Slp1 중합체 및 단층의 AU-상호 작용 Lysinibacillus 스패 리 쿠스 JG-B53 - QCM-D, 생체 분자 - 금속 연구 도구로서 ICP-MS와 AFM

요약

수성 시스템에서 금의 흡착 및 재활용에 대한 기본 정보를 얻기 위해 S층 단백질에서 Au(III) 및 Au(0) 나노 입자의 상호 작용을 조사했습니다. 단백질 고분자의 흡착은 ICP-MS에 의해, 단백질성 단층의 흡착은 QCM-D에 의해 조사되었습니다. 후속 AFM은 나노 구조의 이미징을 가능하게 합니다.

초록

이 간행물에서는 Lysinibacillus sphaericus JG-B53의 표층(S-layer) 단백질(Slp1)의 금 흡착 거동에 대해 설명합니다. 이러한 생체 분자는 표면에 paracrystalline 2차원 배열로 배열되어 금속과 결합하므로 환경 및 산업 공정에서 다양한 원소를 제거하거나 회수하기 위한 생체 흡착 재료와 같은 여러 생명 공학 응용 분야에 흥미를 느낍니다. S-layer directed synthesis ¹ 또는 나노 입자의 흡착에 의한 Au(0) 나노 입자의 S-층 상에 증착은 다양한 감각 응용을 위한 새로운 가능성을 열어줍니다. 수많은 연구에서 S층 ^2-5의 생흡착 특성을 설명했지만, 단백질-단백질 및 단백질-금속 상호 작용에 대한 심층적인 이해는 여전히 어렵습니다. 다음 연구에서는 유도 결합 질량 분석법(ICP-MS)을 사용하여 부유 S-층에 의한 금속 흡착을 감지했습니다. 이는 QCM-D(quartz crystal microbalance with dissipation monitoring)의 측정과 상관관계가 있으며, 이를 통해 단백질질 단층 형성 및 금속 증착을 온라인으로 검출할 수 있으므로 금속 결합에 대한 보다 자세한 이해를 얻을 수 있습니다.

ICP-MS 결과는 부유 S-층 폴리머에 대한 Au(III)의 결합이 pH에 의존적임을 나타냅니다. Au (III)의 최대 결합은 pH 4.0에서 얻어졌다. QCM-D 조사를 통해 현장 실험 중에 실시간으로 Au(0)-NP의 증착뿐만 아니라 Au(III) 흡착을 검출할 수 있었습니다. 또한 이 방법을 통해 Slp1의 단백질 격자 안정성에 대한 금속 결합의 영향을 연구할 수 있었습니다. 구조적 특성과 단백질층 안정성은 원자력 현미경(AFM)을 사용하여 QCM-D 실험 직후에 시각화할 수 있었습니다. 결론적으로, 이러한 다양한 방법의 조합은 현탁액 또는 박테리아 세포 또는 재결정화된 표면에서 단층으로 사용되는 박테리아 S-layer 단백질에 의한 금속 결합에 대한 더 깊은 이해를 제공합니다.

서론

전자 인해, 촉매, 바이오 센서, 또는 의료 기기 등 여러 가지 응용 프로그램에 대한 금의 사용 증가로,이 귀금속의 수요는 최근 몇 년 ^6-9 시간 동안 성장했다. 무거운 또는 귀금속에 의해 대부분의 환경 오염에 대한 진행 과정이지만 골드뿐만 아니라 많은 다른 귀금속과 중금속, 광업 활동을 통해, 묽은 농도의 산업 폐수를 통해 환경으로 배출, 폐기물 처리 ^7,8,10된다 주로 과학 기술 활동에 의해 발생. 이는 자연 생태계의 중요한 간섭에 이르게 잠재적으로 인간의 건강 ^(9)을 위협 할 수 있습니다. 이러한 부정적인 결과를 아는 것은 새로운 기술은 산업 폐수에서 금속을 재활용 오염 된 생태계와 개선에서 금속을 제거하는 대한 검색을 촉진합니다. 침전 또는 이온 교환 등의 노포 물리 화학적 방법은 특히 높은에서, 그렇게 효과적이지 않다LY 솔루션 ^{7,8,11 희석.} Biosorption는 하나의 생활 또는 죽은 바이오 매스로, 폐수 처리 ^{(10, 12)에} 대한 매력적인 대안이다. 생물학적 물질의 사용은 독성 화학 물질의 소비를 줄일 수있다. 많은 미생물이 축적 또는 금속을 고정화 기술되었다. 예를 들어, Lysinibacillus 스패 리 쿠스의 셀 (L. 스패) JG-A12은 귀금속, 높은 결합능을 도시 한 예를 들면, 팔라듐 (II), 백금 (II), 금 (III), 및 납과 같은 다른 독성 금속 (II) 또는 U (VI) ^4,13, CR (VI) ¹⁴ 바실러스 메가 테 리움의 세포), 금 (Au에 대한 백금 (II) 및 Pd (II) ^(15), 그리고 클로렐라 저속한위한 사카로 마이 세스 세레 비지에의 세포 (III)과 U (VI) ^{(16) 17.} 금과 같은 금속의 결합 이전 (III), (II)도 Desulfovibrio보고 된 팔라듐 (II), 및 Pt는 ¹⁸ L.를위한 desulfuricans 스패 리 쿠스 JG-B53 ^{(19, 20).} 그럼에도 불구하고,하지 등L 미생물은 금속의 높은 금액을 결합하여 흡착 물질로서의 응용이 제한 ^{12,21입니다.} 또한, 용량을 결합 금속은 예를 들어, 다른 매개 변수, 세포 구성, 사용 된 바이오 구성 요소, 또는 환경 및 실험 조건 (PH, 이온 강도, 온도 등)에 따라 달라집니다. 고립 된 세포 벽 조각 ^{(22, 23)의} 연구는 막 지질, 펩티도 글리, 단백질, 또는 다른 구성 요소와 같이 복잡한 구성 전체 세포 ^8,21의 프로세스를 결합 금속을 이해하는 데 도움이됩니다.

