염증 부위에서 이펙터 CD4 T 세포의 삽입 운동을 제어하는 메카니즘은 상대적으로 알려져 있지 않다. 우리는 시각화 현장에서 이러한 세포의 동적 거동의 연구를 허용 염증 귀 진피의 시험 관내 -primed CD4 T 세포에서 조작하는 비 침습적 방법을 제시한다.
이 논문에서
요약
초록
이펙터 기능을 수행하는 CD4 T 세포의 능력은 같은 아직 정의되지 않은 메카니즘을 통해 염증 말초 조직에서 이들 세포를 신속하고 효율적인 이동에 의존한다. 면역계 연구에 다 광자 현미경의 적용은 그대로 조직 내 면역 반응의 동역학을 측정하는 도구를 제공한다. 여기에서 우리는 염증 마우스 귀 진피에 CD4 T 세포의 비 침습적 생체 내에 광자 이미징을위한 프로토콜을 제시한다. 맞춤 이미징 플랫폼을 이용하여 정맥 카테터 운동성에 관여하는 중요한 분자 성분에 대한 항체를 차단의 추가를 통해 실시간으로 이러한 세포를 심문하는 기능, 진피 간질에서 CD4 T 세포 역학 시각화 가능하다. 이 시스템은 체외 모델과 외과 적 침습 이미징 절차 둘다 장점을 제공한다. 운동에 대한 CD4 T 세포에 의해 사용되는 경로를 이해하는 것은 궁극적으로 BASI에 대한 통찰력을 제공 할 수있다C의 CD4 T 세포의 기능뿐만 아니라 만성 감염에서 양자 면역 질환의 발병 기전 및 병리.
서론
CD4 T 세포의 효과기 기능은 다양한 말초 조직에 빠르게 들어가 횡단하여 손상을 조사하거나, 감염 병소를 찾거나, 만성 감염 또는 자가면역으로 인한 병리를 유발하는 능력에 결정적으로 의존합니다. 염증이 있는 부위1-4로의 귀환 과정과 혈관 구조에서 조직으로의 유출5-7은 잘 규명되었지만, T 세포의 간질 운동성을 유도하고 조절하는 요인은 정의되지 않았습니다. 복잡한 3D 환경에서 T 세포의 이동은 인공 매트릭스8-10 또는 미세유체 장치(11,12)를 사용하여 시험관 내에서 연구되었지만, 이는 생체 내 시스템의 복잡하고 역동적인 환경을 요약하지 못합니다. 최근에야 고해상도 다색 생체 내 이미징의 출현으로 현장에서 면역 세포의 동적 행동을 연구할 수 있게 되어 온전한 면역 반응을 더 잘 이해할
수 있게 되었습니다.10여 년 전, 면역학적 질문을 해결하기 위해 다광자 현미경을 처음으로 활용한 몇 가지 영향력 있는 연구가 발표되었습니다. 초기 연구는 이식된 림프 기관 내 면역 세포의 행동에 초점을 맞췄고,13-16 마취된 마우스에서 노출된 림프절을 이미지화하는 기술이 곧 뒤따랐습니다17
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프로토콜
마우스와 관련된 모든 절차는 로체스터 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을, 그리고 국립 연구소에 의해 관리되는 동물 복지법과 동물 애호 관리 및 실험 동물의 사용에 대한 공공 보건 서비스 정책을 엄격히 준수하여 수행 하였다 건강, 실험 동물 복지 사무소.
이펙터 CD4 T 세포의 제조 (1)
참고 : 특히 닭 계란의 난백 알부민에서 펩티드 (: ISQAVHAAHAEINEAGR의 pOVA)를 인식 BALB / C의 TCR 유전자 변형 DO11.10 마우스. 다른 TCR 형질 전환 시스템을 나타내는 곳의 pOVA 대신 적절한 동족 펩티드를 이용하여 치환 될 수있다.
- 순진한 CD4 T 세포를 정화
- 2 L에 노출시켜 6 ~ 8 주 된 여성 DO11.10 BALB / C 마우스를 안락사 / 분 CO 2는 마우스 이동이나 1 분 동안 호흡의 징후, 자궁 경부 전위 다음에, 또는에 따라 표시하지 않을 때까지지역 기관 동물 케어 및 사용위원회의 가이드 라인. 70 % 에탄올 용액으로 스프레이 마우스 복부 끝까지 2/3 마우스의 턱의 피부에서 약 7cm 절개를 만든다. 뒷다리 다리를 향해 복부 절개의 끝에서 2-3cm의 피부 절개를합니다.....
