동시 정량을위한 이중 디지털 PCR 분석 엔테로 종.과 바다에서 인간 방패 관련 HF183 마커

Summary

이 원고를 동시에 엔테로 종을 정량화하는 데 사용할 수있는 이중 디지털 PCR 분석. 레크리에이션 바다에서 일반과 인간의 관련 분변 오염의 지표로 HF183 유전자 마커를 설명합니다.

Abstract

이 원고는 엔테로 종의 동시 정량. 인간 배설물 관련 HF183 마커에 대한 이중 디지털 PCR 분석 (EntHF183 dPCR)에 대해 설명합니다. EntHF183 이중 dPCR (EntHF183 dPCR로 함 이에 관해서) 분석은 공개 된 개별 정량 PCR (qPCR에) 대응과 같은 프라이머 및 프로브 시퀀스를 사용합니다. 마찬가지로, 이전 qPCR에 대해 수행과 같은 물 여과 및 DNA 추출 절차는 dPCR를 실행하기 전에 다음에 있습니다. 그러나, 이중 dPCR 분석은 qPCR에 분석을 통해 몇 가지 장점이 있습니다. 가장 중요한 dPCR 분석은 대상의 직접 정량화하여, 따라서 표준 곡선을 실행에 대한 필요성, 관련 바이어스 및 가변성을 제거합니다. qPCR에있는 (즉, 동시 정량) 엔테로 및 HF183를 양면 인쇄하는 동안뿐만 아니라, 종종 샘플 덜 풍부한 대상의 심각한 과소 평가로 연결, dPCR 두 목표의 일관성 정량을 제공하며, 자극그녀는 동일한 반응을 개별적으로 또는 동시에 정량. dPCR 분석도 qPCR에 의해 용인보다 높은 크기 1 ~ 2 오더이다 PCR 억제제의 농도를 허용 할 수있다. 그것은 동시에 두 개의 별도 qPCR에 분석을 실행할 필요없이 환경 바다에서 모두 일반과 인간의 관련 분변 오염에 대한 정확하고 반복 가능한 정보를 제공하기 때문에 이러한 장점은 EntHF183 dPCR 분석이 특히 매력적. qPCR에 이상 장점에도 불구하고, 현재 사용 가능한 장비와 dPCR 분석의 상부 정량 한계는 약 qPCR에 의한 달성보다 낮은 크기의 네 주문이다. 따라서, 희석 등의 일반적으로 하수 유출이 관찰 된 것과 대상 생물의 높은 농도의 측정을 위해 요구된다.

Introduction

들이보다 빠르고 유연하고 전통 문화 기반 방법에 비해 특정한 때문에 정량적 PCR (qPCR에) 방법이 널리 오락 수질 모니터링 및 미생물 소스 추적 애플리케이션에 사용되어왔다. 따라서, qPCR에이 같은 엔테로 종으로 일반 배설물 지표에 대한 신속한 물 모니터링 결과를 달성하는 것이 좋습니다. 개정 USEPA 레크리에이션 수질 기준 ^1. 대부분의 qPCR 분석은 개발 ^환경이 물에 분변 오염의 소스를 식별하기위한 검증되었다. 이들 중에서도 HF183 마커 분석은 가장 자주 인간 분변 오염 연관된 ³ 식별하는데 사용들이다.

그들이 정량 표준 곡선에 의존하기 때문에, qPCR의 결과는 종종 편향 될 수있다. qPCR에는 스탠에서 자신의 정량주기 (Cq와)를 보간하여 샘플 대상의 알 수없는 농도를 정량화Cq와와 직렬로 희석 된 표준 세트의 로그 양 사이에 선형 관계를 설명 바 닥 곡선. 안정적이고 일관된 표준 참조 물질의 부족 때문에 크게 qPCR에 결과를 바이어스 할 수 있습니다. 연구 qPCR의 결과가 서로 다른 공급 업체의 ^4에서 약 절반 로그 사용 기준에 차이와 같은 공급 업체 ⁵ 표준의 다른 배치를 사용하여 2 배에 의해 것으로 나타났다.

