DamID-SEQ : 아데닌 - 메틸화 된 DNA 단편의 높은 처리량 시퀀싱에 의해 단백질 DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑

요약

우리는 높은 처리량 시퀀싱 (DamID-SEQ)에 DNA 아데닌의 메틸화 식별 (DamID)을 결합하여 여기에 분석을 설명합니다. 이 개선 된 방법은 높은 해상도와 넓은 동적 범위를 제공하며, 허용 등과 칩 서열, RNA-SEQ 같은 다른 높은 처리량 시퀀싱 데이터와 함께 DamID-서열 데이터 분석

초록

DNA 아데닌 메틸전이효소 식별(DamID) 분석은 국소 및 게놈 전체에서 단백질-DNA 상호 작용을 검출하는 강력한 방법입니다. 이는 염색질 면역침전(ChIP)에 대한 대안적인 접근법입니다. 관심 단백질과 E. coli DNA 아데닌 메틸전이효소로 구성된 발현된 융합 단백질은 단백질-DNA 상호 작용 부위 근처의 GATC 모티프에서 아데닌 염기를 메틸화할 수 있습니다. 그런 다음 아데닌 메틸화된 DNA 단편을 특이적으로 증폭하고 검출할 수 있습니다. 원래 DamID 분석은 DNA 마이크로어레이에 대한 혼성화를 통해 메틸화된 DNA 단편의 게놈 위치를 검출하며, 이는 마이크로어레이의 가용성과 미리 결정된 프로브의 밀도에 의해 제한됩니다. 본 논문에서는 고처리량 DNA 염기서열분석을 DamID(DamID-seq)에 통합하는 상세한 프로토콜에 대해 보고합니다. DamID-seq에서 생성된 많은 수의 짧은 판독을 통해 높은 정밀도와 민감도로 게놈 전체에서 단백질-DNA 상호 작용을 검출하고 국소화할 수 있습니다. 우리는 DamID-seq 분석을 사용하여 포유류 세포의 게놈-핵 층(NL) 상호 작용을 연구했으며, DamID-seq가 게놈-NL 상호 작용을 검출하는 데 있어 고해상도와 넓은 동적 범위를 제공한다는 것을 알게 되었습니다. DamID-seq 접근법을 사용하면 유전자 구조 내에서 NL 연관성을 프로빙할 수 있으며 게놈-NL 상호 작용 맵을 ChIP-seq 및 RNA-seq와 같은 다른 기능적 게놈 데이터와 비교할 수 있습니다.

서론

아데닌 DNA 메틸화 식별 (DamID) ^-1,2-는 생체 내에서 DNA 단백질 상호 작용을 검출하는 방법이며 염색질 면역 (칩) ^3로 대체 방법이다. 그것은 세포의 상대적으로 적은 양을 사용하고, DNA 또는 고도로 특이 항체와 단백질의 화학적 가교 결합을 필요로하지 않는다. 표적 단백질은 DNA 느슨하게 또는 간접적으로 연결된 경우 후자는 특히 유용하다. DamID 성공적 핵막 단백질 ^{4-10, 11-13} 염색질 관련 단백질, 염색질 변형 효소 ^14, 전사 인자 및 ^15-18 공동 인자와의 RNAi 기계 ^(19)를 포함하는 단백질의 다양한 결합 부위를 매핑하는데 사용되어왔다. 이 방법은 S. 등 다양한 유기체에서 적용 할 수있다 cerevisiae의 ^13, S. pombe ^7, C. 엘레 ^9,17, D. melanogaster의 ^5,11,18,20, A. ^{(21, 22)뿐만} 아니라 마우스와 인간의 세포 라인 ^6,8,10,23,24 장대.

DamID 분석법의 개발은 내인성 아데닌 ² 메틸화 ^결여 진핵 세포에서 아데닌 메틸화 DNA 단편의 특정 검출에 기초 하였다. 관심 E.의 DNA 결합 단백질로 이루어진 융합 단백질을 발현, 콜라이 DNA 메틸화 된 아데닌 (DAM)은 공간적 인접 (가장 크게 1킬로바이트 내의 최대 약 5킬로바이트까지)이다 게놈 ² 단백질의 결합 부위에 GATC 서열의 아데닌 염기를 메틸화 할 수있다. 개질 된 DNA 단편은 특별히 관심 ^1,25,26의 단백질의 유전자 결합 부위를 검출하는 마이크로 어레이 혼성화 및 증폭 될 수있다. 이것은 원래 DamID 방법은 마이크로 어레이의 프로브 가용성 및 소정의 밀도에 의해 제한되었다. 따라서 우리는 높은 처리량 시퀀싱을 통합 한DamID ^10이고 DamID-SEQ와 같은 방법을 지정. 짧은의 많은 수의 DamID-SEQ에서 생성 된 읽기 게놈 전체 단백질 DNA 상호 작용의 정확한 위치 파악을 할 수 있습니다. 우리는 DamID-서열이 게놈 핵 라미 (NL) 협회 ^{(10) 유학을위한} 마이크로 어레이에 의해 DamID보다 높은 해상도와 넓은 동적 범위를 한 것으로 나타났습니다. 이 개선 된 방법은 유전자 구조 ⁽¹⁰⁾ 내에 연관 NL 프로빙 수 있으며 이러한 칩 서열 및 RNA-SEQ 다른 높은 처리량 시퀀싱 데이터와의 비교를 용이하게한다.

