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방법 논문

펄스 레이저인가 전압에 따라 금 나노 입자 통합 사진 응답 리포좀과 그들의 마이크로 버블 공동 현상의 측정의 합성

7.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53619

⸱

2016년 2월 24일

 ,  ,  , 
1School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University, 2Division of Physics, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University, 3NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine, Nanyang Technological University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 시판중인 물질과 광 반응 형 리포좀 집적 금 나노 입자에 대한 간단한 제조 방법을 설명하는데 이용된다. 또한, 펄스 레이저의 치료에 합성 리포좀 마이크로 버블 공동화 과정을 측정하는 방법을 보여준다.

초록

광반응성 나노입자(NP)는 약물 방출에 대한 공간적, 시간적, 투여량 조절을 제공할 수 있는 잠재력 때문에 상당한 주목을 받았습니다. 그러나 대부분의 관련 기술은 아직 개발 과정에 있으며 클리닉에서 조달할 수 없습니다. 여기에서는 시판되는 금 NP와 열 반응성 리포좀을 사용하여 이러한 광 반응성 NP를 쉽게 제작하는 방법을 설명합니다. Calcein은 열/광 자극에 대한 캡슐화 효율과 방출 역학 프로파일을 평가하기 위한 모델 약물로 사용됩니다. 마지막으로, 우리는 이 광으로 유발된 방출이 수중청음기로 측정할 수 있는 미세 기포 캐비테이션으로 인한 막 파괴로 인한 것임을 보여줍니다.

서론

가능성은 극대화 특이 최소한의 부작용과, 공간 - temporal- 및 투여 량 조절 패션에 약물을 전달하는 매력적인 방법을 외부 자극이다 사용하여 약물 방출을 유발합니다. 외인성 자극 - 반응 시스템 (빛, 자기장, 초음파, 마이크로파 방사선)의 넓은 범위 중, 빛 트리거 플랫폼은 병원에서의 비 침습, 단순성 및 적응성에 의해, 매력적이다. 지난 10 년 1 광범위한 연구 그러나 이러한 근적외선 광 책임 금 플랫폼 기술의 다양성을 제공하고있다 (호주) nanocages 스마트 중합체 코팅, 약물 3 및 자기 조립 porphysome의 nanovesicles와 접합이 포토 - 불안정성 중합체 나노 입자 (NP에). (4) 이러한 기술 개발의 전임상 단계에서 정지하고, 개시하고 계속 과정에 관련된 파라미터들의 명확한 이해 및 최적화를 필요약물 방출 롤링.

이러한 시스템의 제조를위한 단순하고 용이하게 접근 방법 중 하나는 시장에서 널리 이용되고 광범위 전임상과 임상 실험에도 조사 된 둘 열 민감성 리포좀 5,6-과 금 NPS를 통합하는 것이다. 작은 동물이나 인간의 국소 전달을 위해 사용하는 경우 근적외선 활성화 금 나노 구조 (예를 들어, nanocages)에 비해 자신의 플라즈몬 파장 금 NP에의 깊은 조직 활성화의 한계에도 불구하고,이 시스템은 여전히 큰 약속을 보유하고있다. 7 빛 트리거 출시 리포좀과 금 NPS를 조합에서 일부 초기의 노력이 있습니다. 8-11 대부분이 재료의 참신에 집중하는 동안, 접근성 및 확장 성 문제를 해결해야합니다. 또한, 이러한 nanocarriers를 사용하여 분리 메커니즘에 대한 보고서는 여전히 제한되어 있습니다.

여기서의 제조 광 반응동시에 약물과 친수성의 Au NP에 탑재 리포좀이 설명되었다. 칼 세인이 캡슐화 효율 및 시스템의 방출 프로파일을 평가하기 위해 모델 화합물로서 사용된다. 또한,이 시스템에서의 Au NP에 의해 흡수되는 광은 국부 온도의 증가의 결과, 열의 형태로 주위의 미세 환경을 발산. 에어 마이크로 버블은 레이저 가열 중에 생성 된 리포좀 (도 1)의 기계적인 파괴의 원인이된다. 마이크로 버블 공동 현상의 메커니즘은 수중 청음기 측정에 의해 확인된다.

