방법 논문

세 가지 차원 생체 모방 기술 ​​: 소설 Biorubber는 콜라겐 하이드로 겔에 마이크로 및 매크로 스케일 아키텍처를 정의 작성합니다

DOI:

10.3791/53578

⸱

2016년 2월 12일

 ,  , 
1Department of Surgery - Division of General Surgery, Medical University of South Carolina, 2Department of Chemical Engineering, University of South Carolina

이 논문에서

요약

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생체 내 조직의 구조적 특징, 구성 요소 및 기계적 특성과 유사한 3차원 구조를 엔지니어링하기 위해 혁신적인 생체 제조 기술이 개발되었습니다. 이 기술은 새로 개발된 희생 재료인 BSA 고무를 특징으로 하며, 이 고무는 세부적인 공간 특징을 전달하여 다양한 조직의 생체 내 구조를 재현합니다.

초록

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조직 지지체는 조직 재생 과정에서 중요한 역할을한다. 이상적인 발판는 데 적절한 구성, 대상 계수, 잘 정의 된 아키텍처 기능 같은 몇 가지 요구 사항을 충족해야합니다. 생체 조직의 고유 아키텍처를 요점을 되풀이 생체 적합 물질은 질병을 공부뿐만 아니라 손실과 잘못된 연부 조직의 재생을 촉진하기 위해 매우 중요합니다. 신규 biofabrication 기술이 연구 및 임상 적 적용을위한 생체 재료의 새로운 세대를 만들 아트 화상, 3 차원 (3D) 인쇄, 선택적 효소의 활성 상태를 결합하는 개발되었다. 개발 한 물질, 소 혈청 알부민 고무 특정 기하학적 특징을 지탱 몰드에 주입 반응이다. 이 희생 물질은 자연 골격 물질에 건축 기능의 적절한 전송을 할 수 있습니다. 프로토 타입은 4 3mm 채널에 repr로 3D 콜라겐 지지체로 구성분 지형 구조를 ESENT. 이 논문은 자연 구조의 생성이 biofabrication 기술의 사용을 강조한다. 이 프로토콜은 컴퓨터 지원 소프트웨어 (CAD) 골격 물질 내에서 구조적 특징을두고 고무의 효소 소화 하였다 BSA 고무 주입 반응 것이다 고형 금형 제조를 이용한다.

서론

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조직 공학 분야에서 조직 지지체를 제조하는 능력은 중요하다. 적합한 조직 골격이 3 차원 구조를 갖는 생체 적합성 재료로 구성되고, 생체 조직의 구조를 모방은 세포 및 조직의 성장 및 리모델링을 용이. 이 비계는 영양분의 수송 및 폐기물 1-4의 제거를 허용해야합니다. 이러한 지지체의 제조에서 주요 장애물 중 하나는 생체 적합성 물질로 특정 기하학적 특징 요점을 되풀이하는 능력이다. 몇몇 biofabrication 기술은 이러한 지지체의 기하학적 특징을 조절하는 것으로보고 된, 예로는 용매 캐스팅 9 조형 10 5-8 전기 방사되고, 그 중에서도 11 차원 인자. 이러한 기술은 제어 내부 및 외부 건축 기능을 상대적으로 쉽게 전송을 제공하는 짧은 가을, 비싼, 그들의 해상도와 인쇄 적성 (에 의해 제한되어 있습니다 예를 들면, 노즐 게이지, 소재 제한), 또는 실행 가능한 지지체 (12)를 생성하기 위해 장시간을 요구 후 제조 기술을 필요로한다.