여기에 설명 된 DamID-SEQ 프로토콜은 초기에 매핑 게놈 NL 협회 ^(10)을 위해 개발되었다. 우리는 E.에 마우스 또는 인간 라민의 B1을 테 더링하여 융합 단백질을 생성 대장균의 DNA 메틸화 된 아데닌과 C2C12 마우스 (데이터가 공개되지 않음) ^(10)과 IMR90 인간의 태아 폐 섬유 아 세포를 근육 모세포, 3T3 마우스 배아 섬유 아세포에서 프로토콜을 테스트했다. 이 프로토콜에서는, 우리는 C로 시작벡터 및 포유류 세포 onstructing ²⁴ 렌티 바이러스 감염에 의한 댐 연결형 융합 단백질을 발현. 다음으로, 우리는 아데닌 메틸화 DNA 단편을 증폭하고 다른 생물에 적용되어야 서열 라이브러리의 제조 상세한 프로토콜을 설명한다.

프로토콜

1. 생성 및 융합 단백질 및 무료 댐 단백질의 발현

1. DamID 벡터에 관심 복제 단백질.
   1. 제조 업체의 프로토콜에 따라 관심 (POI)의 단백질 원하는 높은 충실도 DNA 중합 효소를 사용하고 적절한 프라이머의 cDNA를 증폭. 실험적 인서트의 적절한 증폭을 위해 최적의 증폭​​ 조건을 결정한다.
   2. 아가 로스 젤을 실행하고 제조 업체의 프로토콜에 따라 겔 추출 키트에 의해 POI의 증폭 된 cDNA를 정화.
   3. 제조 업체의 프로토콜에 따라 BP Clonase II를 사용하여 pDONR201 벡터에 POI의 클론의 cDNA.
   4. POI 융합의 원하는 방향에 따라, 제조자의 프로토콜에 따라 LR Clonase II를 사용 pLGW-RFC1-V5-EcoDam 대상 벡터 또는 pLGW-EcoDam-V5-RFC1 대상 벡터 ^{(27)로 전자} 공여체 벡터로부터 POI의 cDNA를 복제 N 말단 또는 일 행E.의 전자 C- 말단 콜라이 DNA 메틸화 된 아데닌 (EcoDam) ^27.
   5. 복제 된 cDNA를에서 프레임 융합 EcoDam에 올바른 순서와 형태를 가지고 순서에 의해 확인합니다.
2. 렌티 바이러스 주식을 생성합니다.
   1. 렌티 바이러스 발현 시스템을 이용하여 댐-V5-POI와 (pLGW-V5-EcoDam 벡터 ²⁷⁾ V5-댐을 표현 렌티 바이러스 주식을 생성합니다. 제조 업체의 프로토콜에 따라 앞으로 형질 전환 절차를 사용하십시오.
      1. 형질에 대한 제조 업체의 프로토콜에 따라 렌티 바이러스 주식을 생성하는 293T 세포와 리포 펙을 사용합니다.
      2. 0.45 μm의 PVDF 필터 단계를 포함합니다.
3. 렌티 바이러스와 세포를 감염.
   1. 감염 (0 일) 전날, 항생제없이 동일한 성장 배지를 사용하여 6 웰 조직 배양 플레이트에이 세포의 종류에 적합한 성장 배지에서 배양 부착 세포를 전달할감염 일에 50 % 합류점을 달성한다. 37 ° C 배양기에 넣어 세포.
   2. 감염 (1 일)의 날에서 댐-V5-POI 및 V5-댐 두 렌티 바이러스 상층 액의 2 크리오 바이알 (cryovial)를 제거 -80 C의 냉동고 및 장소 ° 해동 할 수있는 37 ° C의 물을 욕조에.
      1. 세포에서 성장 미디어를 제거하고 항생제없이 신선한 성장 미디어 0.5 ㎖로 대체합니다.
      2. 각 웰 (V5-댐 2 우물과 댐-V5-POI 2 우물)에 해동 렌티 바이러스의 1 ML을 추가합니다. 나머지 2 항생제없이 성장 매체의 1 ML을 추가 우물-이 음성 대조군이 될 것입니다. 조심스럽게 혼합하고 37 ° C 배양기 O / N 다시 배치 할 6 웰 플레이트를 흔들.
   3. 감염 (2 일) 다음날은 세포에서 바이러스 현탁액을 제거하고 항생제없이 2 ml의 성장 용지로 교체합니다. 다시 48 시간 동안 37 ° C를 인큐베이터에 넣어 세포.
4. gDNA를 격리.
   1. 각 웰과 드에서 대기음 미디어250 μL 0.05 % 트립신 EDTA를 사용하여 타코미터 세포. 2 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
   2. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 각 웰에 1 ml의 성장 매체와 피펫 세포 판 떨어져 세포를 씻으십시오. RT에서 5 분 동안 200 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠렛.
   3. 실온에서 2 분 동안 200 XG에서 펠렛 500 μl의 PBS로 세포와 원심 분리기를 씻으십시오.
   4. 200 μL PBS의 펠렛 세포를 재현 탁.
   5. 제조 업체의 프로토콜에 따라 혈액 및 조직 키트에 의해 gDNA를 격리. 용출 완충액 200 μL 및 AE에서 gDNA를 분광 광도계 _{260 OD를} 측정하여 농도를 결정한다.
      참고 : gDNA를을 감염되지 않은 또는 모의 감염된 세포에서 부정적인 컨트롤로 분리 할 수​​있다. 장기 보관 용으로 gDNA를 높은 농도를 침전.
      1. 100 % 에탄올 3 권, 3 M 아세트산 나트륨 (PH 5.5)의 0.1 볼륨을 추가하고 튜브에게 4-6 번 반전 섞는다.
      2. -20 ° CO / N 스토어.
      3. 16,000 X 원심 분리기4 ℃에서 15 분 동안 G.
      4. 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 16,000 XG에 70 % (부피 / 부피) 에탄올과 원심 분리기와 펠렛을 씻으십시오.
      5. 조심스럽게 실온에서 3 분 동안 건조 공기 펠렛을 에탄올을 제거 할 수 있습니다.
      6. / μL 약 1 μg의에 T ₍₁₀₎ E _0.1 (PH 7.5)에 gDNA를 녹인다. 각 시험 물질 또는 대조군과 농도를 측정에서 gDNA를 풀. -20 ℃에서 보관하십시오.

