,000
anti Vangl2	Merk Millipore	ABN373	권장 농도 1:250
anti Gα i3	Sigma-Aldrich	G4040	권장 농도 1:250
Alexa Fluor® 488 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12379	권장 농도 1:300 - 1,000
Alexa Fluor® 568 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12380	권장 농도 1:300 - 1,000