디지털 PCR (dPCR) 기술은 균일 한 나노 리터 또는 피코 리터 반응 ⁶ 수천 또는 수백만 벌크 qPCR의 분할에 의해 생성 된 소형 PCR들의 다수의 긍정의 빈도를 카운트하여 미지 시료를 정량화한다. 파티션이 물 유 방울 (즉,이 문서) 또는 칩에 작은 챔버 경우 그것은 각각 (즉,이 문서) 방울 디지털 PCR 또는 챔버 디지털 PCR로 언급된다. 높은 샘플 농도는 대상 DNA의 존재를 야기 할파티션의 높은 비율 (따라서 긍정적 인 PCR), 포아송 분포로 근사 관계. 이와 같이, 이진 결과 (양 또는 음 PCR)이 기록되어 포지티브 액적 주파수 qPCR에 같이 표준 곡선에 대한 필요성을 제거 직접 포아송 근사 통해 미지의 샘플 농도를 계산하는데 사용된다.

디지털 PCR 정량이 진 본성은 qPCR에 ⁷ 위에 추가 이점을 제공한다. 지연 증폭 여전히 양성 PCR을 수득 할 수 있기 때문에, dPCR 정량화는 증폭 효율을 감소 억제에 대해 더 강력하다. qPCR에 ^{8 ~ 10에} 비해 dPCR 높은 정밀도로 이어지는, qPCR에있다 마찬가지로, dPCR 정량이 된 CQ 값의 변동에 의해 영향을받지 않습니다.

또한, 분할 프로세스는 효과적으로 amplificatio 동안 (기판의 경쟁을 최소화하는 각 방울에 타겟 DNA에 존재하는 매우 소량 보장qPCR에에 (즉, 분석이 동시에 두 개의 DNA 목표를 측정) 양면 인쇄를 달성하기위한 일반적인 장애물 서로 다른 DNA 대상)의 n은. 따라서, 양면 또는 단면에 실행 (즉 하나의 대상이 하나의 분석에서 측정) 여부를 dPCR 모두 대상 ^7,11의 거의 구별 정량을 생산하고 있습니다.

이 문서에서 설명하는 디지털 PCR 분석 (EntHF183 dPCR)의 목표는 일반 배설물 표시 엔테로 종의 동시 직접 정량화를 얻을 수 있습니다. 향상된 정밀도, 재현성 및 억제에 대한 견고성과 인간 배설물 관련 HF183 마커는 qPCR에 비교 대응. 이 분석은 성공적 환경 담수, 해수 및 각종 분뇨 ⁷ 분변 오염의 정량을 위해 사용되었지만, 또한 물 및 폐수의 다른 유형에도 적용될 수있다. 이 분석은 때문에 그것을 퇴적물 또는 토양 분석을위한 큰 약속을 보유하고억제에 높은 내성을이야,하지만 억제제는 샘플의 이러한 종류의 혼합의 추가 시험 때문에 복잡성 요구된다.

Protocol

1. 분석 혼합물 준비

1. TE의 pH 8 버퍼에있는 모든 분자 수준의 물에 프라이머 및 프로브 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ ¹² 100 μmol / L의 재고 농도를 확인; HF183-1, BthetR1, BthetP1 ^3].
   참고 :이 타겟 프로브는 형광 재료 / 장비 목록에 표시된 다른 형광 ^(7)으로 표시됩니다.
2. 계획 반응에 따라 혼합하여 12 μl의 디지털 PCR 믹스 마스터 믹스를 준비 0.216 ㎕를 앞으로 각 (배 재고, 자재 / 장비의 목록 참조) 프라이머, 0.06 ㎕를 각 형광 프로브를 반대하고, 클레아없는 물 μl를 5.016 (최종 농도 : 900 nM의 각각의 프라이머, 250 nM의 각 프로브). 용액에 공기 방울을 소개 않도록주의하면서 혼합 아래로 적어도 10 시간을 피펫합니다.
3. 6 μL의 DNA 템플릿에 혼합 일반 PCR 튜브 또는 판에, (단계 1.2에서) 피펫 18 μL 마스터 믹스 (기술은 기존과 같이 추출교활한 ¹³⁾ 액적 생성에 대한 분석 혼합물을 확인합니다. 중복 샘플을 실행하면, 피펫 마스터 믹스 36 μl를 잘 각각에 12 μl의 DNA 템플릿입니다. 접시에 해당하는 복제 우물이 비어 둡니다. 양성 대조군 (자재 / 장비의 목록 참조)없이 템플릿 컨트롤 (NTC를) 포함 (즉, 템플릿으로 사용되는 분자 수준의 물).
   주 : 양성 대조군 분석이 올바르게 실행되고 있는지 확인하기 위해 필요하며, NTC 플레이트 내에 오염이없는 보장하고 데이터 분석 뒷부분 형광 기준선을 설정하는 것이 필요하다. 처음 사용자는 모두 원액 희석 DNA 샘플을 사용하는 것이 좋습니다.