2. 증폭 아데닌 - 메틸화 DNA 조각

1. 단지 아데닌 - 메틸화 GATCs 인하 DpnI와 다이제스트 gDNA를.
   1. 2.5 μg의 gDNA를, 1 μL 10 배 버퍼, 0.5 μL DpnI (20 U / μL)와 얼음에 반응을 설정하고 10 μL의 총 부피에 H ₂ O 채우기. 두 개의 W (0.5 μL H ₂ O와 DpnI 교체, "아니오 DpnI") DpnI없이 한 - 각 gDNA를 샘플의 경우, 세 가지 반응을 준비( "DpnI와") i 번째 DpnI.
   2. 다이제스트 O / 37 ℃에서 N, 20 분 동안 80 ° C에서 DpnI을 비활성화한다.
2. DamID 어댑터를 결찰.
   1. DamID 어댑터를 준비합니다.
      1. 100 μM의 최종 농도로 H ₂ O에 두 DamID 어댑터 올리고 ^(24)의 각각을 재현 탁.
      2. 두 DamID 어댑터 올리고 같은 부피를 결합 혼합하고 밀폐 된 튜브에 배치합니다. 파라 필름으로 튜브를 밀봉, 90 ℃에서 물이 가득 비커에 랙과 장소에 앉아있다. 튜브의 뚜껑 아래의 수위를 유지하지만 올리고 믹스의 표면 위 (튜브 들어가는 물을 방지하기 위해).
      3. 그래서 어댑터 어닐링 천천히 RT에 물이 식도록.
      4. -20 ° C에서 열처리 어댑터 (50 μM) 및 저장 나누어지는.
   2. 얼음에 반응을 설정합니다. 2.1.2 각 관에서, 6.2 μL의 H ₂ O, 2 μL 10 배 내고 버퍼, 0.8 μL 50 μm의 DamID 광고를 추가aptors (얼음 해동) 1 μL T4 DNA 리가 아제 (5 U / μL). 총 부피는 20 μL이다. . 관 "DpnI와"두 중 하나에서, 1 μL의 H ₂ O ( "아니오 리가")와 리가 아제를 교체 각 gDNA를 샘플은 두 개의 음성 대조군이 있습니다 - "아니오 DpnI"와 "아니오 리가"를.
   3. 결찰 된 O / 16 ℃에서의 N과 10 분 동안 65 ° C에서 리가 아제를 불활.
3. DpnII와 다이제스트 DNA를 메틸화 GATCs를 포함하는 조각을 파괴합니다.
   1. 얼음에 반응을 설정합니다. 2.2.3 각 관에서 24 μL의 H ₂ O, 5 ㎕의 10 배 DpnII가 버퍼 1 μL DpnII (10 U / μL)를 추가합니다. 총 부피는 50 μL이다.
   2. 2-3 시간 동안 37 ° C에서의 다이제스트와 20 분 동안 65 ° C에서 DpnII 불활.
4. 아데닌 - 메틸화 된 DNA 단편을 증폭.
   1. 2.3.2에서, 5 μ을 소화 DpnII 5 μL 얼음에 반응을 설정L 배 PCR 완충액 12.5 ㎕를 5 μM DamID PCR μL 된 10 mM의 dNTP 믹스 프라이머 ²⁴ (4), 1 ㎕의 50X 중합 효소 믹스 22.5 μL H ₂ O. 총 부피는 50 μL이다.
   2. 다음과 같이 PCR을 실행하여 68 ° C를 10 분 동안; 1 분 94 ° C, 5 분 동안 65 ℃, 15 분 동안 68 ° C; 1 분, 1 분 65 ° C, 10 분 동안 68 ° C ~ 94 ° C의 4주기; 1 분, 1 분, 2 분 68 ° C ~ 65 ° C ~ 94 ° C의 17주기.
   3. 1 % 아가 로스 겔에서 각 5 μL 반응에서 PCR 산물을 분석한다. PCR 제품은 0.2에서 2킬로바이트 (그림 2)에 이르기까지 얼룩으로 나타납니다. "아니오 DpnI"와 "아니오 리가"컨트롤이없는하거나 명확하게 적은 증폭한다.
   4. 단계 2.4.3에서 결과가 양호하면, 실험 샘플에 대한 두 개 또는 세 개의 반응 및 음성 대조군의 각각에 대한 하나의 반응 단계를 반복 2.4.1-2.4.3.
   5. 풀에서 같은 PCR 산물을 정제하고제조 업체의 프로토콜에 따라 PCR 정제 키트 또는 고체 단계 가역 고정화 (SPRI) 구슬을 사용하여 실험 샘플. "더 DpnI"또는 "아니오 리가"컨트롤을 정화하지 마십시오. 버퍼 EB와 DNA를 용출.
   6. 약 0.1 μg의 / μL 이상이어야 분광 광도계를 사용하여 OD _(260)을 측정함으로써 정제 된 DNA의 농도를 측정한다. 각 샘플 10 μg의 DNA의 최소를 수집합니다. PCR 정제 키트를 사용하는 경우, 하나의 컬럼으로 각 50 μL PCR 제품을 정화 30 μL 버퍼 EB에 용출하고 용출액을 풀.
5. DpnII와 다이제스트 DNA는 염기 서열되는 DamID PCR 프라이머를 방지합니다.
   1. 2.4.6 5 μg의 정제 된 DNA와 얼음에 반응, 5 ㎕의 10 배 DpnII 버퍼, 1 μL DpnII (10 U / μL)을 설정하고 50 μL의 총 부피에 H ₂ O 채우기. 각 샘플에 대한 두 개 또는 세 개의 반응을 준비합니다.
   2. 2-3 시간 동안 37 ° C에서 다이제스트20 분 동안 65 ° C에서 DpnII 불활.
   3. 수영장 제조 업체의 프로토콜에 따라 PCR 정제 키트 또는 SPRI 구슬 같은 시료에서 소화를 정화합니다. 버퍼 EB와 DNA를 용출.
   4. 약 0.06 μg의 / μL 이상이어야 정제 된 DNA의 농도를 측정한다. 각 샘플에 대한 6 μg의 DNA를 최소를 수집합니다. PCR 정제 키트를 사용하는 경우, 30 μL 버퍼 EB에 용출, 각 50 μL 하나의 컬럼으로 소화 정화 용출액을 풀.