이 연구에 초점을 맞추고 세포 구성 요소는 S-층 단백질이다. S-층 단백질은 많은 박테리아 및 고세균의 외부 세포 외피의 일부이며, 이들은 약 15 구성 - 이들 유기체의 총 단백질 질량의 20 %. 환경에 대한 제 1 인터페이스로서, 이러한 화합물은 세포 강하게 세균성 흡착 특성 ^{(3)에 영향을} 미친다. 분자량이 마흔에 이르기까지와 S-층 단백질kDa의 수백 개의 셀 내에서 발생되지만, 외부의 조립에 그들은 지질 또는 폴리머 막 세포벽 성분에 층을 형성 할 수있게한다. 고립되면, 거의 모든 S 계층 단백질이 자발적으로 인터페이스에서, 또는 평면 또는 튜브와 같은 구조 ^(3)을 형성하는 표면에, 정지에 자기 조립 고유 속성이 있습니다. 단백질 단일 층의 두께는, 세균에 따라, 5의 범위 내에 - 25 내지 ^24. 일반적으로, S-층 형성 단백질 구조는 35 내지 ^3,24에 경사 (P1 또는 P2), 정사각형 (P4), 또는 육방 정 (P3 또는 P6) 2.5의 격자 상수와 대칭을 가질 수있다. 격자 형성은 이가 양이온에 의존하고, 주로 ^{칼슘 25, 26, 라프, J. 등의} 많은 경우에 ^{보인다. S-층 단백질을 기반으로 설계된 나노 구조의 산업용 애플리케이션에 기반 나노 복합체. (EDS Tijana (Z) 그 로브 및 Aitziber L. Cortajarena) (스프링, 2}016 (제출)). 그럼에도 불구하고, 특히 ^칼슘 및 마그네슘 ^2+와 같은 이가 양이온 단량체 폴딩, 단량체 단량체의 상호 작용, 격자의 형성, 및 다른 금속의 역할의 전체 반응 캐스케이드는 아직 완전히 이해되지 않는다.

그람 양성 균주 L. ²⁷ (새로운 계통 분류 후 바실러스 스패 리 쿠스에서 이름) 스패 리 쿠스 JG-B53는 우라늄 광산 폐기물 더미 "Haberland"(Johanngeorgenstadt, 작센, 독일) ^{4,28,29에서} 분리 하였다. 기능적 S 층 단백질 (Slp1)가 정사각형 격자 116 ³⁰ kDa의 분자량, 및 박테리아 ^세포를 살아있는 ³¹ ≈에 10 nm의 두께를 갖는다. 이전 연구에서, 약 10 nm의 두께를 가진 닫힌 안정된 단백질 층의 형성은 시험 관내에서 10 미만 ¹⁹ 분에서 달성되었다. 관련 균주 L. 스패 리 쿠스 JG-A12은, 또한 "Haberland"더미로부터 분리가 높은 금속 결합 능력을 보유하고 그 격리 S 층 단백질은 금과 같은 귀금속에 대한 높은 화학적, 기계적 안정성 및 우수한 수착 속도를 보여 주었다 (III), 백금 (II), 및 Pd (II) ^4,32,33를. 귀금속의 결합이 어느 정도 특정 금속의 일부이고, 중합체의 외측 및 내측 표면에 단백질 및 기공의 관능기, 이온 강도의 가용성 및 pH 값에 의존한다. , OH-, PO ₄ - -, SO ₄ -, 및 SO-단백질에 의해 금속의 상호 작용을위한 관련 기능 그룹은 COOH-, NH _2이다. 원칙적으로, 금속 결합 용량은 응용 프로그램, ^{라프, 제이 등의} 다양한 스펙트럼을 엽니 ^{다. S-층 단백질을 기반으로 설계된 나노 구조의 산업용 애플리케이션에 기반 나노 복합체. (EDS Tijana (Z) 그 로브 및 Aitziber L. Cortajarena) (스프링 2016 (제출)).} 예를 들어, 같은 제거 또는 복구를위한 biosorptive 구성 요소용해 독성 또는 유가 금속의 합성 또는 정기적으로 구조화 된 금속 나노 입자 NPS () 촉매를 들어, 바이오 감각 층 ^3,5,18,33 같은 다른 생물 공학 물질의 정의 증착을위한 템플릿. 금 등을 규칙적으로 배열 NP 어레이 (0) -NPs는 CO 산화 ^34-37위한 분자 전자 및 바이오 센서, 초 고밀도 저장 장치 등이 있으며, 촉매에서부터 주요 애플리케이션에 사용될 수있다. 이러한 응용 프로그램 및 이들 재료의 세련된 디자인의 개발은 기본 금속 바인딩 메커니즘의 깊은 이해를 필요로한다.

이러한 바이오 기초 물질의 개발을위한 전제 조건은 상기 생체 분자와 기술 ^{(38, 39)} 표면 사이의 계면 층의 신뢰성 구현이다. 예를 들어, 고분자 전해질 층은 ^S-39 단백질의 재결정 계면 층으로 사용 된 층별 (LBL) 기술 ^40,41 조립 SUP. 이러한 인터페이스는 재현성 및 정량 방법으로 단백질 코팅을 수행하는 비교적 쉬운 방법을 제공한다. 접착 촉진제와 함께 수정없이 상이한 실험을 수행함으로써, 코팅 동력학, 층의 안정성 및 생 분자 ^{19,42, 라프, J. 등의} 금속과의 상호 작용에 관한 설명은 할 ^{수있다. S-층 단백질을 기반으로 설계된 나노 구조의 산업용 애플리케이션에 기반 나노 복합체. (EDS Tijana (Z) 그 로브 및 Aitziber L. Cortajarena) (스프링 2016 (제출)).} 그러나, 단백질 흡착 단백질과 표면의 복잡한 상호 작용 메커니즘은 완전히 이해되지 않는다. 특히, 형태, 패턴 방향 및 코팅 밀도에 대한 정보는 아직 행방 불명입니다.

