망막 질환의 평가에 대한 정량적 안저 자기 형광

요약

망막 색소 상피(RPE)는 리포푸신으로 축적된 시각 주기 부산물을 재생하여 감각 망막을 지원합니다. 이러한 제품은 자가 형광성이며 in vivo에서 정성적으로 이미지화할 수 있습니다. 여기에서는 컨포칼 스캐닝 레이저 검안경을 사용하여 RPE 리포푸신을 정량적으로 이미지화하는 방법을 설명합니다.

초록

망막 색소 상피(retinal pigment epithelium, RPE)는 위에 있는 감각 망막과 나란히 배치되어 있으며 시각 시스템의 기능을 지원합니다. RPE가 수행하는 작업 중에는 식세포작용(phagocytosis)과 리소좀 유래 소기관을 통한 외부 광수용체 분절 처리가 있습니다. 저장되어 리포푸신 과립이라고 하는 이러한 분해 산물은 부분적으로 비스레티노이드로 구성되어 있으며, 이는 컨포칼 스캐닝 레이저 검안경(cSLO)을 통해 안저 자가형광으로 임상적으로 검출될 수 있는 광범위한 형광 흡수 및 방출 스펙트럼을 가지고 있습니다. 리포푸신 축적은 노화 증가와 관련이 있지만 망막의 후천성 및 유전성 퇴행성 질환 모두에서 다양한 패턴으로 발견됩니다. 따라서 망막의 축적 패턴을 연구하고 이러한 패턴을 위에 있는 감각 망막의 변화와 연관시키는 것은 망막 질환의 병태생리와 진행을 이해하는 데 필수적입니다. 여기에서는 건강한 눈과 병든 눈 모두에서 RPE 리포푸신 수치를 정량화하기 위해 cSLO를 사용하는 우리 연구실과 다른 연구실에서 사용하는 기술에 대해 설명합니다.

서론

망막 색소 상피 (RPE)는 다수의 공정 ¹ 내지 감각 망막의 기능을 지원한다. 연령 관련 황반 변성 (AMD)은 선진국에서의 치료가 실명의 가장 중요한 원인이며, 안료의 손실 함수 위축의 손실을 포함 RPE의 변화에​​ 의해 특징된다. AMD와 정상적인 노화에있어서, RPE는 리포 푸신 입자라고 포식 감광체 단편을 함유 형광 리소좀 유래 세포 소기관을 축적한다. RPE에 리포 푸신의 축적은 산화 적 ^장애를 표시 ^한 것으로 생각 하였지만, 최근의 연구는 RPE 형태 높은 리포 푸신 농도 ² 세 눈 정상적인 유지 보여준다. AMD 및 AMD의 진행을위한 그러나, 리포 푸신 분포의 비정상적인 패턴, 리포 푸신의 특정 손실, 문서화 마커, 조직 학적 및 임상 ^3,4 모두

결함이 사전 처리RPE의 리포 푸신의 노래는 특정 상속 망막 변성에서 발생하는 것으로 나타났다. 스타 르가 르트 병 (STGD)을 앓고있는 환자는 결국 AMD ^5에서 보이는 것과 유사한 시력 상실을 개발하고, 젊은 나이에 RPE에 리포 푸신 축적. 이러한 연구 결과는 리포 푸신 축적 자체가 독성 및 RPE 장애 ^{6, 7을} 구동 할 수 있다고 제안했다. 그러나 시간이 지남에 STGD와 주제의 자세한 영상 연구는 그 초점 리포 푸신 축적 ⁸ 후속 RPE 손실에지도 확인하지 않았다. 리포 푸신 이상이 망막 변성에 대한 마커가 있지만 따라서, 리포 푸신의 직접적인 독성에 대한 역할은 검증되지 않은 남아있다.

RPE는 망막의 가장 후방 전지 층이지만, 안저에서의 형광 신호의 대부분을 생성한다. RPE 유래의 생성 및 형광도 (AF)의 검출이 가능 VI 공 초점 스캐닝 레이저 검안경 (cSLO)를 사용하여 수행 될 수있다안저 AF의 공간 분포의 sualization. 특정 망막 변성은 이러한 조건의 진단 및 모니터링 독특한 안저 AF의 패턴 및 AF 이미징 보조를 보여줍니다. 표준 AF 촬영이 임상 적으로 중요하지만, 양적 AF (QAF)는 RPE의 건강을 평가하는 중요한 수단이되고있다. 우리 등을 확실하게 특정 망막 위치 ^9에서 QAF 레벨을 결정할 수있는 표준화 방법을 개발 하였다. QAF 잠재적 인 진단에 응용 프로그램 및 망막 조건의 모니터링을 가지고 있으며, 또한 예후 및 위험 계층화의 유틸리티를 가질 수있다. 또한 QAF의 진단 능력은 특정 망막 질환 ^10-12에 대해 기술하고있다. 여기, 우리는 건강하고 병에 걸린 눈의 평가에서의 응용 프로그램의 시각적 데모와 함께 우리의 기술을 수행하기위한 단계별 세부 정보를 제공합니다.