높은 처리량 시퀀싱 3. 도서관 준비

1. 조각의 DNA
   1. 실험적으로 dsDNA Fragmentase의 새 배치에 대한 적절한 소화 시간을 결정합니다. 효소 활성은 시간의 경과에 따라 감소 될 수 있으므로, 새로운 실험을 수행하기 전에 테스트를 반복한다. 실제 조각화 2.5.4에서 DNA를 저장하려면, 이전 experime에서 2.4.6 또는 추가 DNA로부터 정제 된 메틸 PCR 제품을 사용이 단계에서 NTS.
      1. 6 μg의 DNA를 가진 마스터 믹스 12 μl의 10 배 Fragmentase 버퍼를 설정하고 114 μL의 총 부피에 H ₂ O 채우기.
      2. 소용돌이 3 초 동안 Fragmentase 스톡 바이알, 마스터 믹스에 6 μl를 추가하고 3 초 동안 마스터 믹스를 소용돌이. 총 부피는 120 μL이다.
      3. 분취 5 새로운 튜브 각각 마스터 믹스의 20 μL. 10 분의 증가에서 5 분 55 37 ° C에서 모두 6 튜브를 품어. 반응을 정지 5 ㎕의 0.5 M EDTA를 추가합니다.
      4. 12.5 μL 각 반응 (0.5 μg의 DNA)뿐만 아니라 아가 로스 젤에 0.5 μg의 소화되지 않은 DNA (그림 3) 소화 분석합니다. 약 0.2 킬로에 스미어의 대부분을 소화하는 데 필요한 최소한의 시간 (T의 _0.2kb)를 결정합니다. 실제 조각 평등 증분 (5 분 및 T의 _0.2kb 포함) 5 분 및 T의 _0.2kb 사이의 6 시간 지속 시간을 선택합니다.
   2. 실제 fragmen을 설정테이션으로 3.1.1.1-3.1.1.3에 설명. 3.1.1.4에서 결정된 지속 시간 37 ℃에서 반응을 배양한다.
   3. 수영장 6 반응과 PCR 정제 키트 또는 제조사의 프로토콜에 따라 SPRI 구슬 다이제스트을 정화. 51 μL 버퍼 EB에서 DNA를 용출. 최종 용출액 ~ 50 μL이다.
2. 수리는 조각난 DNA 끝
   1. 3.1.3에서 용출액을 25 μL의 H와 얼음에 반응을 설정 ₂ O, 10 ㎕의 10 mM의 ATP와 10 배 T4 DNA 리가 아제 버퍼, 4 μL 10 밀리미터의 dNTP 믹스, 5 μL T4의 DNA 중합 효소 (3 U / μL) 1 μL 클레 나우 DNA 폴리머 라 아제 (5 U / μL), 5 ㎕의 T4 폴리 뉴클레오타이드 키나제. 총 부피는 100 μL이다. 피펫과 잘 섞는다. 거품과 거품을 피하십시오.
   2. 30 분 동안 20 ° C에서 품어.
   3. PCR 정제 키트 또는 제조사의 프로토콜에 따라 SPRI 구슬 DNA를 정화. 33 μL 버퍼 EB에서 DNA를 용출. 최종 용출액 ~ 32 & #입니다181; L.
3. ""오버행 추가
   1. 3.2.3에서 용출 물과 얼음에 반응, 5 ㎕의 10 배 클레 나우 버퍼, 10 ㎕의 1 밀리미터의 dNTP, 3 μL 클레 나우 (3 '→ 5'엑소) (5 U / μL)을 설정합니다. 총 부피는 50 μL이다. 피펫과 잘 섞는다. 거품과 거품을 피하십시오.
   2. 30 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
   3. PCR 정제 키트 또는 제조사의 프로토콜에 따라 SPRI 구슬 DNA를 정화. 22 μL 버퍼 EB에서 DNA를 용출. 최종 용출액 ~ 21 μL이다.
4. 결찰 시퀀싱 어댑터
   1. 시퀀싱 어댑터 ^(28)를 준비합니다.
      1. 10 mM 트리스 - CL (PH 7.8), 0.1 mM의 EDTA (PH 8.0) 및 50 mM의 NaCl을 100 μM의 농도로 각 어댑터 올리고을 재현 탁.
      2. 유니버설 어댑터 ^(28)와 인덱스 어댑터 ^(28)의 동일한 볼륨을 섞는다.
      3. 다음으로 열 자전거 타는 사람에 어댑터를 어닐링프로그램 : 2 분 95 ° C; 30 초 95 ° C에서 시작하여 0.5 ° C 매 사이클에 의해 감소​​ 140주기; 4 ° C에서 개최.