2. 물방울 생성 및 PCR 플레이트 설치

1. 멀티 채널 피펫을 사용하여 아래로 약 15 시간을 피펫 팅하여 분석 혼합물을 섞는다. 피펫 팁이 혼합물 내에서 초과 거품을 방지하기 위해 액체 내에서 유지 있는지 확인합니다.
2. 기능ERT의 흰색 카트리지 홀더에 카트리지 1 (포함 8 우물) 카트리지 홀더 종료를 클릭합니다. 카트리지 1은 제자리에 있으며 방울을 생성하는 동안 홀더에서 빠질 수 없습니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 조심스럽게 기포를 도입하지 않고 카트리지 표시된 "예제"의 중간 위치로 분석 혼합물 20 μl를 옮긴다.
3. 피펫은 카트리지의 좌측 액적 생성 오일을 70 μL의 ( '유'로 표시).
4. 개스킷 개스킷과 플랫 (4)에 의해 균일하게 유지된다 확인한와 커버 카트리지는 카트리지의 가장자리를 향해 틱. 열고 카트리지를 배치 방울 생성기의 녹색 조명 버튼을 누릅니다. 를 눌러 발전기를 닫 버튼을 다시 녹색 조명.
   참고 : 문이 닫히고 나면, 버튼을 흐리게 문을 다시 열 수 없으며 액적 발생 즉시 약 1 분 동안 계속 시작합니다.
5. 두 번째 이상 8 반응, 장소 카트리지 2 일 경우액적 생성 총 설정 시간을 저장하는 진행 중에 흰색 카트리지 홀더 및 카트리지 (1)과 동일한 방법으로 준비한다.
6. 희미한 조명 버튼을 액적 생성의 완료를 나타내는 녹색으로 바뀌면 방울 생성기 문을 엽니 다. 방울 생성기에 흰색 카트리지 1 포함 카트리지 홀더, 따로 설정 및 장소 카트리지 (2)를 제거합니다.
7. 카트리지 1 가스켓을 제거하고 폐기합니다. 부드럽게 열 사이클링 (실온에서 유지), 최종 PCR 플레이트에 카트리지 ( '물방울'로 표시)의 세 번째 열에서 생성 된 방울의 전체 부피 (약 40 μL)를 옮긴다.
   참고 : 새로 생성 된 물방울을 깰 수있는 작업으로 흰색 카트리지 홀더를 해제합니다하지 마십시오 방울 최종 판에 전사 된 후에 만​​ 카트리지 홀더를 연다.
8. 반복하여 추가 샘플에 대한 2.1-2.7 단계를 반복합니다.
9. 모든 방울 최종 PCR 플레이트되면 뚫을 배치접시 위에 호일 커버와 접시 시일에 놓습니다. 실러에 180 ° C 키를 눌러 '재생'에 대한 봉인을 설정하고 10 초 동안 실을 수 있습니다.

3. 열 사이클링과 물방울 읽기

1. 열 사이 클러에 밀봉 판을 놓고, 단계 2.7에서 사용 된 최종 PCR 플레이트, 2.0 ° C / sec의 온도 램핑 속도에 대응 한.
2. 다음 열 프로그램을 실행하여 10 분간 유지 한 다음 94 ℃에서 30 초, 95 ° C에서 10 분, 60 ° C에서 60 초 선택적 98 ° C (AT : 최종 보류 4 또는 15 ° C).
3. 사이클 종료 후, 각 웰에 각각의 액적에서 형광의 자동 측정을위한 액적 리더 플레이트를 옮긴다. 또한, 액적 읽기 전에 최대 3 일 동안 4 ° C에서 접시를 저장합니다. 물방울 읽기를 진행하기 전에 실온에 있는지 확인.
   1. 설정에 방울 독서를 동반하는 소프트웨어를 엽니 다. 에서'샘플', '분석 1'과 '분석 2.'빈 96 웰 플레이트의 개략적 인을 포함하는 기본 '설정'메뉴는 두 번 세 부분을 포함하는 메뉴를 엽니 다 잘 A1을 클릭
   2. '샘플'섹션에서 '이름'키를 누릅니다 입력하거나 표시 오른쪽에있는 상자를 확인 표시된 상자에 샘플 ID를 입력합니다 '적용을.' 다음, 메뉴 표시 '실험'드롭 다운을 클릭하고 'RED'(희귀 이벤트 감지)를 선택하고 입력을 클릭합니다.
   3. '분석 1.'표시 부분으로 이동 '이름'섹션에서 분석 (예를 들어, 엔테로)를 작성하여 입력을 클릭합니다. 라벨 '형식'아래 상자에서 드롭 다운 메뉴를 클릭하고 '채널 알 수없는 1'을 선택하고 입력을 클릭합니다.
   4. '분석 2.'표시 부분으로 이동 '이름'섹션에서 분석 (예 : HF183)를 작성하여 입력을 클릭합니다. 라벨 '형식'아래 상자에 메뉴 드롭 다운을 클릭'채널 알 수없는 2'를 선택하고 입력을 클릭 거라고. 3.3.4에 3.3.2 지금 단계에서 모든 정보는 잘 A1에서 제시한다.
   5. 방울을 포함하는 모든 후속 우물의 이름을 지정합니다. 총 설치 시간을 절약하기 위해 동시에 여러 우물을 선택하는 '시프트'또는 'Ctrl 키를,'을 클릭합니다.
   6. 판의 디지털 묘사 메뉴의 오른쪽 하단에 물리적 판을 눌러 'OK'를 반영합니다. '템플릿'섹션 아래에있는 판 회로도의 상단에 표시되는 새 메뉴에서 '다른 이름으로 저장'와 이름을 선택하고 판을 저장합니다.
   7. 화면의 왼쪽에있는 '실행'을 클릭하고 팝업 아웃 "실행 옵션"창에 적절한 염료 설정을 선택합니다. 데이터 수집 시작하고 소프트웨어에서 실시간으로 표시됩니다.