프로토콜

윤리 정책 :이 연구에 등록 된 모든 환자가 의학의 뉴욕 대학에서 승인 된 기관 검토위원회의 감독에 따라 그렇게했다.

1. 환자 선택 및 이미지를위한 초기 준비

참고 : 다음과 같은 자료가 필요 : 0.5 % tropicamide 안과 솔루션, 2.5 %의 페닐에 안과 솔루션, cSLO는 스펙트럼 영역 빛 간섭 단층 촬영 (SD-OCT) 및 내부 형광 참조 갖추고 있습니다.

1. 촬영에 앞서, 적절 제조업체의 지침에 따라 데이터 수집에 대한 cSLO을 설정합니다.
2. cSLO의 내부 형광 참조를 탑재합니다. 참고 : 제조 업체에서 구입 한 바와 같이 내부 형광 참조, 금속 링에 보관하고, 카메라 렌즈 바로 뒤에 배치됩니다. 다른 제조사 cSLO 사용하는 경우에서 설명되는 것과 다른 구성이있을 수있다이 프로토콜.
   1. 상기 cSLO에 참조를 삽입 제거하는 렌즈를 트위스트하기 위해 기계의 금속 링의 나사 및 참조를 포함하는 새로운 금속 링으로 대체.
      참고 : 레이저 파워 검출기 감도 / 이득의 변동에 대한 보정을 허용하는 내부 형광 참조하면, QAF 기술에 중요하다.
3. 이미징 모집 환자가 일상적인 동공 확대 검사를 받아야하고 과거 안구 역사와 안구 결과로 나타낼 수있다 기저 질환에 대한 배경 정보를 얻을 수 있습니다.
4. 0.5 % tropicamide와 2.5 %의 페닐와 학생들을 팽창. 중요한 단계 : 최소 6 mm로 학생들을 팽창. 참고 :이 빛의 중단 통과를 위해 필수, 따라서 안저의 최적의 시각화 및 측정을위한 것입니다.
5. 촬영에 앞서, 턱 턱받침에 쉬고, cSLO에서 제대로 환자를 놓고 이마는 forehea에 배치D 휴식 및 측면 canthi 제대로 지표로 정렬됩니다.

안구 안저 2. 기준 이미징

1. 첫째, 이미지 거친 초점을 황반 위에 카메라를 중앙 집중화하고 얻기 위해 근적외선 반사율 (IR) 등 (820 nm의 파장)와 안저.
   1. 환자가 올​​바른 위치로, IR 촬상 모드 조작부 하드웨어 설정을 전환 위치 안저 카메라의 전체 초점이, 화상을 수동까지
   2. 기저 질환의 황반을 평가하는 IR 영상과 함께 스펙트럼 영역 빛 간섭 단층 촬영 (SD-OCT를) 사용하는 제어 패널에 "IR 간섭 단층"의 설정을 조정합니다.
   3. 영상 창에 존재하는 가이드가 안저의 IR 이미지에 OCT를 방향을 올바르게 사용합니다. 최적 SD 간섭 단층 품질을 달성 OCT의 화상이 촬상 화면의 상단 1/3이되도록 카메라를 배치. 적어도 하나의 수평 라인 SC 획득중심와 통한 전체 이미지 필드에 걸친.