      4. 나누어지는 어댑터 및 저장 -20 ° C에서.
   2. 3.4.1.4 2.5 μL의 T4 DNA 리가에서 (얼음 해동) 3.3.3에서 용출액 얼음에 반응, 25 μL 배 내고 버퍼, 시퀀싱 어댑터를 어닐링 1.5 μL 50 μm의를 설정합니다. 피펫과 잘 섞는다. 거품과 거품을 피하십시오. 다중화 순서가 요구되는 경우, 각 샘플에 대해 상이한 인덱싱 된 어댑터를 사용한다.
   3. 1 시간 동안 실온에서 품어.
   4. PCR 정제 키트 또는 제조사의 프로토콜에 따라 SPRI 구슬 DNA를 정화. 24 μL 버퍼 EB에서 DNA를 용출. 최종 용출액 ~ 23 μL이다.
5. DNA 단편 크기를 결정하는 단계 ^(28)를 정확하게 있도록 dsDNA에 Y 자형 어댑터 변환
   1. 3.4.4에서 용출액, 12.5 μL의 H ₂ O와 얼음에 반응을 설정1 ㎕의 25 μM 프라이머 1 ^(28), 1 ㎕의 25 μM 프라이머 2 ^(28), 1.5 μL의 10mM의 dNTP, 10 ㎕의 PCR 완충액 5 배와 1 μL의 DNA 중합 효소 (1 U / μL).
   2. 다음과 같이 PCR을 실행하여 95 ° C를 3 분 동안; 15 초, 30 초 동안 63 ° C, 30 초, 72 ° C ~ 98 ° C의 5주기; 1 분 72 ° C; 보류 4 ° C.
   3. PCR 정제 키트 또는 제조사의 프로토콜에 따라 SPRI 구슬 DNA를 정화. 11 μL 버퍼 EB에서 DNA를 용출. 최종 용출액 ~ 10 μL이다.
6. 크기는 라이브러리를 선택
   1. 1X TAE 완충액으로 2 % 아가 로스 겔을 제조. 에 티듐 브로마이드 (주의!) 500 ng를 추가 / ㎖의 최종 농도로 용해 TAE 아가 로스 용액에 티듐 브로마이드의 흡입을 피하기 위해 냉각되면. 모든 샘플의 DNA 사다리와 빈 차선에 대한 충분한 차선을해야합니다.
   2. 3.5.3에서 용출액 8 μL 6 배 로딩 염료를 추가합니다.
   <리> 1킬로바이트 플러스 1의 비율로 DNA 래더 (1.0 μg의 / μL), 6X 로딩 염료 및 H ₂ O를 혼합하여 DNA 래더 준비 : 1 : 4.
   3. DNA 래더 μL 부하 (6)에서 분리 된 레인과 인접하는 샘플 / 사다리로부터 적어도 하나의 빈 레인 3.6.2에서 샘플과 다른 6 μL의 DNA 사다리 각.
   4. 60 분 동안 120 V에서 젤을 실행합니다.
   5. UV transilluminator가에의 겔보기 (UV에 노출 시간을 최소화). 보안경과 안면 보호구를 착용 할 것. 확인 DNA 사다리 중 적어도 하나는 300 bp의 400 bp의 밴드 사이 (3 겔 조각을 절제 충분히) 적절한 간격을 잘 실행합니다. 넓은 간격이 절제 젤 조각의 볼륨을 증가하는 동안 좁은 간격은, 여러 젤 조각을 절제에 어려움을 증가시킨다.
   6. 새로운 메스 또는 각 레인에 대한 면도날을 사용합니다. 소비세 (300) 및 각 레인에서 400 bp의 사이에 세 개의 얇은 젤 조각 (그림 4)과 microcentrifuge 관에서 그들을 각각 배치합니다. 각 겔의 부피를 유지가능 (<100 μL)의 낮은 이가.
   7. 각 겔 슬라이스 (1 μL 겔은 약 1 mg의 무게)의 양을 측정 QG 버퍼 6X 볼륨을 추가하고, 50 ℃에서 배양한다.
   8. 겔 조각이 완전히 용해 될 때까지 QG - 겔 혼합물마다 2 ~ 3 분 소용돌이. 이소프로판올의 2 배 젤 볼륨을 추가하고 혼합한다.
   9. 이 단계에서, 젤 추출 키트의 프로토콜을 따르십시오. 51 μL 버퍼 EB에서 DNA를 용출. 최종 용출액 ~ 50 μL이다.
7. 시퀀싱 어댑터 수정 된 DNA 단편을 풍성
   1. ²⁹ PCR 사이클 수를 최적화한다.
      1. 3.6.10에서 1 μL 용출, 1 μL 25 μm의 프라이머 1 ^(28), 1 μL 25 μm의 프라이머 2 ^(28), 7 μL의 H ₂ O 10 μL SYBR 녹색 수퍼 믹스와 얼음에 반응을 설정합니다. 총 부피는 20 μL이다.