분산 모니터링 (QCM-D) 기술로 수정 진동자 마이크로 밸런스는 단백질 흡착, 코팅 동력학 연구를위한 도구와 상호 작용 친로서 최근 주목 받고있다나노 미터 크기 ^19,43-45에 세 스. 이 기술은 실시간 질량 흡착 상세한 검출을 허용하고, 단백질에 격자 ^{19,20,42,46-48} 단백질 자기 조립 공정 및 기능성 분자의 결합을위한 지표로 사용될 수있다. 또한, QCM-D 측정은 천연 생물학적 조건 하에서 단백질 성 금속 층 상호 작용 과정을 연구 할 수있는 가능성을 연다. 최근의 한 연구에있어서, Eu와 같은 선택된 금속과 S 층 단백질의 상호 작용 (III), 금 (III), 팔라듐 (II), 및 Pt가 (II) QCM-D ^{(19, 20)과} 함께 연구되어왔다. 흡착 된 단백질 층은 그람 양성 박테리아의 세포벽의 단순화 된 모델이 될 수있다. 이 단일 성분의 연구는 금속의 상호 작용에 대한 깊은 이해에 기여할 수있다. 그러나 전적으로 QCM-D 실험은 표면 구조와 단백질에 금속의 영향에 관한 진술을 허용하지 않습니다. 다른 기술들이 이러한 정보를 얻기 위해 필요하다. 하나의 POS구조적 특성에 촬상을위한 바이오 나노 대한 접근성 및 취득 정보는 원자력 현미경 (AFM)이다.

제시된 연구의 목적은 L.의 특정 Slp1에서 ((0) -NPs을 금 (III) 및 금) S-층 단백질에 금의 흡착을 조사했다 스패 리 쿠스 JG-B53. ICP-MS를 사용하여 5.0 QCM-D를 사용하여 고정화 S-레이어 - 실험은 2.0의 pH 범위에서 배치 규모에 현탁 단백질로 이루어졌다. 또한, 격자의 안정성에 금속염 용액의 영향이 후속 AFM 연구하여 조사 하였다. 이러한 기술들의 조합은 특정 금속 친화 관한 전체 박테리아 세포에 대한 이벤트를 바인딩에 대해 더 학습하기위한 도구로서 시험관 금속 상호 작용 과정의 이해에 기여한다. 이 기술뿐만 아니라 환경 보호를위한 금속의 회수를위한 적용 가능한 필터 재료의 개발 및 재의 보존을위한 중요^(49)뿐만 아니라, 다양한 애플리케이션을위한 고도의 기술 순서 금속 NP에 어레이의 개발을위한 소스.

프로토콜

1. 미생물과 배양 조건

참고 :. 모든 실험은 무균 상태에서 시행 하였다 L. 스패 리 쿠스 JG-B53은 냉동 보존 된 문화 ^{(29, 30)로부터} 얻은 것입니다.

1. 전송 300 ml의 멸균 영양 국물 (NB) 미디어 (3 G / L 고기 추출물, 5g / L 펩톤, 10g / L의 NaCl)에 클린 벤치에서 문화 (1.5 ml)에 냉동 보존. 이후 재배 예비 배양을 얻었다 30 ℃에서 최소한 6 시간 동안 용액을 교반 하였다.
2. 70 L에서, pH는 7.0에서 30 ° C를주의 미디어에서 호기성 조건에서 박테리아를 배양 증기 제자리 생물 반응기를 조정. 따라서 ≈ 57 L의 탈 이온수로 반응기를 채우기. 생물 반응기에서 직접 고체 NB 미디어를 추가하고 용해 (농도는 위 참조).
   1. 또한 재배하는 동안 거품 형성을 억제하는 미디어에 소포제 (30 μL / L의 NB-미디어)를 추가 한 후 오토 클레이브 미디어 (122 ° C, 온도 시간 30 분 유지)반응기 내부 설비.
3. 미디어를 냉각하고 완전한 산소 포화도를 수행합니다. (1 MH ₂ SO _4, 2 M NaOH를 사용) 7.0으로 pH를 조정하고 300 ml의 사전 문화의 자동 접종을 시작합니다. 접종 시점에서 배양 파라미터의 데이터 기록을 시작한다. 재배 내에서 예를 들어 온라인 매개 변수, 용존 산소 수준 _{(2 할),} 산 및 염기 또한, pH를-값의 로그를 취합니다.
   1. 비 침습적 탁도 측정에 의해 온라인으로 세균의 성장을 모니터링합니다.
4. 재배의 모든 시간 후 추가 샘플링을 수행하고 바이오 건조 중량 (BDW)과 오프라인 광학 밀도 (OD)로 추가 매개 변수를 결정합니다. 따라서, 멸균 조건 하에서 각각의 샘플링 지점에서 20 ml의 배양 배지를 수집합니다.
   1. 600 nm에서 흡착의 광도 측정하여 오프라인 외경을 결정합니다. 빈 값으로 멸균 여과 NB-매체를 사용합니다. 선미어 흡착> 0.4 희석에게 램버트 - 맥주 법률의 선형성 다음 세포 현탁액에 도달.
   2. 박테리아 현탁액을 5 ml에 BDW 원심 분리기 (1)의 결정을 위해 RT에서 5 분 동안 5,000 XG에 (셀 밀도에 따라). 오븐 최대 질량 안정성 가열에 105 ° C에서 얻어진 세포 펠렛을 건조 및 펠릿의 질량을 측정한다.
5. 박테리아 성장의 확인 및 교차 오염 제어와 같은 400, 1000 배 확대 (각각 위상차 콘덴서 2, 3)에 광학 상 대비 연구 현미경 현미경 이미지를 가져 가라.
6. 온라인 검출 지수 성장기에 도달 한 후 ₂ 온라인 탁도를 수행 15,000 XG, 4 ° C에서 관류 원심 매스 수확 및 표준 완충액 (50mM 트리스 회 매스 씻어 된 10 mM의 MgCl _2, 3 mM의 NaN의 _3, pH는 7.5).
   참고 : 얻어진 바이오 매스 펠릿 -18 & # 저장할 수 있습니다(176), 절연을위한 추가 사용까지 C.