3. QAF 이미징 설정

1. "고속"이미지 수집을 사용합니다. 참고 :이 설정으로 인해 환자의 운동과 홍채 또는 눈꺼풀에 의한 빛의 결과 차단에 신호 손실의 위험을 감소 빠른 이미지 수집, 수 있습니다.
2. 프레임 "9의 의미"를 사용합니다. 참고 :이 설정은 이후에 할 수있다 (9) 이미지 프레임의 고속 연속 촬영이 가능 (아래 참조) 소음과 유물을 줄이기 위해 "평균".
3. "30 X 30도"필드를 사용합니다. 참고 :이 이미지 수집 중에 캡처 된 망막 영역의 정도를 의미한다.
4. 이것은 처음에 경고 할 수 촬상에 앞서, 청색광에 대해 환자에게 경고.
5. AF 모드를 켜고 화면이 최대한입니다 안저 AF (측면과 이미지의 모서리의 최소 어둡게)으로 "충전"하도록 카메라 축을 맞 춥니 다.
   1. 환자 h를하는 경우밝은 푸른 빛을 견뎌 AVE 어려움은 더 멀리 눈에서 카메라로 촬영을 시작하고 안저 전체보기가 될 때까지 환자를 향해 천천히 카메라를 가져.
      중요한 단계 : 빛이 가려져 있습니다에 들어가거나 눈에서 종료하는 경우, 신호가 발생합니다 감소했다. 지역화 감소 상측 또는 모서리 등의 비대칭 어둡게 보이는 것이다. 안구 운동은 혼자 빛 통행을 방해 할 때 신호의 일반화 된 손실을 볼 수있다.
6. AF 신호 분야에 걸쳐 최고 수준이되도록 카메라를 맞 춥니 다. 그러나 그들은 거의 상관 관계, 최대 신호보다는 선명한 이미지를 목표로하고 있습니다. 수동으로 또는 검안경 조이스틱으로 카메라의 위치를​​ 변경하는 cSLO를 이동하여 카메라의 초점을 조정합니다.
7. 안저 AF 쉽게 볼 수 있도록 감도 / 게인을 조정하지만, 과잉 포화 마십시오. 화상 취득 동안에, 내부 기준 중 하나에 보이는 컬러 픽셀 (상단에 위치한이미지) 또는 안저 신호의 포화 오버 따라서 손실을 나타냅니다.

4. 이미지 인식

참고 : 중요한 단계를 : 이미지 수집의 목표는 세션 내에서 이미지 사이의 변화에​​ 대한 제어 세션 당 2 고품질 9 프레임 이미지 스택을 얻을 수 있어야한다. 환자와 카메라 위치를 변경 한 후 변화에 대한 두 번째 평가하기 위해 두 이미지의 세션 제어를 얻을 수 있습니다. 모든 이미지는 궁극적으로 내부 기준 (아래에서 설명)로 조정됩니다.

1. 단 관능 망막 ⁹ 로돕신에 의해 광의 흡수를 최소화하기 위해 "표백"(AF 광에 망막의 전체 노출)의 적어도 20 초 후에 화상을 취득.
   1. 카메라 정렬, 초점과 감도를 최적화하기 위해이 기간을 사용합니다.
2. 신선한 눈물 막이 신호 품질을 향상 각 이미지 수집하기 전에 깜박 주제를 가지고있다.
3. 인수의 평면에서 눈꺼풀을 피하십시오.
   참고 : 더 어려운 환자를위한 수동으로 개방 눈꺼풀에 도움이 될 수 있습니다. 저자는 조수가이 작업을 수행하는 것이 좋습니다.
4. 그 빛이 감소 신호의 결과로 홍채에 의해 방해되지 않도록하기 위해 각 이미지 수집하기 전에 정렬을 최적화합니다.
   참고 : 적어도 약간의 움직임이 매우 일반적입니다, 저자는 각각의 이미지 수집하기 전에 필요한 미세 구조 조정을 권장합니다. 안내 및 이미징이 감소 운동을하는 데 도움이 동안 환자를 격려. 운전자주의 산만을 최소화하기 위해 저자는 또한 "취득 버튼"으로 기계의 발 페달을 사용하는 것이 좋습니다.
5. 신호 대 잡음비를 증가시키기 위해 9 프레임 스택의 "평균"을 계산함으로써 사후 화상 처리를 수행한다. 평균을 산출하기위한 옵션을 선택하여 cSLO 소프트웨어를 이용하여 스택의 평균을 계산한다.
   참고 : 일부 프레임이 최적의 품질을하지 스택이있을 수 있습니다 (즉, 국소 또는 전신시 감소했다최적의 프레임 gnal 상대), 따라서주의 깊게 각 스택을 검사하고 평균의 계산 전에 최적 프레임의 선택을 취소합니다.
   주 : 허용 가능한 신호대 잡음비와 평균 이미지는 3 개 이상의 프레임들에서 처리 될 수있다. 측면과 각 이미지의 모서리가 cSLO 자체 내에서 제한으로 인해 중앙 20도보다 낮은 신호를하는 것이 정상입니다.
   1. 소프트웨어는 운영자가 회색 수준을 정상화할지 여부를 묻는 메시지가 표시되면 "아니오"를 선택 0과 255 사이 (즉, 히스토그램 스트레칭). 이 분석을 위해 변경되지 않은 그레이 레벨을 유지합니다.