      2. 다음과 같이 qPCR에 실행 : 95 ° C를 3 분 동안; 30 초 동안 95 ° C의 20주기, 30 초 동안 63 ° C, 730 초 동안 2 ℃ 접시, 읽기.
      3. qPCR의 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, 제조업 자의 프로토콜을 사용하여 각 시료에 대한 정량주기 CQ () 또는 역치 사이클 (CT)을 결정한다. 최종 PCR 사이클 수 (N _PCR)으로 (다음으로 높은 정수로 반올림) Cq와 / 코네티컷 ≤ 14.이 샘플 최대 Cq와 CQ ₍₀₎ 마이너스 1 계속합니다.
      4. 다른 샘플은 PCR 사이클의 동일한 수를 실행 한 후 거의 동일한 양으로 증폭되도록 DNA 템플릿의 수량을 조절한다. 가장 높은 Cq와 CQ _(0)와 시료 8 μL 템플릿을 사용하여, 다음과 같은 식에 다른 샘플 템플릿 볼륨을 계산합니다 :
         부피 _I = 8 × 1.8 ^{Cq와 _{내가 0} -cq}
   2. 1 μL 25 μm의 프라이머 1 ^(28), 1 μL 25 μm의 프라이머 2 ^(28), 1.5 : 3.7.1.4에서 계산 된 템플릿 볼륨과 얼음에 PCR 반응을 설정μL 10 밀리미터의 dNTP, 10 μL 5 배 버퍼, 1 μL의 DNA 중합 효소 (1 U / μL) 50 μL의 총 부피에 H ₂ O 채우기.
   3. 다음과 같이 PCR을 실행하여 95 ° C를 45 초 동안; N _PCR주기는 15 초, 30 초 동안 63 ° C, 30 초, 72 ° C ~ 98 ° C의 (3.7.1.3에서 결정) 1 분 72 ° C; 보류 4 ° C.
   4. 2 % 아가 로스 겔 (도 5a)에 5 ㎕의 PCR 생성물을 분석한다. 분명 "하나의"밴드가 증폭 된 DNA 단편은 좁은 길이 범위 내에서 DNA 라이브러리는 추가 분석의 대상이 될 수 있다는 것을 나타냅니다.
   5. 선택된 샘플에 대한 하나의 반응을 반복하고 동일한 샘플로부터 증폭 된 DNA 라이브러리를 풀.
   6. 순서에 대한 선택의 DNA 라이브러리를 정화.
      1. 프라이머 / 어댑터 이량 체는 3.7.4에 표시되지 않는 경우, PCR 정제 키트 또는 제조사의 프로토콜에 따라 SPRI 구슬 DNA 라이브러리를 정화. 21 μL 버퍼 EB에서 DNA를 용출. 그만큼최종 용출액 ~ 20 μL이다. 사용자의 시퀀싱 기능이 용출 완충액 최종 부피 등의 특정의 지시가있는 경우, 그에 따라 샘플을 준비한다.
      2. 프라이머 / 어댑터 이량 체는 3.7.4에서 명확하게 볼 수 있습니다 경우 다음과 같이 라이브러리를 정화.
         1. 2 %의 프리 캐스트 아가 로스 젤에서 3.7.5에서로드 DNA와 DNA 사다리입니다. 부피를 감소 3.7.6.1에 기재된 또는 다중 웰에로드 될 수있는 샘플은 정제 될 수있다. 적절한 전력 시스템에 아가로 오스 겔을 놓습니다. 겔을 15 분 동안 실행할 수 있습니다.
         2. 적절한 transilluminator가를 사용하여 각 샘플에 대한 깨끗한 메스 / 면도기로 원하는 밴드를 잘라 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 겔 슬라이스를 배치합니다.
         3. 두 개의 수정을 제조 업체의 프로토콜에 따라 겔 추출 키트를 사용하여 DNA를 분리 : 37 ° C에서 열 믹서에 버퍼 QG - 겔 혼합물을 배양하고 30 분 동안 1,000 rpm으로, 이소프로판올의 2 배 젤 볼륨을 추가합니다.
8. . 시퀀싱 시설에 정제 된 DNA 라이브러리를 제출하는 모든 시설 지침을 따르십시오.
   주 : Bioanalyzer (도 5b)에 의한 품질 분석은 정확한 크기 범위 및 DNA 라이브러리의 농도를 결정하기 위해 이전의 시퀀스로 수행되어야한다.