많은 상용 제조 시스템에서, 내부 보이드, 채널 및 기능 생성 모래 또는 다른 적합한 이동식 또는 희생 물질을 사용하여 달성된다. 금속 또는 플라스틱 부분 사형 주위에 형성되고, 그것이 경화되면, 모래가 제거된다. 거의 같은 방법으로, 생체 물질의 차세대 biosand 당량이 필요하다. 따라서, BSA 고무 biosand위한 대용품으로 개발되었다. BSA 고무는 글루 타르 알데히드와 가교 결합 소 혈청 알부민으로 구성된 신규 제형 재료이다. 궁극적 인 목표는 생분해 성 콜라겐 지지체에 특정 건축 기능을 다시하는 것입니다. 원 조직의 금형 치수 충실도를 유지하는 희생 biorubber의 특성을 설명한다.

BSA 및 글루 타르 알데히드의 농도의 몇몇 조합은 다양한 용매를 사용하여 테스트 하였다. 이 자료는 BSA와 글루 타르 알데히드의 반응에 의해 만들어졌습니다. BSA 고무 조직 형의 복잡한 형상의 반응에 주입 될 수있다. 가교 BSA는 불안정하고 쉽게 중성 pH 및 온도 조건에서 효소에 의해 분해 트립신된다. 반대로, I 콜라겐 손상 유형은 트립신 소화에 매​​우 강하다. 이러한 기능은 선택적으로 뒤에 콜라겐을 떠나 BSA 고무를 제거하기 위해 대문자로했다. 본 연구는 생체 지지체 특정 구조적 특징을 제공 할 수있는 불안정한 주형을 얻기 위해 필요한 최적 파라미터를 결정하는 단계로 구성되었다. 평가 특정 기능 혼합 성, 효소 절단, 하중 및 네가티브 몰드에 주입 반응 할 수있는 능력을 포함했다. 30 % BSA 및 3 % 글루 타르 알데히드의 조합은 이러한 요구 사항을 충족. 이 프로토콜은 necess을 제공합니다진 가이드 라인은이 세 가지 차원의 발판을 만들 수 있습니다. 프로토 타입은 하나의 유입과 각각 4- 3-mm의 직경이 유출 채널 분지 구조를 나타내는 콜라겐 지지체로 구성되어 있습니다. 이 방법은 관심있는 조직을 다량 및 미세 환경을 모방 할 수있는 잠재력을 갖는다. 이 기술은 생체 조직 탄성 관심 조직의 다른 특성을 모방하기 위해 동조 될 수있는 높은 정확도를 가진 비교적 쉽고 적시 문제에 생분해 성 물질의 특정 기하학적 유익을 제공하기 위해 실행 가능한 기술을 제공한다.

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프로토콜

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1. 콜라겐 배치에서 고체의 비율을 결정

  1. 이전에 게시 된 절차 (13) 다음 콜라겐을 추출합니다. 콜라겐 20ml의 최소 해동. 형성된 하이드로 겔에서 콜라겐 농도를 조작하기 위해 배치 콜라겐 고체의 초기 비율을 결정한다.
    1. 알루미늄 호일 (약 6 × 6cm)의 세 가지 컷 25 ㎖ 비이커의 바닥을 사용하여 팬과 같은 각을 형성. 각 팬의 무게를 기록한다.
    2. 각 팬에 콜라겐을 소량 첨가하고 알루미늄 팬 콜라겐의 총 중량을 기록한다. 각 알루미늄 팬에 콜라겐의 0.8 g - 0.5를 추가합니다.
      주 :이 단계 후에,이 세 알루미늄 포일 팬은 각각 하나가 콜라겐의 소량을 가져야한다. 각 (총 3) 빈 알루미늄 팬의 무게와 콜라겐을 첨가 한 후 팬의 무게를 기록해야합니다.
    3. F를 사용하여 각 팬에서 콜라겐의 중량을 계산공식을 따르게 :
      콜라겐 무게 = 팬과 콜라겐 중량 - 팬 중량
    4. 24 시간 동안 100 ° C에서 오븐에 콜라겐을 보유하고있는 세 개의 알루미늄 팬을 놓습니다.
    5. 24 시간 후, 각각 알루미늄 팬의 중량 및 탈수 콜라겐을 기록한다.
    6. 다음 식을 이용하여 탈수 콜라겐의 중량을 계산한다 :
      탈수 콜라겐 무게 = 팬 탈수 콜라겐 중량 - 팬 중량
    7. 3 개의 시료는 아래 공식을 사용하여 콜라겐 고형분 농도를 결정하기 위해 고체의 비율을 계산한다 :
      figure-protocol-1
    8. 3 개의 시료 각각 콜라겐 고형분의 비율을 이용하여 배치의 평균 콜라겐 고체 함량을 계산한다.
      참고 : 사용되는 콜라겐 수화 콜라겐 남아있는 것입니다. 탈수 콜라겐 중 어느 것도 사용되지 않습니다.
    9. 콜라겐 고체 (난의 비율을 결정한 후일괄 nitial 콜라겐 농도)을 남아있는 수화 된 콜라겐을 계속. 3 콜라겐 배치의 pH를 조정하는 보정 pH 미터를 사용한다.
      1. 소량 (12) N 염산 (HCL)의 (한 번에 2-5 μL)를 추가합니다. 항상 얼음에 보관하십시오. 콜라겐에 직접 염산 없어 - 튜브의 측면에 의해 산을 추가한다. 산을 첨가 한 후, 콜라겐 산 밀어 주걱을 사용하여 신속하게 혼합 교반한다.
    10. 이 3의 pH에​​ 도달하면, 콜라겐은 4 ℃에서 O / N을 앉아 보자.