2. S-층 단백질 분리 및 정제

주 : 앞서 ^{2,19,30,32,50,51} 바와 같이 구성된 방법에 따라 Slp1 중합체를 정제.

1. 표준 완충액에서 배양으로부터 얻어진 세정 해동 조 매스 균질화 (1 : 1 (W / V))로 4 ℃에서 냉각 빙욕 하에서 분산기 (레벨 3, 10 분)를 이용하여 편모를 제거한다.
2. 현탁액 (8000 XG, 20 분 동안 39 ° C)를 원심 분리하고 표준 완충액으로 두번 세척 얻어진 펠렛 (1 : 1 (W / V)). 세정, 원심 분리 (8,000 XG, 20 분, 4 ℃) 한 후, 기준 버퍼에 펠렛을 재현 탁 (1 : 1 (W / V)), 현탁액의 DNase II 및 된 RNase (0.4 단위 / g 바이오 매스)를 첨가하고, 붕해 고압 균질 1,000 바 세포. 그 후 27,500 XG, 1 시간 동안 4 ℃에서 현탁액을 원심 분리기.
   주 : 연구 MI와 컨트롤 세포 현탁액을croscope. 3 그대로 세포를 400 배 배율의 현미경의 시야에서 볼 수 있습니다 - 이하 2 때 파열이 완료됩니다.
3. 표준 완충액으로 두 번 씻어 펠렛 (1 : 1 (W / V))로 다시 원심 분리를 수행한다. 이후 표준 버퍼에 펠렛을 재현 탁 (2 : 1 (W / V))로, 1 % 트리톤 X-100을 혼합하고, 지질 침착을 가용화 연속 진탕 (100 RPM) 하에서 20 분 정도 배양한다.
4. 용액을 원심 분리기 (27,500 XG, 1 시간 동안 39 ° C) 및 표준 완충액으로 얻어진 펠릿 세 번 세척 (1 : 1 (W / V)).
5. 표준 완충액에서 6 시간 동안 추가로 원심 분리 (27,500 XG, 1 시간 동안 4 ℃) 후의 펠릿을 인큐베이션 (1 : 1 (W / V)) 펩티도 ^50의 결합을 가수 분해하기 위해, 0.2 g / L의 리소자임, 혼합. 또한 서스펜션의 DNase II와의 RNase (각 0.4 단위 / g의 바이오 매스)를 추가합니다.
6. 원심 분리 (45,500 XG, 4 ℃, 1 시간) 후 T의 낮은 볼륨으로 상부 흰색 단백질 상을 재현 탁그는 원심 상청 (<30 mL)에 함유 된 단백질 서브 유닛.
7. 6 M 구아니딘 히드로 클로라이드 (6 M GuHCl, 50mM 트리스, pH는 7.2)으로 1 : 1 혼합하여 백색 현탁액을 용해. 용액을 밝게된다.
8. 추가적인 고속 원심 분리 (45,500 XG, 1 시간 동안 39 ° C) 뒤에 GuHCl 처리 용액의 멸균 여과 (0.2 μm의)을 수행한다.
9. 투석막 튜브에 상청 (MWCO 50,000 달톤)를 전송하고 48 시간 동안 재결정 완충액 (15 mM 트리스, 10 mM의 _CaCl2를, pH는 8.0)에 대하여 투석을.
10. 45,500 XG, 1 시간 동안 4 ℃에서 원심 분리 튜브로 백색 재결정 단백질 중합체 용액을 전송. 초순수 (<30 ㎖)의 낮은 체적 펠렛을 재현 탁.
11. 그 후, 투석막 튜브에 서스펜션을 전송하고 버퍼의 컨텐츠를 제거하기 위해 24 시간 동안 초순수에 대한 투석을 수행합니다.
    주 : 버퍼 또는 초순수 D의 여러 가지 변화를uring 투석은 필수적이다.
12. 동결 건조기에서 동결 건조를 정제 Slp1.

실험에 Slp1 3. 특성 및 정량

참고 : 흡착 및 코팅 실험 Slp1 농도는 UV-VIS 분광 광도계로 정량 하였다.

1. 직접 광도계의 낮은 측정 받침대 위에 용해 Slp1 샘플의 피펫 2 μL. 단백질 특성, 280 nm의 파장에서 흡착 최대 단백질 농도를 결정합니다. Slp1 농도를 결정하기 위해 0.61의 흡광 계수를 사용한다. 참조 측정을위한 Slp1 무료 솔루션을 사용합니다.
2. 실험 (1g / L과 0.2 G / L에 대한 원하는 농도 (0.9 % 염화나트륨을 사용하여 배치 모드에서 흡착 실험, pH는 6.0 및 QCM-D 실험이 재결정 버퍼를 사용하기 위해, pH는 8.0) 버퍼와 단백질을 희석 각기).
3. 표준 bioanal 의해 Slp1 품질 및 분자량을 분석램리, UK ^(52)에 의해 기술 된 방법 ytical 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 전기 영동 (SDS-PAGE).
   1. 금 (0) -NP 배양 10 % 폴리 아크릴 아미드 분리 젤을 사용한 후, 실험 예에서 Slp1를 사용하기 전에 SDS-PAGE를 수행합니다.
   2. SDS-샘플 믹스 샘플 버퍼와 재배 또는 단백질 시료의 ≈10 μL에서 (1.97 g의 트리스, 블루 5 mg을 브로 모 페놀, 5.8 ml의 글리세린, 1g의 SDS, 2.5 ml의 β-머 캅토 에탄올, 50 ㎖에 초순수로 입력) 겔 주머니 95 ℃에서 4 분간 배양 후 1 (v / v)의 혼합물을 피펫 : 1의 비율.
   3. 샘플까지 60 V의 전압에서 실행 SDS-PAGE 30 분은 한 번 분리 겔을 통과하는 120 V로 수집 젤 변화 전압을 전달합니다.
   4. 겔 시스템으로부터 겔을 제거하는 고정 용액 (10 % 산성 산, 무수 에탄올 50 %)로 1 시간 초순수 및 장소 헹군다. 그 후, 초순수로 린스 젤.
   5. 얼룩 젤적응 불특정 콜로이드 쿠마 화려한 푸른 방법 ^{(53, 54)를} 사용하여. ^{(72, 73)를} 탈색 한 후, 제조 업체의 프로토콜에 따라 겔 문서 시스템에 의해 SDS-PAGE 이미지를 가져 가라.