결과

댐-V5-LmnB1 융합 단백질은 면역 형광 염색법에 의한 내인성 라민 B 형 단백질 (그림 1)과 협력 지역화 것으로 확인되었다.

아데닌 메틸화 DNA 단편의 성공적인 PCR 증폭 DamID-SEQ위한 중요한 단계이다. 노 또는 명확하게 덜 증폭 (그림 2)가 발생한다 (리가없이 또는 PCR 템플릿없이, DpnI없이) 음성 대조군 동안 2킬로바이트 - 실험 샘플은 0.2의 얼룩을 증폭한다.

NGS 라이브러리 소망 인서트의 크기가 200 내지 300 염기쌍에있는 동안 메틸화 된 DNA 단편을, 0.2 내지 2 KB의 범위에있다. 따라서, 적절한 크기 범위로 메틸 PCR 제품을 단편화하는 것이...

토론

Dam 태그 단백질이 내인성 단백질의 기능을 유지하는지 여부는 DamID-seq 실험 전에 검사해야 합니다. Dam 태그 핵막 단백질의 세포내 국소화는 항상 결정되어야 하며 내인성 단백질의 국소화와 비교되어야 합니다. 전사 인자를 연구하기 위해 Dam-fusion 단백질이 유전자 발현을 조절하는 내인성 단백질의 기능을 구출할 수 있는지 여부를 조사하는 것이 좋습니다. 이 기능 테스트는 내인성 DNA 결합 단백질의 녹아웃 돌연변이체를 사용할 수 있는 유기체에서 수행할 수 있습니다. 게놈 공학의 발전으로 잠재적으로 관심 있는 내인성 유전자를 녹아웃할 수 있게 되었기 때문에 배양된 포유류 세포에서 Dam 태그 DNA 결합 단백질의 기능을 조사할 수 있습니다.