BSA 고무 2. 준비

  1. 아래의 절차에 따라 소 혈청 알부민 (BSA) 솔루션을 준비합니다.
    1. 배 인산염 완충 식염수 (PBS)를 준비한다. 0.02 M PBS 용액을 만들기 위해 물 100ml에 두 개의 PBS 정제를 추가합니다.
    2. 아래 절차를 이용하여 30 %의 BSA 용액을 만들기 위해 2 × PBS로 BSA를 결합.
      1. 예를 들어, 2 × PBS 30 ㎖로 30 % BSA을 BSA 12.9 g을 사용한다. 교반 막대와 플라스크에 2 배 PBS (예를 들어, 10 ㎖)의 1/3을 추가합니다. 플라스크에 BSA (예를 들어, 6.45 g의 BSA)의 1/2을 추가하고 주걱을 사용하여 건조 용질 젖은.
      2. 모든 용질 때까지 PBS 다음 BSA를 추가하는이 과정을 반복하고 용매 플라스크에있다. 모든 용질 젖은 주걱을 사용합니다. 그것은 몇 가지 액체 덩어리의 혼합물과 같이 표시됩니다. 이 약 30 분 동안 앉아 보자.
      3. 그런 다음, 낮은 사이클에 교반기를 켜고 교반 막대 주위에 덩어리가 없는지 확인합니다. 이 솔루션의 모든 것을 얻기 위해 90 분 소요 또는 4 ℃에서 O / N 감동을 둘 수 있습니다. 용질 모두 용해 된 후, 20 ml의 시린지에 넣고 용액을 0.20 μm의 주사기 필터로 덮인. 필터를 통해 액체를 추방하고 새로운 튜브에 멸균 솔루션을 수집하는 플런저를 누르십시오. 4 ℃에서 보관하십시오.
    3. 3 % 글루 타르 알데히드의 soluti 준비멸균 여과 배 PBS와 25 % 글루 타르 알데히드 용액을 희석하여합니다. 예를 들어, 3 % 글루 타르 알데하이드 용액 10㎖를 들면, 2 내지 25 %의 글루 타르 알데히드 ㎖의 2 × 8 ml의 PBS를 사용한다. 4 ℃에서 보관하십시오.

3. 금형 치료

참고 :이 문서에 설명 된 프로토 타입은 사용자 정의 만든 스테인리스 Y 금형 조각을 사용합니다. 금형 유입 각각 4, 3mm, 두 유출 채널이 포함되어 있습니다. 첫째, 깨끗한 금형, 불포화 라드로 스프레이, 그들을 소독. 아래에 설명 된 절차에 따라 금형을 준비한다.