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프로토콜

1. 준비

  1. 100 ㎖ 둥근 면도 왕수 (농질산 1 부 (HNO 3), 농축 염산 (HCL) 3 부) 및 DI 물로 씻어 플라스크를 이용하여 바닥 플라스크. 플라스크를 오토 클레이브에서 15 분 동안 100 ℃에서 열풍 오븐에서 건조한다. 싸서 사용할 때까지 무균 플라스크를 저장합니다.
  2. 70 % 에탄올을 사용하는 휴대용 소형 압출기 세트 소독.
  3. 회전 증발기를 켜고 각각 37 ° C 4 ° C의 온수 욕조와 냉각탑의 온도를 설정합니다.
  4. 10 ml의 0.1 mm의 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) (PH 7.4)에 칼 세인의 374 mg을 용해하여 원액을 칼 세인 60 밀리미터를 준비합니다. 1 M 수산화 나트륨 (NaOH) 용액을 사용하여 7.4의 pH를 조정한다.

리포좀 2. 합성

  1. 지질을 제거 (1,2- Dipalmitoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 (DPPC), 1- 팔미 토일 -2- 하이드 록시 SN -glycero -3- phosphocho라인 (MPPC) 및 1,2- distearoyl- SN -glycero -3- phosphoethanol - 아민 N - [카르복시 (폴리에틸렌 글리콜) -2000 (암모늄 염) (PEG2000-DSPE))에서 냉동 (-20 ° C) 및 RT로 해동.
  2. 15.9 mg의 DPPC, 1.3 mg의 MPPC, 2.8 mg의 DSPE-PEG2000 무게. 2 ml의 클로로포름을 함께 녹여.
  3. 멸균 된 둥근 바닥 플라스크에 클로로포름 용액을 전송하고 얇은 건조한 지질 층을 형성하기 위해, 감압하에 회전 증발기를 사용하여 용매를 증발시켰다.
  4. 단계 1.4에서 50 μL의 Au NPS를 (3.36 × 1016 입자 / ㎖)를 제조 칼 세인 1.95 mL의 60 mM의 함유를 30 분 동안 2 ㎖의 수용액 45 ° C에서 지질 층 수화물.
  5. 45 ° C까지 가열 블록 예열. 필터 지지체와 200 nm의 폴리 카보네이트 멤브레인 필터를 놓고 미니 압출기 세트를 조립한다. DI 물 잠재적 인 누출을 확인합니다.
  6. 단계 2.4 extru에서 리포좀 용액 1 ㎖와 주사기 중 하나를 입력합니다조립 미니 압출기의 타단 주사기 용액을 통과하여 샘플 드. 11 번 반복합니다.
  7. 무료 금 NP에, 제조 업체의 프로토콜에 따라 용리액으로 PBS를 이용하여 지질과 칼 세인을 제거하기 위해 PD-10 탈염 칼럼을 통해 합성 된 리포좀을 실행합니다.
  8. 4 ° C에서 멸균 튜브에 샘플을 보관하고 2 일 내에 사용합니다.

난방과 리포좀 3. 칼 세인 출시

  1. 단계 2.2 DPPC, MPPC 및 DSPE-PEG2000의 몰 농도를 추가하여 원액의 지질 몰 농도를 계산합니다. 0.1 mM의 PBS 완충액 (pH 7.4)을 이용하여 5 mM의 지질 농도 리포솜 원액을 희석. 원심 분리 튜브 (2 ㎖)에 샘플을 이동.
  2. 온수 욕에서 튜브를 배치하고 25 내지 70 ℃로 서서히 승온. 여기에 1 ℃ / min의 속도로 온도를 증가시킨다.
  3. 다른 온도 점 (27, 32, 37, 39, 41 분액 (10 μL)을 모아서43, 45, 52, 57, 62, 67 및 70 ° C).
  4. RT에서 10 분 동안 리포좀을 소화하고 칼 세인의 완전한 방출을 달성하기위한 리포좀 용액을 2 % 트리톤 X-2~100 mL의 분취 량의 10 μL를 추가한다.
  5. 96 웰 마이크로 플레이트의 각 웰에 리포좀 용액 200 μl를 전송 및 형광 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 수집 된 샘플의 형광 강도를 측정한다. 칼 세인의 여기 및 방출 파장은 각각 480 및 515 나노 미터이다.
  6. 100 % 방출로 트리톤 X-100 처리 된 샘플의 형광 강도를 고려하면, 상기 식을 이용하여 각 시점에서의 calcein 백분율을 계산 :
    figure-protocol-1
    피트 주어진 시점에서 용액의 형광 강도이다. F에서 I 및 F의 X는 각각 용액의 초기 및 최종 표준화 형광 강도이다.