배치 모드 및 금속 정량화 4. 흡착 실험

1. 일괄 수착 실험 HAuCl _4에서의 Au (III) 원액 ∙ 3 H ₂ O를 준비 금속염을 희석 및 1g / L의 1 mm의 초기 금속 농도와 최종 Slp1 농도 Slp1 / NaCl 용액과 섞어 . Slp1없이 추가 음성 대조군과 세 쌍둥이의 실험을 수행합니다. 흡착 실험을 5 ml의 총 부피를 사용합니다.
2. 24 시간 (저 농축 염산과 수산화 나트륨 용액으로 pH를 조정)에 대한 2.0-5.0 사이의 서로 다른 사전 조정 된 pH 값에 실온에서 지속적으로 서스펜션을 흔들어.
3. 흡착 후, 15,000 XG, 20 분 동안 4 ℃) separ하기에 원심 분리상층 액에서 Slp1을 먹었다.
4. 용해 단백질 단량체를 제거하는 20 분 동안 15,000 XG에서 4 ℃를 한외 여과 튜브에 뜨는 (MWCO 50,000 다) 원심 분리기이를 전송합니다.
5. ICP-MS ^{(19, 20)에} 의하여 얻어진 여과 액 중의 금속 농도를 결정하고 Slp1 건조 질량으로 흡착 된 금속 백 계산 결과를 사용한다. 원칙을 측정, 방법 및 사용 된 ICP-MS의 구성 요소의 기회 문학 ^55에 설명했다.
   1. 내부 표준 (1 ㎎ / ㎖)와 같은 매트릭스와 로듐으로 1 % HNO _3를 사용하여 ICP-MS 측정을위한 샘플 및 참조를 준비합니다.

5. AU-NP의 합성 및 입자 크기의 결정

주 : 구연산염은 금 (0)가 -NP Mühlpfordt, H. 등에 의해 전술 적응 방법에 따라 합성 하였다 안정화. (1982)의 직경을 갖는 구형 입자를 얻었다 10-15 나노 ^56,57

1. NP 형성에 안정화 된 25 mM의 HAuCl ₄ ∙ 3 H ₂ O 주식을 준비합니다.
2. 19.75 mL의 초순수에이 원액 250 ㎕의 희석 연속 진탕을 15 분 동안 61 ° C에서 배양 한이.
3. 제 스톡 용액 5 ㎖ (12 mM의 탄닌산, 7 mM 시트르산 나트륨 디 하이드레이트, ₃ 0.05 mM의 K ₂ CO)를 준비하고, 15 분 동안 61 ° C에서 별도로 2 ^{차 용액을} 배양.
4. 상수는 솔루션 하나에 2 ^{차 원액을} 교반 추가합니다. 61 ℃에서 적어도 10 분 동안 반응 혼합물을 교반한다. 그 후 용액을 냉각 및 QCM-D 실험 내에서 Slp1 격자에 순이익 코팅을 위해 사용합니다.
   주 : 얻어진 금 (0) -NP 전형적 (0) ⁵⁸ -NPs 형성된 Au로 검출에 사용은 520nm의 흡광도 최대 UV-VIS 분광 특성화 하였다. 용액을 4 ℃에서 저장 될 수있다.
5. 형성의 크기를 분석또한 동적 광산란으로 알려진 광자 상관 분광법 (PCS)에 의한 AU (0) -NP.
   1. NP 크기의 결정을 위해, 층류 상자에 먼지가없는 상태에서 큐벳으로 합성 금 (0) -NP 용액 1.5 mL로 전송하고 크기 및 제타 전위 입자 크기 측정기로 분석한다. PCS 및 샘플 제조의 상세한 설명은 Schurtenberger, P. 등으로 주어진다. (1993) ^59, 자이나교, R. 등. (2015) ^60.

6. QCM-D 실험 - Slp1 격자 상 표면에 Slp1 코팅 및 AU-NP 흡착

주 : 측정은 최대 네 개의 흐름 모듈 장착 QCM-D와 함께 수행 하였다. 모든 QCM-D 실험은 25 ℃에서 125 μL / 분의 일정한 유속으로 수행 하였다. Slp1 코팅 및 금속 / NP 배양은 ≈ 5 MHz의 기본 주파수와 _SiO2를 압전 AT 컷 석영 센서 (Ø 14mm)에서 수행 하였다. 단계를 세척 및 추가솔루션의 ition는 대표적인 결과 부분의 그림에 표시됩니다. QCM-D 실험 단계 방법에 의해 단계는 Slp1의 재결정에 의해 나중에 금속 및 금속 순이익의 상호 작용에 따라 사용되는 센서의 세정 및 표면 개질로 시작이라고 할 수있다.