  1. 35 kHz의 주파수에서 초음파기를 사용하여 면도 스테인리스 금형. 소니 케이의 금형을 놓고 물과 얼음을 잠수함. 초음파 처리기가 실행되는 동안 항상 감기 금형을 유지합니다. 90 분 2 시간 동안 초음파 처리를 실행합니다.
    1. 각 기간 후에, 루어에는 재료는 스테인레스 강 또는 b을 잠글 수 없습니다가 있는지 확인하기 위해 바늘을 사용의 RAS 연결합니다. 금형의 양측의 전체 표면을 청소 비누와 물을 사용합니다. 채널에 장애물이 없는지 확인합니다.
  2. 오토 클레이브 봉지 형, 나사, 루어 락 커넥터를 배치하고 오토 클레이브.
  3. 시중에서 판매하는 돼지 기름 (혼합 지방산 이형제)와 공기 분무기 반 방식에 부착 병을 채 웁니다. 일반 캡 병 뚜껑을 교체합니다. 오토 클레이브 가방에 배치하고 오토 클레이브.
    주 : 라드 나중에 주입 반응 될 재료 (BSA 고무)의 방출을 용이하게하기 위해 사용된다. 이 내부 씰을 손상시킬 수 있습니다 autoclave-에 분무기 병 뚜껑을 올려 놓지 마십시오.
  4. 45 초 동안이나 전자 레인지에서의 명확하고 액체 때까지 돼지 기름을 따뜻하게. 돼지 기름 병에 공기 분무기 뚜껑을 나사. 분무기와 뚜껑을 연결합니다. 실험실 벤치에서 공기 소스에 분무기를 연결합니다. 공기 밸브를 개방하고,이 표면을 습윤 시작할 때까지 분무기의 노즐을 열고종이 수건.
  5. 표면이 완전히 피복 될 때까지 금형 표면에 수직 라드 스프레이. 각 조각은 분무 된 후, 배양 접시에 배치하고 밀봉. 2 시간 동안 4 ° C에서 금형을 놓습니다.
  6. 30 분 동안 UV 광에 노출시킴으로써 표면을 주형 살균 진행. 그들이 반응 주입 할 준비가 될 때까지 4 ℃에서 그들을 다시 놓습니다.

BSA 고무 4. 반응 사출

참고 : 다음 단계에서 BSA 고무의 조기 설정을 방지하기 위해 사용할 준비가 될 때까지 모든 자료와 솔루션은 차가운 유지되어야한다.