4. 데이터 분석 및보고

1. 독자가 완료되고 상자 '완벽한 실행'라는 나타나면 '확인'을 클릭합니다.
   참고 : 소프트도자기는 소프트웨어의 '분석'섹션에서 최종 데이터 파일을 표시합니다. 이 관점에서, 소프트웨어는 '2D 진폭의 데이터 플롯에 선택한 모든 접시에 우물과 기본값을 가지고있다.
2. 양극과 음극 방울 사이의 거리를 확인합니다. NTC 우물에있는 모든 방울의 형광베이스 라인 근처에 있는지 확인합니다.
3. 표시된 버튼을 클릭 '이벤트.' 제시된 막대 그래프의 오른쪽에 '총'라는 이름의 상자 당 잘 받아 방울의 총 수를 표시하기 위해 하단에있는 "하나"라는 이름의 상자를 클릭합니다. Ctrl 키를 누른 제외 할 잘 (들)을 클릭하여 <10,000 방울 ^(7)를 포함하는 모든 우물을 제외합니다.
4. 모두 타겟 NTC 우물에 부정적인 방울 위의 약 하나의 표준 편차 (500-700 형광 단위)에서 형광 임계 값을 설정하는 '1D 진폭'로 표시 버튼을 클릭합니다. 화면 유엔의 바로 왼쪽에두 개의 임계 버튼을 보여주는 '자동 분석'그것을 통해 실행하는 솔리드 핑크 수평 라인이 오른쪽에있는 아이콘을 선택 데르.
5. 진폭 그래프의 각에서 '설정 임계 값'의 왼쪽에있는 상자를 클릭하고 적절한 형광 임계 값을 입력합니다. μL 반응 당 복사본 목표 농도를 자동적으로 계산된다.
   주 : 임계 값 다른 표적에 대해 동일 할 필요는 없다.
6. 1D 진폭 화면의 왼쪽 상단 모서리에있는 '내보내기'버튼을 클릭하여 .csv 파일에 결과를 보냅니다. .csv 파일에서 DNA 템플릿 μL 당 대상의 복사 ㎕의 반응에 따라 대상의 사본 (엔테로 종의 23S 유전자. 또는 HF183 마커)에서 변환 (4)에 의해 수출 목표 농도를 곱합니다.

Results

좋은 EntHF183 이중 dPCR 실행 허용 방울 (약 10,000-17,000) 및 음과 양의 물방울 ⁷ 형광 값 사이의 비교적 큰 차이 (약 5,000)의 상대적으로 높은 숫자가 발생한다. 방울의 수가 비정상적으로 낮은 가능성 액적 생성 공정에서 문제를 나타내고, 만 방울의 차단이 문서에서 사용되는 액적 dPCR 시스템으로부터 경험적 데이터에 기초하여 제시된다. 양극과 음극 방울 사이의 약한 분리 (즉 작은 형광 차이) 억제하거나 성능이 저하 된 프로브 ^(7)을 표시 할 수있다.

qPCR에이 표준과 관련된 편견에 대한 수정과 더 억제 ^7가없는 경우 전반적으로, EntHF183 이중 dPCR 분석은 단순 qPCR에의 것과 매우 유사한 결과를 얻을 수 ...