1. 절차 청소 :
   1. 센서 인형과 유체 세포를 착용. 펌프 적어도 20 ㎖를 통해 QCM-D와 튜브 시스템 (초순수 (v / v)의 2 %의 세제) 알칼리성 액체 세정제의 (모듈 당 각). 이후 시스템을 통해 초순수의 다섯 겹 볼륨을 (각 모듈 당) 펌프 (300 μL / 분 속도를 흐름). 제조 업체의 프로토콜에 따라 청소를 수행합니다.
   2. 2 % SDS 용액에서 배양 (20 분 이상)로 유동 모듈 _외부의 SiO2 센서를 청소하고 초순수로 ^{61, 62} 이후 여러 번 씻어 센서.
   3. 필터링 빌려와 결정을 건조공기를 ressed 20 분 ^{63, 64에} 대한 오존 세척 실에 배치합니다.
   4. 모든 유기 내용을 제거 두 번 청소 절차를 반복합니다.
   5. 센서 표면에서 결합 된 금속을 제거하려면 1 M HNO ₃ 센서를 씻어. 그 후, 초순수 모든 헹굼 단계를 수행합니다.
2. 고분자 전해질에 의해 센서 표면 개질 :
   표면 개질 중 내부 수행 할 수 있습니다 (절차를 통과) 또는 흐름 모듈 외부 (LBL 기술) 참고. 이들 실험에서 표면을 수정하기 위해 다음 방법을 사용 하였다.
   1. 3g하여 문서의 특별한 사용 시스템에 대해 이전에 설명 LBL 기술 ^{40, 41를} 사용하여 딥 코팅을 통해 폴리에틸렌 이민 (PEI, MW 25,000)와 폴리스티렌 설 폰산 (PSS, MW 70,000)의 교류 PE 층 / L로 센서를 수정 SUHR, M. 등. (2014) ^19.
   2. 깊은 W에서 해당 PE-솔루션 내부에 센서를 배치ELL 접시와 실온에서 10 분 동안이 품어.
   3. PE-용액으로부터 센서를 가지고 초순수로 집중적마다 딥 코팅 공정 사이에 센서를 헹군다.
      주 : 새로운 표면 개질은 양전하 PEI 갖는 적어도 세 개의 PE 층 종단 이루어져있다.
   4. 이 수정 후 외부 유동 모듈 내부 센서를 배치하고 실험을 시작하기 전에 초순수 린스 센서 평형.
3. Slp1 단일 플라이 재결정 :
   1. 단량체로 폴리머를 변환 4 M 요소에 Slp1을 녹인다.
   2. monomerized 단백질 15,000 XG, 1 시간 동안 4 ℃에서 원심 분리기는 더 큰 단백질 덩어리를 제거합니다.
   3. 0.2 g / L의 최종 단백질 농도로 재결정 완충액으로 용해 및 원심 Slp1 상등액을 혼합한다.
      주 : Slp1 (자기 조립)의 재결정을 따라 칼슘의 첨가에 의해 촬영 시작rystallization 버퍼입니다. 따라서, 즉시 (플로우 모듈 내부에 배치) 센서 125 μL / 분의 유속으로 혼합 용액 펌프. 재결정은 QCM-D 실험 내에서 검출 된 주파수와 소비 변화의 안정된 값 후에 완료됩니다.
   4. 플로우 모듈 내부 PE 변성 센서 위에 성공적 단백질 재결정 후의 주파수 및 분산 시프트 안정 값까지 125 μL / 분의 유속으로 waterintensively 재결정 버퍼 또는 초순수와 피복 센서 린스 것이 발견되었다.
      참고 : Slp1 단층과 AFM 연구 상 이상 흡착 실험 PE와 _SiO2를 표면 개질는 그림 1에서 보여집니다.

그림 1. 도식 디자인 PE의 표면 개질과 Slp1 단층코팅; 이 수치는 SUHR, M. 등에서 수정되었습니다. 스프링의 허가 (2015) ^19. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 금속 및 금속 순이익 상호 작용 :
   주 : 금 금속 염 용액이 수착 (HAuCl ₄ ∙ 3 H ₂ O)을 1 mm 이하 0.9 %의 NaCl 용액에서 pH에서 5 mM의 농도 = 6.0에서 수행 하였다. AU-NP 흡착은 pH가 ≈ 5.0에서 1.6 mM의 트라이 - 나트륨 구연산 버퍼에 희석 AU-NP에 함께 이루어졌다.
   1. 주파수 및 분산 안정 시프트 값이 검출 될 때까지 유동 모듈 성공적인 Slp1 코팅 한 후, 0.9 % NaCl 용액으로 집중적 수득 Slp1 층을 헹군다.
   2. 125 μL / 분의 유속으로 유동 모듈 제조 된 금속 용액 (1 mM)을하고 NP 용액을 펌프 및 질량 SL에 흡착 추적P1 층. 질량 흡착 사우어 브레이 방정식 참조 주파수 천이 (수학 식 1)을 추적하여 직접 검출 할 수있다.
   3. 금속 및 금속 순이익 상호 작용을 완료 한 후, 약한 결합 또는 약한 부착 된 금속 또는 나노 입자를 제거하기 위해 금속 / NP 무료 버퍼 레이어를 씻어.
      참고 : 실험 장치의 그림이 그림 2에 표시됩니다.

그림 2. * ⁶⁶ (401) 흐름 모듈 QFM를 사용하여 QCM-D 설정의 도식 디자인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 데이터 기록 및 평가 :
   1. 헤르츠 (Hz, Δf에 _없음)과 소비 (ΔD _N에서 주파수 변화를 기록한다) QCM-D는 특정 소프트웨어를 사용하여 QCM-D 실험 내에서.
   2. 배음 n ^번째에 적용되는 센서 표면에 마찰없이 결합 얇고 단단한 필름 유효 흡착 질량 감도 (ΔM) 사우어 브레이 식 / 모델 (식 1) ^{(65) (66)의} 평가를 위해 사용합니다. 컷 수정 센서에서 사용되는 5 MHz의에 대한 용어 C (사우어 브레이 상수) 17.7 NG ∙ Hz에서 ^-1 ∙ CM ^{-2 (68)이다.} 강성 들어, 균일하게 분포하고, 충분히 얇은 흡착 층은 좋은 근사 식 1로 사용한다.
      