이 프로토콜의 중요한 단계는 DpnII 분해된 DamID PCR 산물을 약 200bp로 성공적으로 단편화하는 것입니다. 이 단계는 증폭된 아데닌-메틸화 단편을 시퀀싱을 위해 좁은 크기 범위로 렌더링하고 시퀀싱 라이브러리에서 DN...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ViraPower 렌티바이러스 발현 시스템	Life Technologies	K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20 및 K371-20
Gateway BP Clonase II 효소 혼합	Life Technologies	11789-020
Gateway LR Clonase II 효소 혼합	Life Technologies	11791-020
DNeasy Blood & 티슈 키트 (250)	QIAGEN	69506 또는 69504
Gateway pDONR 201	Life Technologies	11798-014
293T 세포	미국형 배양 컬렉션	CRL-11268
트립신-EDTA (0.05%), 페놀 레드	Life Technologies	25300-054
DMEM, 고포도당, 피루브산	Life Technologies	11995-065
소 태아 혈청	시그마	F4135
트리스 브랜드는			중요하지 않음
EDTA			브랜드는 중요하지 않음
200 Proof EtOH			브랜드는 중요하지 않음
이소프로판올			브랜드는 중요하지 않음
아세트산			브랜드는 중요하지 않음
DpnI	New England Biolabs	R0176	은 ref
DamID 어댑터 "AdRt" 및 "AdRb"	통합 DNA 기술		염기서열과 함께 제공됩니다. 자가 결찰을 방지하기 위해 5' 또는 3' 말단의 인산화가 없습니다.
T4 DNA	Ligase Roche Life Science	10481220001	완충액
DpnII	New England Biolabs	R0543	완충액
DamID PCR 프라이머 "AdR_PCR"	통합 DNA 기술		염기서열 ref. 24
Deoxynucleotide (dNTP) 솔루션 세트	New England Biolabs	N0446	dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 100 mM
장점 2  중합효소 혼합물	클론텍	639201	완충액
1Kb Plus DNA Ladder	Life Technologies	10787018	1.0 µ와 함께 제공됩니다. g/&마이크로; l
QIAquick PCR 정제 키트 QIAGEN		28104 또는 28106
MinElute PCR 정제 키트	QIAGEN	28004 또는 28006	용리 부피 30 µ l
SPRI 구슬 / Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63880	40 µ 미만인 경우 추가 혼합 및 더 많은 용출 시간을 적용합니다. l 용출 완충액이 사용됩니다
완충액 EB	QIAGEN	19086
NEBNext dsDNA Fragmentase	New England Biolabs	M0348	완충액과 함께 제공
T4 DNA 리가제 반응 완충액	New England Biolabs	B0202
T4 DNA 중합효소	New England Biolabs	M0203
DNA 중합효소 I, 대형 (Klenow) 단편	New England Biolabs	M0210
T4 Polynuleotide Kinase	New England Biolabs	M0201
Klenow Fragment (3' → 5' exo-)	New England Biolabs	M0212
염기서열분석 어댑터	Integrated DNA Technologies		염기서열 ref. 28
Quick Ligation Kit	New England Biolabs	M2200	3.4.3에서 사용됨; Quick Ligation Reaction Buffer 및 Quick T4 DNA Ligase
sequencing primer 1 및 2	Integrated DNA Technologies		sequences available in ref. 28
KAPA HiFi PCR Kit	Kapa Biosystems	KK2101 또는 KK2102	KAPA HiFi DNA Polymerase, 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer 및 10 mM dNTP mix
agarose	Sigma Aldrich	A4679
ethidium bromide	와 함께 제공Sigma Aldrich	E1510-10ML	10 mg/ml
QIAquick Gel 추출 키트	QIAGEN	28704 또는 28706
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories	1725121 또는 1725122
분광광도계			브랜드는 중요하지 않음
0.45 μ m PVDF 필터			브랜드는 중요하지 않음
25ml Seringe			브랜드는 중요하지 않음
10cm 조직 배양 플레이트			브랜드는 중요하지 않음
6-well 조직 배양 플레이트 브랜드는			중요하지 않음
S1000 Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories		qPCR
Vortex Mixer			브랜드가 중요하지 않음
Dry Block Heater 또는 Thermomixer			브랜드가 중요하지 않음
Microcentrifuge			브랜드가 중요하지 않음
전원 공급 장치가			시스템 브랜드가 중요하지 않음
자석 스탠드			SPRI 비드를 사용한 DNA 정제용; 1.5-2 ml 튜브를 담을 수 있어야 합니다. 브랜드 중요하지 않음
UV transilluminator			브랜드 중요하지 않음
E-gel 전기영동 시스템	Life Technologies	G6400, G6500, G6512ST