  1. 다음 단계를 수행하여 금형에 BSA 고무를 전달하기위한 디스펜서를 준비합니다.
    1. 혼합 성분 모두 멸균 : 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 후드에서 30 분 동안 UV 광에 노출하여 (두 개의 O 링, 주사기 캡 이중 주사기 팁을 혼합하고, 4 일 디스펜서).
      참고 : PCR 후드가 t 있기 때문에 사용그 절차는 고정 제를 포함한다. 이러한 화학 물질로 인해 세포 독성에 대한 노출의 위험을 세포 / 조직 배양 후드에서 사용될 수 없다. 자외선이 포함되어 다른 후드가 적합 할 것이다.
    2. 솔루션 홀더에 끝 캡을 배치합니다.
    3. BSA의 1 비율 : 4로 혼합 및 주입을 수행 글루 타르 알데히드를. 솔루션의 가장 높은 금액을 제공 할 것입니다 이중 주사기 챔버에 30 % BSA를 추가 (그것은 채우기 위해 약 4 mL를 취하여 것입니다). 인접 실의 범람과 오염을 방지하기 위해 O 링을 배치하기에 충분한 공간을 남겨해야합니다.
    4. 다른 챔버에 3 % 글루 타르 알데히드 용액을 추가 (그것은 채우기 위해 약 1 mL를 취하여 것입니다). 인접 실의 범람과 오염을 방지하기 위해 O 링을 배치하기에 충분한 공간을 남겨해야합니다.
    5. 디스펜서에 이중 주사기를 놓습니다. 주사기 캡 상단에 위치하도록 수직으로 어셈블리를 기울입니다. 믹싱 팁 캡을 교체합니다.
    6. 사우스 캐롤라이나두 함께 스테인리스 금형 조각 REW.
    7. 오토 클레이브 가방의 내부 어셈블리를 놓습니다.
    8. 디스펜서의 모든 공기를 제거하려면 수직 위치에 고정 빠르게 핸들을 글루 타르 알데히드와 혼합 BSA의 작은 금액을 해제 한 시간을 짠다. 그런 다음 신속하게 주사기 팁에 스테인리스 Y 금형의 루어 락 커넥터를 연결합니다.
    9. 왼쪽과 오른쪽에 BSA-글루 타르 알데히드 혼합물을 디스펜서 스테인리스 Y 금형 잡아. 다른 내부 보이드 용액으로 채워 확인 압력솥 백 측면에 배기를 누름으로써 유출 채널의 좌우의 배기를 각각 덮는. 그리고, 가로 금형을 배치 한 후 다시 주입.
    10. 25mm 페트리 접시에 디스펜서와 장소에서 금형을 분리합니다.
    11. 고무의 탈수를 방지하기 위해 페트리 접시 주위에 파라 필름을 배치합니다.
    12. 4 ° C 냉장고 O / N의 금형을 놓습니다.

주 : 콜라겐 과정 항상 얼음에 보관해야한다.

  1. 콜라겐 고형분의 비율을 사용하여 콜라겐 농도를 수정한다.
    1. 찬물로 초기 콜라겐 농도를 조정하여 1.75 %의 콜라겐 10 ㎖를 확인합니다.
    2. 조정 pH 측정기를 사용하여, 12 N 염산을 사용하여 pH 3를 조정한다. 콜라겐에 직접 염산 않는다 튜브의 측면에 의해 산을 추가한다. 산을 첨가 한 후, 콜라겐에 의해 산을 밀어 주걱을 사용하여 신속하게 혼합 교반한다.
    3. 별도의 원뿔 튜브에 콜라겐 4g의 무게를.
    4. 4 ° C와 20 ~ 30 분 동안 9,343 XG에서 공기를 제거하기 위해 콜라겐을 원심 분리기.
    5. 30 분 동안 세포 배양 후드 살균 및 4 ml의 콜라겐 라미닌의 14 μL를 추가 UV. 이 10 μg의 / μL의 최종 라미닌 농도가 발생합니다. 참고 : 라미닌이들 제공tructural 무결성, 접착 및 다양한 세포 반응을 촉진한다.
    6. 이전 살균 후드를 사용하여 PCR UV는 20 ~ 30 분에 불을 켭니다.
    7. 2 시간 동안 에탄올, 20 ML의 주사기에 부착, 루어 잠금 캡을 놓습니다. 그리고, 건조 및 자외선에 배치 할 수 있습니다.
    8. 감마 1200 cGy의 도달하도록 8.6 분간 콜라겐을 조사.
      주 : 시간 ​​세슘 소스의 감쇠에 의존 할 것이다. 동일한 투여 량에 도달하는 시간을 조정한다.

