DamID-SEQ : 아데닌 - 메틸화 된 DNA 단편의 높은 처리량 시퀀싱에 의해 단백질 DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑

Feinan Wu; Brennan G. Olson; Jie Yao

doi:10.3791/53620

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방법 논문

DamID-SEQ : 아데닌 - 메틸화 된 DNA 단편의 높은 처리량 시퀀싱에 의해 단백질 DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑

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DOI:

10.3791/53620

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2016년 1월 27일

Feinan Wu¹ , Brennan G. Olson¹ , Jie Yao¹

¹Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine

이 논문에서

요약

우리는 높은 처리량 시퀀싱 (DamID-SEQ)에 DNA 아데닌의 메틸화 식별 (DamID)을 결합하여 여기에 분석을 설명합니다. 이 개선 된 방법은 높은 해상도와 넓은 동적 범위를 제공하며, 허용 등과 칩 서열, RNA-SEQ 같은 다른 높은 처리량 시퀀싱 데이터와 함께 DamID-서열 데이터 분석

초록

DNA 아데닌 메틸전이효소 식별(DamID) 분석은 국소 및 게놈 전체에서 단백질-DNA 상호 작용을 검출하는 강력한 방법입니다. 이는 염색질 면역침전(ChIP)에 대한 대안적인 접근법입니다. 관심 단백질과 E. coli DNA 아데닌 메틸전이효소로 구성된 발현된 융합 단백질은 단백질-DNA 상호 작용 부위 근처의 GATC 모티프에서 아데닌 염기를 메틸화할 수 있습니다. 그런 다음 아데닌 메틸화된 DNA 단편을 특이적으로 증폭하고 검출할 수 있습니다. 원래 DamID 분석은 DNA 마이크로어레이에 대한 혼성화를 통해 메틸화된 DNA 단편의 게놈 위치를 검출하며, 이는 마이크로어레이의 가용성과 미리 결정된 프로브의 밀도에 의해 제한됩니다. 본 논문에서는 고처리량 DNA 염기서열분석을 DamID(DamID-seq)에 통합하는 상세한 프로토콜에 대해 보고합니다. DamID-seq에서 생성된 많은 수의 짧은 판독을 통해 높은 정밀도와 민감도로 게놈 전체에서 단백질-DNA 상호 작용을 검출하고 국소화할 수 있습니다. 우리는 DamID-seq 분석을 사용하여 포유류 세포의 게놈-핵 층(NL) 상호 작용을 연구했으며, DamID-seq가 게놈-NL 상호 작용을 검출하는 데 있어 고해상도와 넓은 동적 범위를 제공한다는 것을 알게 되었습니다. DamID-seq 접근법을 사용하면 유전자 구조 내에서 NL 연관성을 프로빙할 수 있으며 게놈-NL 상호 작용 맵을 ChIP-seq 및 RNA-seq와 같은 다른 기능적 게놈 데이터와 비교할 수 있습니다.

서론

아데닌 DNA 메틸화 식별 (DamID) ^-1,2-는 생체 내에서 DNA 단백질 상호 작용을 검출하는 방법이며 염색질 면역 (칩) ^3로 대체 방법이다. 그것은 세포의 상대적으로 적은 양을 사용하고, DNA 또는 고도로 특이 항체와 단백질의 화학적 가교 결합을 필요로하지 않는다. 표적 단백질은 DNA 느슨하게 또는 간접적으로 연결된 경우 후자는 특히 유용하다. DamID 성공적 핵막 단백질 ^4-10, ^11-13 염색질 관련 단백질, 염색질 변형 효소 ^14, 전사 인자 및 ^15-18 공동 인자와의 RNAi 기계 ^(19)를 포함하는 단백질의 다양한 결합 부위를 매핑하는데 사용되어왔다. 이 방법은 S. 등 다양한 유기체에서 적용 할 수있다 cerevisiae의 ^13, S. pombe ^7, C. 엘레 ^9,17, D. melanogaster의 ^5,11,18,20, A. ^{(21, 22)뿐만} 아니라 마우스와 인간의 세포 라인 ^6,8,10,23,24