   3. 점탄성 분자 제조업체 특정 소프트웨어와 ^68-71 유효 켈빈 - 보이트 모델에 따라 추가 모델링을 수행하고 사우어 브레이 모델의 그것과 결과를 비교.
   4. 층 두께의 계산 및 물질의 흡착에 사용할중요한 모델링 파라미터로서 1.35의 흡착 층의 층 밀도 g ∙ cm ^-3 S 층 단백질 ^72-75 대한 전술 된 값에 대응. 단백질과 금속 층 상호 작용의 계산에 동일한 값을 사용한다.

7. AFM 측정

1. 거꾸로 광학 현미경에 완벽하게 할 수있는 AFM과 함께 연구를 수행합니다.
   1. 직접 코팅 QCM-D 센서에 재결정 버퍼 또는 초순수를 사용하여 액체의 기록 AFM 이미지.
   2. QCM-D 실험 후 초순수로 센서를 씻어 AFM 유체 세포 내부에 배치합니다. 따라서, 약 1.5 ml의 총 부피로 유체 밀폐 셀을 사용한다. 30 ° C에서 유체 셀 상수의 온도를 유지한다.
   3. 물 ≈ 25 kHz의 공진 주파수와 <0.1 ​​N / m의 강성을 가진 캔틸레버를 사용한다. 2.5 및 10 μm의 / 초 사이의 스캔 속도를 조정합니다.
   76 댐핑 진동에 의해 표면에 캔틸레버의 거리를 결정한다.
   주 : Z-값의 정확한 표면 토포 그래피를 나타내는 이미지를 동시에 높이가 Z 스케일로 도시된다. 진폭, Z 값은 스캔 매개 변수에 따라 제한된 정보를 부담하기 때문에 진폭 (의사 3D) 이미지는 Z-규모없이 표시됩니다. 이미지 분석은 세 가지 다른 평가 소프트웨어의 ^77를 사용하여 수행 하였다.

결과

미생물과 Slp1 특성의 재배

박테리아의 성장의 기록 데이터는 약 5 시간의 지수 성장기의 끝을 나타낸다. 이전 조사는 Slp1 수확의이 점 (4.36 G / L 젖은 바이오 매스 (≈ 1.45 그램 / 리터 (BDW)) 최대 수율 ^(19)와 분리 될 수 있음을 보여 주었다. 그럼에도 불구하고, 정의 된 미디어 구성 요소 또는를 사용하여 재배의 최적화 FED- 일괄 재배 전략. 이것은 산업용 애플리케이션을위한 바이오 매스의 높은 양의 사용에 대한 양도 할 수없는 것입니다 높은 바이오 매스 수율로 이어질 것입니다. 온라인의 값과 오프라인 기록 재배 매개 변수도 3a에 요약되어있다. 현미경 제어 (그림 3B)를시 L...