4. 칼 세인 다시펄스 레이저와 리포좀에서 임대

  1. 석영 큐벳에 100 ㎕의 리포좀 솔루션을 전송하고 큐벳 홀더에 넣습니다. 광원으로서 532 nm 파장에서 6 나노초의 펄스 지속 시간 : YAG 레이저를 사용하여 펄스의 Nd. 1 Hz에서 : 반복 속도 - 레이저 매개 변수를 다음과 같이 사용 레이저 에너지 밀도 : 1 엠제이 / cm 2; 빔 직경 : 0.5 mm.
  2. 광 리포좀 용액을 통과하도록 큐벳으로 평행 레이저 광을 안내하고 다양한 펄스 후에 분취 액을 수집한다.
  3. RT에서 10 분 동안 리포좀을 소화하고 칼 세인의 완전한 방출을 달성하기위한 리포좀 용액을 2 % 트리톤 X-2~100 mL의 분취 량의 10 μL를 추가한다.
  4. 칼 세인을 감안하면 빛에 민감 레이저 실험 동안 탈색 될 수있는, 미리 측정 리포솜 릴리스 데이터를 정상화 칼 세인 용액에 펄스 레이저의 표백 효과.
    1. 특히, 칼 세인 용액 (60 mM)을 펄스 레이저 위스콘신에 노출펄스 수 (0, 25, 50 및 100)를 변화시키기위한 제 1 Hz에서의 주파수. 전과 레이저 노광 후, 각각 480 및 515 나노 미터의 여기 및 발광 파장 칼 세인의 형광 강도를 측정한다.
    2. 표백의 양 (특정 펄스 수 후 칼 세인의 레이저 노광 / 형광 강도 전에 칼 세인의 형광 강도)를 계산한다. 인자 리포좀의 형광 강도를 곱하여 리포좀 샘플로부터 얻은 값을 정규화하기 위해이 비율을 사용한다.
  5. 각각 480 및 515 nm에서의 여기 및 방출 파장에서 형광 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 수집 된 샘플의 형광 강도를 측정한다.
  6. 100 % 방출로 트리톤 X-100 처리 된 샘플의 형광 강도를 고려하면, 상기 식을 이용하여 각각의 펄스 수에서의 calcein 백분율을 계산 :
    figure-protocol-2
    피트 정규화 후에 소정의 펄스 수에 용액의 형광 강도이다. F에서 I 및 F의 X는 각각 용액의 초기 및 최종 표준화 형광 강도이다.

압력 자극 5. 측정

  1. 현미경 슬라이드에 시료 100 ㎕를 놓고 샘플에 레이저의 초점을 설정합니다.
  2. 용액에 바늘 수중 청음기 (1 mm 직경 450 네바다 / 아빠 감도)를 빠져.
    주의 : 하이드로는 손상을 방지하기 위해, 레이저 광에 의해 조명 될 안된다.
  3. 다양한 펄스 수 (0 ~ 100)과 펄스 에너지 (20-160 μJ / 펄스)과 펄스 레이저와 샘플을 조사.
  4. 디지털 오실로스코프를 사용하여 압력 신호를 기록한다.

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결과

10 : 4 또는 7.95 : 리포좀 86 몰비 DPPC, MPPC 및 DSPE-PEG2000과 종래의 박막 수화 기술을 사용하여 제조 된 0.65 :. 1.39 ㎎ / ㎖ (12)의 Au NP에의 크기는 광을 결정하는 것이 중요 다음 레이저 여기 실험 기간 동안의 변환 효율을 가열. 금 NP에의 작은 크기, 더 높은 13 따라서 5 nm의 금 NP에 공급 업체에서 가장 작은 샘플, 캡슐화를 위해 선택되었다. 열 변환 효율이다. 합성 중에 수화 금 NPS를 함유 배지 및 칼 세인이어서 자유 금 및 NP에 칼 세인을 제거 사이즈 압출 및 겔 여과 크로마토 그래피를 실시 하였다 멀티 라멜라 소포를 생성시켰다.

칼 세인이 친수성 ​​형광 염료는 60 mM의 농도로 리포좀의 수성 코어 내에 캡슐화된다. C의 높은 농도에서, 형광...

