동시 정량을위한 이중 디지털 PCR 분석<em&gt; 엔테로 종.</em&gt;과 바다에서 인간 방패 관련 HF183 마커

요약

이 원고를 동시에 엔테로 종을 정량화하는 데 사용할 수있는 이중 디지털 PCR 분석. 레크리에이션 바다에서 일반과 인간의 관련 분변 오염의 지표로 HF183 유전자 마커를 설명합니다.

초록

이 원고는 엔테로 종의 동시 정량. 인간 배설물 관련 HF183 마커에 대한 이중 디지털 PCR 분석 (EntHF183 dPCR)에 대해 설명합니다. EntHF183 이중 dPCR (EntHF183 dPCR로 함 이에 관해서) 분석은 공개 된 개별 정량 PCR (qPCR에) 대응과 같은 프라이머 및 프로브 시퀀스를 사용합니다. 마찬가지로, 이전 qPCR에 대해 수행과 같은 물 여과 및 DNA 추출 절차는 dPCR를 실행하기 전에 다음에 있습니다. 그러나, 이중 dPCR 분석은 qPCR에 분석을 통해 몇 가지 장점이 있습니다. 가장 중요한 dPCR 분석은 대상의 직접 정량화하여, 따라서 표준 곡선을 실행에 대한 필요성, 관련 바이어스 및 가변성을 제거합니다. qPCR에있는 (즉, 동시 정량) 엔테로 및 HF183를 양면 인쇄하는 동안뿐만 아니라, 종종 샘플 덜 풍부한 대상의 심각한 과소 평가로 연결, dPCR 두 목표의 일관성 정량을 제공하며, 자극그녀는 동일한 반응을 개별적으로 또는 동시에 정량. dPCR 분석도 qPCR에 의해 용인보다 높은 크기 1 ~ 2 오더이다 PCR 억제제의 농도를 허용 할 수있다. 그것은 동시에 두 개의 별도 qPCR에 분석을 실행할 필요없이 환경 바다에서 모두 일반과 인간의 관련 분변 오염에 대한 정확하고 반복 가능한 정보를 제공하기 때문에 이러한 장점은 EntHF183 dPCR 분석이 특히 매력적. qPCR에 이상 장점에도 불구하고, 현재 사용 가능한 장비와 dPCR 분석의 상부 정량 한계는 약 qPCR에 의한 달성보다 낮은 크기의 네 주문이다. 따라서, 희석 등의 일반적으로 하수 유출이 관찰 된 것과 대상 생물의 높은 농도의 측정을 위해 요구된다.

서론

들이보다 빠르고 유연하고 전통 문화 기반 방법에 비해 특정한 때문에 정량적 PCR (qPCR에) 방법이 널리 오락 수질 모니터링 및 미생물 소스 추적 애플리케이션에 사용되어왔다. 따라서, qPCR에이 같은 엔테로 종으로 일반 배설물 지표에 대한 신속한 물 모니터링 결과를 달성하는 것이 좋습니다. 개정 USEPA 레크리에이션 수질 기준 ^1. 대부분의 qPCR 분석은 개발 ^환경이 물에 분변 오염의 소스를 식별하기위한 검증되었다. 이들 중에서도 HF183 마커 분석은 가장 자주 인간 분변 오염 연관된 ³ 식별하는데 사용들이다.

그들이 정량 표준 곡선에 의존하기 때문에, qPCR의 결과는 종종 편향 될 수있다. qPCR에는 스탠에서 자신의 정량주기 (Cq와)를 보간하여 샘플 대상의 알 수없는 농도를 정량화Cq와와 직렬로 희석 된 표준 세트의 로그 양 사이에 선형 관계를 설명 바 닥 곡선. 안정적이고 일관된 표준 참조 물질의 부족 때문에 크게 qPCR에 결과를 바이어스 할 수 있습니다. 연구 qPCR의 결과가 서로 다른 공급 업체의 ^4에서 약 절반 로그 사용 기준에 차이와 같은 공급 업체 ⁵ 표준의 다른 배치를 사용하여....

프로토콜

1. 분석 혼합물 준비

1. TE의 pH 8 버퍼에있는 모든 분자 수준의 물에 프라이머 및 프로브 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ ¹² 100 μmol / L의 재고 농도를 확인; HF183-1, BthetR1, BthetP1 ^3].
   참고 :이 타겟 프로브는 형광 재료 / 장비 목록에 표시된 다른 형광 ^(7)으로 표시됩니다.
2. 계획 반응에 따라 혼합하여 12 μl의 디지털 PCR 믹스 마스터 믹스를 준비 0.216 ㎕를 앞으로 각 (배 재고, 자재 / 장비의 목록 참조) 프라이머, 0.06 ㎕를 각 형광 프로브를 반대하고, 클레아없는 물 μl를 5.016 (최종 농도 : 900 nM의 각각의 프라이머, 250 nM의 각 프로브). 용액에 공기 방울을 소개 않도록주의하면서 혼합 아래로 적어도 10 시간을 피펫합니다.
3. 6 μL의 DNA 템플릿에 혼합 일반 PCR 튜브 또는 판에, (단계 1.2에서) 피펫 18 μL 마스터 믹스 (기술은 기존과 같이 추출교활한 ¹³⁾ 액적 생성에 대한 분석 혼합물을 확인합니다. 중복 샘플을 실행하면, 피펫 마스터 믹스 36 μl를 잘 각각에 12 μl의 DNA 템플릿입니다. 접시에 해당하는 복제 우....