BSA 고무에 콜라겐을 6.Casting

  1. 1 : 1의 비율 (콜라겐 : HEPES : MEM) 콜라겐을 중합하려면 8을 사용합니다. 다음 절차 (단계 5.1.8)에서 산성화 콜라겐의 초기 4g에 기초한다.
    1. 물에 0.2 N HEPES 용액을 만들고, 1-5 M 수산화 나트륨 (NaOH) 용액을 소량의 (1-5 μL)을 첨가하여 9 pH를 조정한다. 조정 pH 측정기를 사용하여, 각각을 첨가 한 후, 용액의 pH를 모니터링한다. 4 ° C 또는 케에서 보관얼음에 EP.
    2. 후드를 소독하기 위해 20 ~ 30 분 동안 조직 문화 후드의 자외선을 켭니다.
    3. 오토 클레이브 집게, 주걱, 살균 용 메스.
    4. 조직 문화 후드를 사용하여 0.2 N HEPES (pH가 9) 및 ml의 10 배 MEM 1.5의 1.5 ml의 혼합. 사용하기 전에 5 초 동안 얼음과 소용돌이를 잘 보관해야합니다. 4 ° C에서 보관 또는 얼음에 보관하십시오.
    5. PCR 후드를 소독하기 위해 30 분 동안 자외선을 켭니다.
    6. 10 분 동안 -20 ° C에서 12 웰 플레이트와 20 ML의 주사기를 놓고, 또는 준비가 될 때까지 계속합니다. 참고 : 사용할 준비가 될 때까지 차가운 모든 자료를 보관하십시오. 온도의 증가는 조기 콜라겐 fibrillogenesis를 유도한다.
    7. 70 % 에탄올로 후드에 살균하기에 건조 할 예정 모든 튜브와 웰 플레이트 스프레이. 나중에 사용하기 위해 냉각 얼음에 20 ML의 주사기를 놓습니다.
    8. PCR 후드, BSA 고무 메스를 사용 해제하는 스테인리스 금형을 열 BSA (R)의 배출 채널 컷ubber 금형.
    9. PCR 후드에서 HEPES-MEM 용액 1 ㎖를 멸균 콜라겐 튜브를 열고 추가 (확인 그것이 잘 혼합 더 단단한 보증금은 없는지, HEPES-MEM 솔루션을 추출하기 전에).
    10. 멸균 주걱을 사용하여, 철저하게 콜라겐과 완충 용액을 혼합한다.
    11. 닫기과 소용돌이 신속하게 잘 혼합 된 하이드로 겔을 보장합니다.
    12. 차가운 20 ML의 주사기에 전송합니다.
    13. 한 손으로도 내부 BSA 고무를 누르고, 다른 쪽을 이용하여, 웰의 바닥에 콜라겐 겔 용액의 절반을 분배.
    14. 멸균 핀셋을 사용하여, 고무 유입과 유출 끝이 아니라의 측면에 접촉되어 있는지 확인합니다.
    15. 완전히 덮여 때까지 고무의 상단에 콜라겐 솔루션을 따르십시오.
    16. BSA 고무가 콜라겐 내에서 정지되어 있고, 특히 고무의 끝 근처에 거품이 없는지 확인합니다.
    17. 덮개를 놓고 주위 파라 필름 포장잘 둘레.
    18. 37 ° C에서 1 시간 동안 인큐베이터에 넣어. 의 PCR 자외선을 유지합니다.
  2. 콜라겐의 중합 후, UV는하기 절차를 가교 하이드로 겔.
    주 : 콜라겐 가교 에너지의 양을 제어 할 수있는 UV 가교제 장치를 사용하여 수행한다.
    1. UV 가교제를 켜고 63 μJ / ㎠로 빈 챔버를 조사하는 에너지 설정을 사용합니다.
    2. 인큐베이터에서 젤을 제거합니다.
    3. 에탄올로 손을 스프레이하고, 챔버 내에서 가능한 한 빨리 뚜껑을 제거합니다.
    4. 챔버를 닫고 UV 에너지 설정을 선택하고 63 μJ / ㎠를 조사하여 하이드로 겔을 가교.
    5. 가교주기 후, PCR 후드에 자외선을 해제
    6. 에탄올로 손 스프레이 빠르게 웰 플레이트에 다시 뚜껑을 배치, 챔버를 엽니 다. 잘 플레이트를 이동PCR의 후드.
    7. 부드럽게 풀어 우물에서 젤을 제거, 멸균 주걱을 사용. 하이드로 겔의 바닥 가교 후드 겔 플립. 단계를 반복 6.2.3과 6.2.4.