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토론

박막 수화 리포좀을 제조하는 통상적 인 방법이다. 유기 용매 (여기에서는 클로로포름) 제 플라스크에 지질 박막을 생성하기 위해 37 ℃에서 회전 증발기에서 지질을 용해하는 데 사용하고 제거 하였다. 이 지질 막을 60 mM의 칼 세인 5 nm의 금 NPS를 함유하는 수용액으로 수화 하였다. 수화 과정 동안, 온도는 50 ° C의 주위를 유지하고, 플라스크를 지속적 플라스크를 회전시켜 교반 하였다. 이 단계에서의 핵심은 증발과 수분이 각각 수행 하였다되는 온도의 선택입니다. DPPC, 리포솜의 주성분의 상 전이 온도 (T m)는 41 ° C이다. 지질의 형성 필름을 생각하는 동안, 온도는 건조 된 지질의 응집 덩어리의 형성을 방지하기 위해 41 ℃ 이하이어야한다. 수화 동안 T 분보다 더 높은 온도에 인지질을 구동하기 위해 선택되었다구형 다중 층 구조로 자기 조립. 박막 수화 방법을 수행하기 쉽지만, 이것은 수용액 또는 Au NP에 칼 세인의 불량한 캡슐화 효율 (<1 %)에 의해 제...

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공개 사항

관심 없음 충돌이 선언되지 않습니다.

감사의 글

이 작품은 부분적으로 교육 싱가포르 교육부 (CX에 RG 12분의 64)과 나노 의학의 NTU - 노스 웨스턴 대학에서 1 등급 학술 연구 기금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)Avanti Polar Lipids (Alabama, US)850355P분말, -20°C에서 보관; C
1-팔미토일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린(MPPC)Avanti 극성 지질(앨라배마, 미국)855675P분말, -20°C에서 보관; C
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (암모늄 염) (DSPE-PEG2000)Avanti Polar Lipids (Alabama, US)880120P분말, -20°C에서 보관; C
금 나노 입자시그마 알드리치752568-100mL5  nm 입자, 0.1 에서 안정화됨; mM PBS
칼세인시그마 알드리치C0875-10g60  mM, pH 7.4 (NaOH를 사용하여 조정)
인산염 완충 식염수 (PBS)Sigma AldrichP54930.1 mM, pH 7.4
이중 증류수Millipore Milli-DI 정수 시스템
Triton X100   Sigma, Life SciencesX-100계산하기 위해 리포좀을 파괴하려면
   Buchi (스위스)R 210Lipososme 준비에 사용
Heating bathBuchi (스위스)B 491Lipososme 준비에 사용
진공 컨트롤러   Buchi (스위스)V-850Lipososme 준비에 사용
진공 펌프Buchi (스위스)V-700Lipososme 준비에 사용
온도 조절기가 있는 재순환 목욕PolyscienceLipososme 준비에 사용
가열 블록이 있는 미니 압출기 어셈블리 Avanti Polar Lipids (Alabama, US)610000리포좀 주사기의 압출에 사용
, 1,000 μ lAvanti Polar Lipids (Alabama, US)610017의 압출에 사용
, 200  nmWhatmann800281리포솜 필터
지원Avanti Polar Lipids (Alabama, US)610014리포솜 PD
10 탈염 쿨룸, Sephadex G-25 매체GE Healthcare, Life sciences17-0851-01리포솜 정제에 사용
원심분리기   Sigma Laboratory Centrifuges3K30리포솜 용액을 농축하는 데 사용됩니다.
RotorSigma19777-H리포솜 용액을 농축하는 데 사용됩니다 
제타사이저   Nano ZS Malvern리포솜 크기 및 제타포텐셜
UV-Visible 분광광도계ShimadzuUV-2450샘플의 흡광도를 측정하는 데 사용됩니다
광 분광광도계   분자 장치SpectraMax M5샘플의 형광 방출을 측정하는 데 사용
Nd:YAG 레이저NewWave Research532nm; 최대 출력: 17  엠제이; 너비: 406  NS초; 샘플 조사 HNR
하이드로폰ONDAHNR-10001 mm 직경 및 450 nV/Pa 감도에 사용, 적절한 작동 주파수 범위: 0.25-10  메가헤르츠; 캘리브레이션: 50  mV/바; 음향 신호를 측정하는 데 사용됩니다
Digital OsciloscopeLECORY - Wave Runner 64Xi-A주파수: 600 MHz; 최대 샘플 속도: 10  Gs/sec(2개 채널에서); 측정된 음향 신호를 기록하는 데 사용됩니다.
총 캡슐화 회전 증발 농축을 리포솜 폴리카보네이트 필터 멤브레인의 결정에 사용됩니다. . 형

참고문헌

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  15. Egerev, S., et al. Acoustic signals generated by laser-irradiated metal nanoparticles. Appl. Opt. 48 (7), C38-C45 (2009).
  16. González, M. G., Liu, X., Niessner, R., Haisch, C. Strong size-dependent photoacoustic effect on gold nanoparticles by laser-induced nanobubbles. Appl. Phys. Lett. 96, 174104(2010).

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