토론

이 연구에서 상이한 분석 방법의 조합을 이용하여 조사 하였다 S 층의 Au 단백질의 결합을 연구 하였다. 특히, 금의 결합은 광산 물 또는 공정 용액에서 금의 회복뿐만 아니라, 물질, 예를 들면, 감각 표면의 건설을위한뿐만 아니라 매우 매력적이다. 금 상호 작용의 연구를 위해 (금 (III) 및 금 (0) -NPs)에 현탁하고 Slp1의 단층을 재결정 화하여, 단백질이 가지고 격리된다. 따라서 본 연구는 그람 양성 균주 L.의 성공적인 재배를 보여 주었다 스패 JG-B53과 표면층 Slp1 단백질의 분리. 그럼에도 불구하고, 재배 및 단백질 분리 도전을 유지하고 최적화해야합니다. 바이오 매스와 S-층 단백질의 대규모 생산은 금속 선택적 필터 재료의 제조에 모두 산업 응용 예를위한 전제 조건이다. 그들의 응용 가능성이있다 undoubtedl독성 금속의 제거 처리 또는 물에 용해 된 유가 금속의 회수, 폐수 또는 배출수 높은 Y. 또한, S-층에 대한 응용 가능성은 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
equiment 및 소프트웨어
Bioreactor, Steam In place 70L 파일럿 시스템	Applikon Biotechnology, 네덜란드	Z6X	dO2, Applikon Biotechnology 및 BioXpert 소프트웨어의 pH 센서 V2
비침습적 바이오매스 모니터 BugEye 2100	BugLab, Concord (CA), USA	Z9X	---
분광계 Ultrospec 1000	Amersham Pharmacia Biotech, 영국	80-2109-10	회사 현재 GE Healthcare Life Sciences
MiniStar 마이크로 원심분리기	VWR, 독일	521-2844	배양 시료의 원심분리용
Research system microscope BX-61	Olympus Germany LLC, Germany	037006	이미징 소프트웨어
Cell^P와 결합된 현미경(버전 3.1)	Olympus 소프트 이미징 솔루션 LLC, Mü nster, Germany	---	현미경과 함께
Powerfuge 파일럿 분리 시스템 Serie 9010-S	Carr Centritech, Florida, USA	9010PLT	바이오매스 수확용
T18 basic Ultra Turrax	IKA Labortechnik, Germany	431-2601	편모 제거 및 샘플 균질화용
Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, 미국	728411	단백질 분리에 사용됨
모바일 고전단 유체 프로세서, M-110EH-30 Pilot	Microfluidics, Massachusetts, USA	M110EH30K	세포 파열에 사용
Alpha 1-4 LSC 동결 건조기	Martin Christ 동결 건조기 LLC, Osterode, Germany	102041	---
UV-VIS 분광 광도계(NanoDrop 2000c)	Thermo Fisher Scientific, USA	91-ND-2000C-L	단백질 측정용 concentration
Mini-PROTEAN 수직 전기영동 챔버	Bio-Rad Laboratories GmbH, 뮌헨, 독일	165-3322	SDS-PAGE
VersaDoc 이미징 시스템용 3000	Bio-Rad Laboratories GmbH, 뮌헨, 독일	1708030	SDS-PAGE 젤
ICP-MS Elan 9000	PerkinElmer, Waltham (MA), USA	N8120536	금속 농도
측정용Zetasizer Nano ZS	Malvern Instruments, 우스터셔, 영국	ZEN3600	나노 입자 크기 측정용
Q-Sense E4 장치	Q-Sense AB, 스웨덴 예테보리	QS-E4	LOT를 통해 주문됨 양자 설계(E4 플랫폼에 포함된 소프트웨어)
Q-Soft 401(데이터 기록)	Q-Sense AB, 스웨덴
Q-Tools 3(데이터 평가 및 모델링)	Q-Sense AB, 스웨덴
QCM-D 유량 모듈 QFM  401	Q-Sense AB, 스웨덴 예테보리	QS-QFM401	LOT 양자 디자인
QSX를 통해 주문  303 SiO2 압전 AT-cut 석영 센서	Q-Sense AB, 예테보리, 스웨덴	QS-QSX303	LOT를 통해 주문 양자 설계
오존 세척 챔버	Bioforce Nanoscience, Ames (IA), 미국	QS-ESA006	LOT를 통해 주문 양자
설계 원자력 현미경 MFP-3D Bio AFM	망명 연구, 산타 바바라 (캘리포니아), 미국	MFP-3DBio	AFM 측정 및 이미징 소프트웨어
Asylum Research AFM Software AR Version 120804+1223	Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA		Cat에 포함된 이미징 소프트웨어. 아니요. MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 소프트웨어	WaveMetrics, Inc., USA		이미징 소프트웨어는 Cat에 포함되어 있습니다. 아니요. MFP-3DBio
BioHeater	Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA	Bioheater	AFM 측정을 위한 샘플 히터
Biolever 미니 캔틸레버,  BL-AC40TS-C2	올림푸스 독일 LLC, 독일	BL-AC40TS-C2	AFM 측정에 선호되는 캔틸레버
WSxM 5.0 개발 6.5 (2013)	Nanotec Electronica S.L. , 스페인	AFM 분석용	프리웨어
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
>Detergents and other equiment
산성산, 100%, p.A.	칼 로스 GmbH+CO. KG	3738.5	위험, 인화성 및 부식성 액체 및 증기 피부에 심한 화상을 입히거나 눈에 손상을 일으킵니다.
소포제 204	시그마-알드리치 주식회사 LLC.	A6426	거품 억제
용 브로 모페놀 블루, 나트륨 염	Sigma-Aldrich Co. LLC.	B5525	---
쿠마시 브릴리언트 블루 R (C45H44N3NaO7S2)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	3862.1	---
돼지 비장에서 추출한 데옥시리보뉴클레아제 II	Sigma-Aldrich Co., LLC.	D4138	일반 IV , 2,000 - 6,000  Kunitz units/mg 단백질
에탄올, 95%	VWR, 독일	20827.467	위험, 가연성
글리세린, p.A.	칼 로스 GmbH+CO. KG	3783.1	---
구아니딘 염산염 (GuHCl)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	0037.1	---
Hellmanex III	Hellma GmbH & Co. KG	9-307-011-4-507	---
염산 (HCl) (37%)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	4625.2	위험; 부식성, pH 조정에 사용되는
닭 달걀 흰자	Sigma-Aldrich Co., LLC의 Lysozyme.	L6876	동결건조 분말, 단백질 = 90 %, = 40,000 units/mg 단백질 (시그마)
가열 기능이 있는 자석 교반기,  MR 3000K	Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Germany	504.10100.00	실험 내 표준 교반기
NB-Media DM180	Mast Diagnostica GmbH	121800	---
질산(HNO3)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	HN50.1	위험; 산화, 부식
PageRuler 염색되지 않은 단백질 사다리	ThermoScientific-Pierce	26614	---
Poly(sodium 4-styrenesulfonat) (PSS)	Sigma-Aldrich Co., LLC.	243051	평균 Mw ~ 70,000
폴리 에틸 렌 이민 (PEI),	Sigma-Aldrich Co. LLC	408727	경고; 유해하고, 자극적이며, 환경에 위험합니다. 평균 Mw ~25,000
무수 탄산칼륨 (K2CO3)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	60108	경고;
소 췌장에서 유해한 리보뉴클레아제 A	시그마-알드리치 주식회사 LLC.	R5503	유형 I-AS, 50 - 100 Kunitz 단위/mg 단백질
아지드화 나트륨 (NaN3)	Merck KGaA	106688	위험; 매우 독성이 있고 환경에 위험
염화나트륨 (NaCl)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	3957.2	---
황산나트륨 (SDS)	Sigma-Aldrich Co., LLC.	L-5750	위험; 독성
수산화나트륨 (NaOH)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	6771.1	위험; 부식성, 재배 및 pH 조정 내에서 pH 조절에 사용
Spectra/Por 6, 투석 막, MWCO 50,000	칼 로스 GmbH+CO. KG	1893.1	---
황산 (H2SO4)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	HN52.2	위험; 부식성, 재배 내 pH 조절에 사용
탄닌산 (C76H52O46)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	16201	---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	9090.2	---
트리톤 X-100	CARL ROTH GmbH+CO. KG	3051.3	경고; 유해하고 환경에 위험함
VIVASPIN 500, 50,000 MWCO 한외여과 튜브	Sartorius AG	VS0132	---
β-메르캅토에탄올	Sigma-Aldrich Co. LLC.	M6250	위험, 유독성