5. 이미지 분석

1. 이전 QAF 기술에서 개발 된 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 설명한 바와 같이 AF 이미지 분석 (IGOR을 ^9). 이 소프트웨어 프로그램을 사용하여 표준 이미지 분석에 대한 간단한 설명이 아래에 포함된다.
   1. 에서 내 보낸 IGOR에 QAF 프로그램과 (.BMP 형식으로) 가져 오기 이미지를로드픽셀 종횡비 768 X 768 (기본 출력 매개 변수)와 cSLO 소프트웨어.
   2. 드롭 다운 메뉴에서 이미지를 선택하고 분석을 시작합니다.
   3. "십자선"는 중심와하고 "브래킷"광학 디스크 (이 지표는 ROI를 확장하고 배치하는 데 사용됩니다) 접촉을 위에 놓일 수 있도록 이미지 보정 표시 위치를 조정합니다. 올바른 위치하는 경우, 사용 소프트웨어는 중심와 주변 원주 로아 (참조 그림 1, 2)로 이미지를 채울하라는 메시지가 표시됩니다.
   4. 내부 형광 기준에 존재하는 수준으로 각 이미지의 전체적인 계조를 보정하는 IGOR에서 옵션을 선택합니다. 주의 :이 단계는 각 화상의 전자 제로 레벨과 각 기기의 내부 기준 보정 계수뿐만 아니라, 나이, 굴절 각막 곡률 포함한 환자 - 관련 인자를 포함하여 시스템 - 관련 인자의 교정을 허용한다.
      주 : 분석 소프트웨어 후 고정 R 표시생성 된 이미지와 QAF 값에 egions 각 지역 내에서 설명된다. QAF 값은 자동으로 별도의 창에서 스프레드 시트 형식으로 입력됩니다. "
   5. 명령 프롬프트 내의 옵션을 선택하여 QAF "열 맵"을 생성한다. 모든 이미지 및 데이터는 적절한 옵션을 선택하여 엑셀 스프레드 시트에 IGOR 소프트웨어에서 내보낼 수 있습니다.

결과

이 기술은 모두 ¹³ 건강 상태 및 질병 ^10-12 QAF을 연구하기 위해 사용되었다. 건강한 눈 (그림 1)에서 RPE에서 방출 AF는 안저 (그림 1A)에 걸쳐 비교적 균일하게 분포되어있다. 감소 강도로 인해 황반 색소에 의해 빛의 차단에 중심 황반 지역에서 볼, 그리고 측면과 이미지의 모서리 인해 눈과 카메라의 광학에있다. 선박은 어두워 잘 획득 된 영상에서 선명한 초점이되어야한다.도 1b는도 1a에서 QAF 수준의 해당 열 맵 표현을 보여줍니다. 따뜻한 색상이 더 높은 강도의 영역에 해당하는 동안 쿨러 색상은 낮은 강도의 영역에 해당합니다. 최대 강도는 일반적으로 (도 1b에 나타낸) 제 8 획 동심 링에서 볼 수있다. 이 지역은 또한 영상 관...

토론

이상 RPE에 리포 푸신 분포가 증가 또는 감소 여부, 망막 질환의 민감한 마커이고, 일반적으로 관능 망막 기능의 상실과 관련된다. 여기, 우리는 망막 색소 상피 리포 푸신의 평가를 위해 QAF의 응용 프로그램을 설명합니다. 내부 형광 기준의 설립은 우리의 표준화 된 이미징 기술과 함께 가변 레이저 파워 검출기 감도 ⁹ 수정하기는 AF 수준의 신뢰성있는 정량 수 있습니다. 그것은이 방법은 약물이나 유전자 치료 등의 치료 개입의 효능을 평가 결국 진단 및 망막 질환의 모니터링에 도움, 것 우리의 목표입니다. QAF도 위험에 처한 이러한 AMD와 같은 조건에 대한 개인의 층화에 도움이된다.

우리는 망막 병리 ^(13)의 해석을위한 참조 도구로서 사용될 QAF 데이터의 큰 정상치를 생성했으며, 또한 몇몇 질병 STA에 QAF 설명 하였다스타 르가 르트 병 ^(10), 황소의 눈의 황반 병증 ⁽¹²⁾ 베스트 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Spectralis HRA + OCT	하이델베르크 엔지니어링
0.5% 트로피카미드 점안액			모든 브랜드 사용 가능
2.5% 페닐에프린 점안액			모든 브랜드 사용 가능
내부 형광등 참조	Heidelberg Engineering
IGOR Pro 소프트웨어	WaveMetrics