결과

좋은 EntHF183 이중 dPCR 실행 허용 방울 (약 10,000-17,000) 및 음과 양의 물방울 ⁷ 형광 값 사이의 비교적 큰 차이 (약 5,000)의 상대적으로 높은 숫자가 발생한다. 방울의 수가 비정상적으로 낮은 가능성 액적 생성 공정에서 문제를 나타내고, 만 방울의 차단이 문서에서 사용되는 액적 dPCR 시스템으로부터 경험적 데이터에 기초하여 제시된다. 양극과 음극 방울 사이의 약한 분리 (즉 작은 형광 차이) 억제하거나 성능이 저하 된 프로브 ^(7)을 표시 할 수있다.

qPCR에이 표준과 관련된 편견에 대한 수정과 더 억제 ^7가없는 경우 전반적으로, EntHF183 이중 dPCR 분석은 단순 qPCR에의 것과 매우 유사한 결과를 얻을 수 .......

토론

프로토콜에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 마스터 믹스 종래 qPCR의 마스터 믹스보다 점성이기 때문에 먼저, 분석 혼합물의 혼합은 어렵다. 간단한 텍싱 차례로 분석 혼합물에이어서 방울에 DNA 템플릿의 비 균일 한 분포로 연결 불충분 한 혼합, 발생할 수 있습니다. 프로토콜에 설명 된 혼합 별 피펫 팅 기술은 정확한 dPCR 정량을 보장하기 위해 따라야합니다. 둘째, 물방울이 균일 한 형태와 크기로 생성되도록하는 것이 중요하다. 시간이 방울 생성기가 하나의 카트리지가 평소보다 짧은에 방울 생성을 완료하는 데 걸리는 경우 경우 염두해야합니다. 이 최적의 액적 생성을 나타낼 수있다. 필요한 경우, 각각의 카트리지의 액적 생성 시간이 문제 해결을 위해 기록 될 수있다. 셋째, 전단없이 최종 PCR 플레이트에 카트리지로부터 발생 된 물방울의 전체 40 μL를 전송하는 것이 중요방울 및 정량만큼 방울을 가지고 있지 마십시오. 다음 기술은 전송을 위해 사용될 수있다 : 1) 40 μL에 멀티 채널 피펫을 설정하고 45 ° 각도 &#.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
낮은 바인딩 마이크로 튜브	Costar	3207	시약 저장, 마스터 믹스 샘플 / 생산
뉴클레아제 무료 물	FisherSci	BP2484-50
TE pH 8 버퍼	FisherSci	BP2473-100
하드 쉘 96 웰 플레이트	BioRad	HSP-9601	초기 마스터 믹스 및 샘플 접종
알루미늄 밀봉 필름	BioRad	359-0133	샘플 플레이트를 밀봉하려면
액적 발생기	BioRad	186-3002
액적 생성 오일	BioRad	186-3005
카트리지	BioRad	186-4008
DG8 카트리지 홀더	BioRad	186-3051
개스킷	BioRad	186-3009
20 μ l 피펫 팁	Rainin	GP-L10F	에 대한 샘플/마스터 믹스 tansferring용
; l 피펫 팁	Rainin	GP-L200F	최종 Twin.Tec 플레이트로 액적 이송용
Twin.Tec 96 웰 플레이트	Eppendorf	951020320	최종 액적 열 순환 및 판독용
피어싱 가능한 열 밀봉 호일	BioRad	181-4040	열 순환 전 Twin.Tec 플레이트 밀봉
PX1 PCR 플레이트 씰러	BioRad	181-4000
CFX96 열순환기	BioRad	CFX96 및 C1000	열 순환기만 필요하며, 광학은 필요하지 않습니다
QX100 드롭릿 리더	BioRad	186-3001
드롭릿 리더 오일	BioRad	186-3004
드롭릿 PCR 슈퍼믹스	BioRad	186-3024	i.e. 원고의 디지털 PCR 믹스
QuantaSoft 소프트웨어(v1.3.2)Quantasoft		QX100	ddPCR 데이터 보기, 분석 및 내보내기용
Entero Forward Primer (Ent F1A)	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	대체 공급 업체 사용 가능
Entero Reverse Primer (Ent R1)	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	대체 공급 업체 사용 가능
Entero Probe (GPL813TQ)	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	대체 공급 업체를 사용할 수 있지만 플로로포어는 FAM
HF183 Forward Primer ( HF183-1)	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	대체 공급업체를 사용할 수 있습니다
HF183 Reverse Primer (BthetR1)	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	대체 공급업체를 사용할 수 있습니다
HF183 프로브(BthetP1)	Operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	대체 공급업체를 사용할 수 있지만 플로로포어는 HEX여야 합니다(VIC를 사용하는 경우 적절한 매트릭스 보상을 선택해야 합니다.
양성 대조군			E. faecalis 게놈 DNA와 HF183 표준 플라스미드의 혼합물(IDT에서 주문). 주문한 HF183 플라스미드의 E. faecalis 배양에 대한 자세한 방법은 Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008)를 참조하십시오. 실험실에서 준비한 <E. faecalis 게놈 DNA 대신 상업적으로 사용 가능한 em>Enterococcus DNA 표준물(ATCC 29212Q-FZ)도 사용할 수 있습니다.

카트리지 200 μ.