Discussion

프로토콜에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 마스터 믹스 종래 qPCR의 마스터 믹스보다 점성이기 때문에 먼저, 분석 혼합물의 혼합은 어렵다. 간단한 텍싱 차례로 분석 혼합물에이어서 방울에 DNA 템플릿의 비 균일 한 분포로 연결 불충분 한 혼합, 발생할 수 있습니다. 프로토콜에 설명 된 혼합 별 피펫 팅 기술은 정확한 dPCR 정량을 보장하기 위해 따라야합니다. 둘째, 물방울이 균일 한 형태와 크기로 생성되도록하는 것이 중요하다. 시간이 방울 생성기가 하나의 카트리지가 평소보다 짧은에 방울 생성을 완료하는 데 걸리는 경우 경우 염두해야합니다. 이 최적의 액적 생성을 나타낼 수있다. 필요한 경우, 각각의 카트리지의 액적 생성 시간이 문제 해결을 위해 기록 될 수있다. 셋째, 전단없이 최종 PCR 플레이트에 카트리지로부터 발생 된 물방울의 전체 40 μL를 전송하는 것이 중요방울 및 정량만큼 방울을 가지고 있지 마십시오. 다음 기술은 전송을 위해 사용될 수있다 : 1) 40 μL에 멀티 채널 피펫을 설정하고 45 ° 각도 &#...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
낮은 바인딩 마이크로 튜브	Costar	3207	시약 저장, 마스터 믹스 샘플 / 생산
뉴클레아제 무료 물	FisherSci	BP2484-50
TE pH 8 버퍼	FisherSci	BP2473-100
하드 쉘 96 웰 플레이트	BioRad	HSP-9601	초기 마스터 믹스 및 샘플 접종
알루미늄 밀봉 필름	BioRad	359-0133	샘플 플레이트를 밀봉하려면
액적 발생기	BioRad	186-3002
액적 생성 오일	BioRad	186-3005
카트리지	BioRad	186-4008
DG8 카트리지 홀더	BioRad	186-3051
개스킷	BioRad	186-3009
20 μ l 피펫 팁	Rainin	GP-L10F	에 대한 샘플/마스터 믹스 tansferring용
; l 피펫 팁	Rainin	GP-L200F	최종 Twin.Tec 플레이트로 액적 이송용
Twin.Tec 96 웰 플레이트	Eppendorf	951020320	최종 액적 열 순환 및 판독용
피어싱 가능한 열 밀봉 호일	BioRad	181-4040	열 순환 전 Twin.Tec 플레이트 밀봉
PX1 PCR 플레이트 씰러	BioRad	181-4000
CFX96 열순환기	BioRad	CFX96 및 C1000	열 순환기만 필요하며, 광학은 필요하지 않습니다
QX100 드롭릿 리더	BioRad	186-3001
드롭릿 리더 오일	BioRad	186-3004
드롭릿 PCR 슈퍼믹스	BioRad	186-3024	i.e. 원고의 디지털 PCR 믹스
QuantaSoft 소프트웨어(v1.3.2)Quantasoft		QX100	ddPCR 데이터 보기, 분석 및 내보내기용
Entero Forward Primer (Ent F1A)	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	대체 공급 업체 사용 가능
Entero Reverse Primer (Ent R1)	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	대체 공급 업체 사용 가능
Entero Probe (GPL813TQ)	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	대체 공급 업체를 사용할 수 있지만 플로로포어는 FAM
HF183 Forward Primer ( HF183-1)	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	대체 공급업체를 사용할 수 있습니다
HF183 Reverse Primer (BthetR1)	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	대체 공급업체를 사용할 수 있습니다
HF183 프로브(BthetP1)	Operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	대체 공급업체를 사용할 수 있지만 플로로포어는 HEX여야 합니다(VIC를 사용하는 경우 적절한 매트릭스 보상을 선택해야 합니다.
양성 대조군			E. faecalis 게놈 DNA와 HF183 표준 플라스미드의 혼합물(IDT에서 주문). 주문한 HF183 플라스미드의 E. faecalis 배양에 대한 자세한 방법은 Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008)를 참조하십시오. 실험실에서 준비한 <E. faecalis 게놈 DNA 대신 상업적으로 사용 가능한 em>Enterococcus DNA 표준물(ATCC 29212Q-FZ)도 사용할 수 있습니다.