BSA 고무 7. 효소 소화

  1. 중공 콜라겐 지지체를 위해, 하이드로 겔에 포함 된 차원에 영향을주지 않는 방식으로 BSA 고무를 제거한다. 절차는 다음과 같다.
    1. 조직 문화 후드를 소독하기 위해 20 ~ 30 분 동안 자외선을 켭니다.
    2. 0.25 % 트립신 용액의 pH 7.8을 확인합니다. 예를 들어, 물 15 mL를 들어, 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 트립신 0.0376 g을 추가한다. 1 M NaCl을 소량 (2-5 μL)을 추가하여 7.8로 pH를 조정합니다. 20 mL의 주사기에 넣고 용액을 0.20 μm의 주사기 필터로 덮인. 필터를 통해 액체를 추방하고 새로운 튜브에 멸균 솔루션을 수집하는 플런저를 누르십시오.
    3. 수조를 켜고 (30)의 온도를 설정기음.
    4. 30 분 후, 자외선을 끕니다. 후드에 사용되는 모든 튜브와 재료에 에탄올을 스프레이.
    5. 별도의 원뿔 관에서 후드와 장소에 따라 콜라겐 하이드로 겔을 전송합니다.
    6. 각 튜브에 7.8의 pH와 0.25 % 트립신 용액 (젤을 충당하기에 충분한) 약 3 ~ 5 ML을 추가합니다.
    7. 약 1 분 동안 가볍게 파라 필름과 소용돌이 튜브를 밀봉합니다.
    8. 15-24 시간 동안 30 ° C의 물을 욕조에 넣어. BSA 고무 소화 또는 하이드로 겔에서 제거 될 때까지 물을 욕조에있는 동안, 가볍게 자주 젤을 소용돌이.
      참고 : 위해 BSA 고무가 제거되었는지 확인하기 위해, 하나 고무 트립신 용액에 떠 또는 고장난 조각이있다. 하이드로 겔 내에서 시각적 어두운 부분이 없어야합니다.
  2. 아래에 설명 된대로 모든 BSA 고무 및 트립신은 하이드로 겔에서 제거되었는지 확인하기 위해, 린스.
    1. PCR의 ~이 켭니다20 ~ 30 분 동안 D 자외선.
    2. Mosconas 솔루션을 준비합니다. 물에서 염화칼륨 (KCl을, 28.6 mM)을 (수 NaHCO3 11.9 mM)을 포도당 (9.4 mM)을하고 (NaH를 2 PO 4, 0.08 mm)를 결합한다. 1 M NaOH를 12 M HCl 용액으로 pH 7.4까지를 조정합니다. 20 ML의 주사기에서 솔루션을 배치하고 솔루션을 소독하기 위해 0.20 ㎛의 주사기 필터를 사용합니다.
    3. 후드에 그들을 배치하기 전에 에탄올로 모든 스프레이 및 에탄올 건조 할 수 있습니다.
    4. 튜브를 열고 새 50 ML 원뿔 관에 멸균 Mosconas 솔루션의 5 ~ 10 mL로 전송합니다.
    5. 효소 용액을 포함하는 원뿔형 튜브에 콜라겐 겔을 전송. 하이드로 겔이 완전히 용액으로 덮여 있는지 확인합니다. 30 분 동안 4 ° C의 냉장고에있는 통에 튜브를 남겨주세요.
    6. Mosconas 솔루션과 두 번 단계를 반복 7.2.5을 대기음.
    7. 4 ℃에서 보관하십시오.

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결과

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결과는이 기술이 biofabrication 생체 조직에서 본 공간 배열을 모방 할 수 3D 골격을 생성하는데 효율적임을 보여준다. 구조적 특징들은 조직의 생체 내 상호 작용 및 세포 기능에 중요한 역할을하는 조직 공학 응용을위한 중요한 파라미터이다.