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결과
면역 환경 변화없이 제자리에서 면역 반응을 연구 할 수있는 능력은 염증 조직으로 T 이펙터 세포의 실시간 상호 작용을 연구하는데 필수적이다. 도 1A 및 B에 요약 된이 프로토콜에 의해 그대로 이어 진피 이미징, 진피 간질 양도 형광 표지 T 이펙터 세포의 시각화를 허용한다. 이것은 고해상도 (도 1C) 및 저속 (도 1D, 영화 1) 염증 진피 이펙터 T 세포 역학 이미지 모두를 허용한다.
도 1 고해상도 및 손상 피부 간질에서 이펙터 T 세포 4D 촬상.
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토론
의미
여기에서 우리는 그대로 마우스 귀 진피에 전달, 항원 특이 이펙터 Th1 세포의 4D 시각화를위한 완벽한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 여러 가지 이유로 몇몇 현재 영상 방식에 비해 많은 장점을 제공한다. 복부 귀 진피 촬상함으로써 다른 피부 부위를 포함하는 촬상 프로토콜이 필요 제모를 포기 할 수있다. 제모 일반적으로 온화하지만, 이들은 피부 장벽 (42)에 대한 면역 반응을 자극 할 수 43,44 프로세스를 중단을 야기하는 것으로 나타났다. 또한 진피 또는 피하을 노출 침습 수술 절차를 피함으로써,이 프로토콜은 손상에 의한 염증과 진피로 호중구 (37) 및 다른 면역 세포의 빠른 채용을 방지 할 수 있습니다. 키 분자에 대하여 차단하는 항체를 제공하기이 시스템에 정맥 카테터의 사용은 다이나 실시간 심문 허용CD4 T 세포의 마이크 동작. 이 촬상 프로토콜의 사용은 .......
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
저자는 라이브 영상에 대한 도움말은 로체스터 다중 광자 현미경의 핵심 시설의 대학 감사합니다. DJF에 NIH AI072690 및 AI02851에서 지원; MGO에 AG 및 AI089079에 AI114036.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
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| BALB/c 마우스 | Jackson Laboratories | 000651 | 사용된 마우스는 사내에서 사육 |
| DO11.10 마우스 | Jackson Laboratories | 003303 | 사용된 마우스는 사내에서 사육되었습니다 |
| HBSS | Fisher | 10-013-CV | Multiple Equivalent |
| Newborn Calf Serum (NCS) | Thermo/HyClone | SH30118.03 | 56 °에서 열 비활성화; C 30분 동안 |
| 기니피그 보충 | Cedarlane | CL-5000 | |
| 항-CD8 항체 | ATCC | 3.155 (ATCC TIB-211) | 이 하이브리도마 |
| 항-MHC 클래스 II 항체 | ATCC | M5/114.15.2 (ATCC TIB-120) | 에서 유래한 항체 이 하이브리도마 |
| 항-CD24 항체 | ATCC | J11d.2 (ATCC TIB-183) | 에서 유래한 항체다음에서 유래한 항체 이 하이브리도마 |
| anti-Thy1.2 항체 | ATCC | J1j.10 (ATCC TIB-184) | 항체 유래 이 하이브리도마 |
| Ficoll (Fico/Lite-LM) | Atlanta Biologicals | I40650 | |
| PBS | Fisher | 21-040-CV | Multiple Equivalent |
| EDTA | Fisher | 15323591 | |
| biotinylated anti-CD62L 항체 (클론 MEL-14) | BD | ||
| 스트렙타비딘 자기 분리 비드 | Miltenyi | 130-048-101 | |
| MACS LS 분리 컬럼 | Miltenyi | 130-042-401 | |
| 재조합 인간 IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| 재조합 마우스 IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| 재조합 마우스 IL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| 항-IFNg 항체 (클론 XMG 1.2) | eBioscience | 16-7311-85 | |
| 항-IL-4 항체 (클론 11b11) | eBioscience | 16-7041-85 | |
| RPMI | VWR | 45000-412 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 피셔 | 15303641 | |
| L-글루타민 | 피셔 | 15323671 | |
| 2-메르캅토에탄올 | Bio-Rad | 161-0710 | |
| 오브알부민 펩타이드 | 바이오펩타이드 | ISQAVHAAHAEINEAGR-OH 펩타이드 | |
| 태아 송아지 혈청(FCS) | Thermo/HyClone | SV30014.03 | 56°C에서 열 비활성화; C 30분 동안 |
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| 텍사스 레드 덱스트란(70,000MW) | Life Technologies | D-1830 |
참고문헌
- Denucci, C. C., Mitchell, J. S., Shimizu, Y. Integrin function in T-cell homing to lymphoid and nonlymphoid sites: getting there and staying there. Critical reviews in immunology. 29 (2), 87-109 (2009).
- Gehad, A., et al.
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