BSA 고무의 일관성 및 균일 혼합 성이 그 의도 된 형상을 유지할 수 BSA 고무의 제조에서 중요한 파라미터이다. 단백질의 용해성은 단백질 - 단백질 상호 작용하고, 전체 단백질의 거동 변화를 유도 용매와 같은 분자간 상호 작용 효과에 의해 결정된다. BSA 용액의 전도도는 용액의 염 농도의 지표 인 측정 하였다. 표 1리스트를 combinatiBSA의 기능은, 용매, 및 글루 타르 알데히드 테스트. 예상 한 바와 같이, 가장 높은 전도도를 가지고 샘...

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토론

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Biofabrication 생물학 및 공학 원리가 기​​본 조직을 모방 복잡한 물질을 생성하기 위해 병합하는 고도의 전문 분야 필드입니다. 이를 달성하기 위해서, 생체 조직으로부터 수집 한 정보를 사용하여 시험 관내 지지체로 번역 기술을 개발할 필요가있다. 이러한 방식으로, 플랫폼이 밀접 생체 조직, 구조적 기능적, 기계적 특성과 유사한 것으로 설계 될 수있다. 최적 발판 재료, 예컨대 생체 적합성 인 특정 성질을 가지고 관심 조직의 기계적 특성을 모방 제어 분해 능력 세포 생존을 지원할 수 및 2,3- 리모델링 조직을 허용 할 수 있어야한다.

제조 기술의 수많은 가능한 입체 구조를 생성하기 위해 개발되었다. 이러한 기술은 두 가지 범주로 구분 : 기존의를d를 고급. 종래 기술은 다공성 구조를 만드는 합성 및 천연 전통적인 재료의 사용을 포함한다. 일부 예는, 용매 캐스팅 동결 건조, 성형 용융물. 이러한 기...

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공개 사항

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저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

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이 작업은 NIH-NIDCR IRO1DE019355(MJ Yost, PI) 및 NSF-EPSCoR(EPS-0903795)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
콜라겐 유형 I송아지 가죽에서 추출한 콜라겐
하이드로클로릭산(HCl)시그마-알드리치7647-01-0
인산염 완충 용액(PBS 정제)MP BiomedicalU5378100ml당 1
소 혈청(BSA)에서시그마-알드리치A9647
글루타르알데히드시그마 -알드리치G5882독성
라드필드3090
스테인리스 스틸 금형Microlution 기계를 사용하여 밀링
브러시 키트중앙 공압47791
이중 주사기 용 믹싱 팁MedmixML2.5-16-LLM믹서, DN2,5X16, 4 : 1 갈색,
med 이중 주사기 용 소형 O 링MedmixPPB-X05-04-02SM피스톤 B, 5 ml, 4:1, PE 천연
더블 주사기 캡 MedmixVLX002-SM캡, 4:1/10:1, PE 브라운,
이중 주사기용 메드 빅 O 링MedmixPPA-X05-04-02SM피스톤 A, 5ml, 4:1
더블 주사기MedmixSDL X05-04-50M이중 주사기, 5ml, 4:1
더블 주사기 디스펜서MedmixDL05-0400M디스펜서, 5ml, 4:1, med, 일반
Laminim3.6 mg/ml - 추출된 USC 실험실
20 ml 주사기 루어 잠금 팁BD302830
루어 잠금 캡FisherJGTCBLLX
HEPES시그마 -AldrichH4034
Gibco 최소 필수 매체 10x (MEM)Life Technologies1143-030
TrypsinLife Technologies27250-018
UV Crosslinker Spectroline UVXLE1000
Sodium Cloride (NaCl)FisherS271-10Mosconas
염화칼륨 (KCl)준비 시그마 -AldrichP5405-250Mosconas
중탄산 나트륨 (NaHCO3)FisherBP328-500준비 Mosconas
포도당시그마 -AldrichG-8270준비 Mosconas
Sodium Phosphate didasic (NaH2PO4)Sigma-AldrichS-7907Mosconas
멸균 필터를Corning431224
정으로 1x PBS 알부늄 만들기 에어 주사기용 준비하기 위해

참고문헌

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