방법 논문

디지털 이미지의 상관 관계를 사용하면 혈관 조직 표본의 로컬 균주의 특성을

DOI:

10.3791/53625

⸱

2016년 1월 24일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Program, University of South Carolina, 2Department of Mechanical Engineering, University of South Carolina

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 단축 인장 시험을 거친 혈관 조직 샘플의 국소 표면 변형장을 특성화하기 위해 디지털 이미지 상관관계를 사용하는 방법을 설명합니다. 이러한 측정은 샘플의 기계적 반응의 정확한 정량화와 구성적 응력-변형률 관계의 생성을 용이하게 합니다.

초록

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생물학적 및 공학적 연조직의 기계적 거동을 특성화하는 것은 기본적인 생물 의학 연구 및 제품 개발의 핵심 구성 요소입니다. 응력-변형률 관계는 일반적으로 기계적 테스트 데이터에서 얻어져 샘플 간의 비교 평가가 가능하고 경우에 따라 구성적인 기계적 특성을 식별할 수 있습니다. 그러나 변형률장의 상당한 이질성은 샘플의 기하학적 불균일성과 테스트 시스템 내에서 연조직의 장착/그립으로 인해 유도된 응력 농도로 인해 발생할 수 있으므로 평균 변형률 측정을 사용하여 오류가 발생할 수 있습니다. 변형률장 이질성이 중요한 경우, 샘플의 기계적 반응을 정확하게 평가하려면 국소 변형률을 측정해야 합니다. 이 연구는 고해상도 카메라 및 디지털 이미지 상관 기법과 결합된 기계적 테스트 장치를 사용하여 국소 표면 변형을 계산하기 위한 새로운 생체 역학 테스트 프로토콜을 보여줍니다. 일련의 샘플 표면 이미지를 획득한 다음 분석하여 증가된 단축 하중을 받은 혈관 조직 표본의 국소 표면 변형을 정량화합니다. 이 접근 방식은 실험적인 혈관 생체 역학의 정확도를 향상시킬 수 있으며 다른 천연 연조직, 공학적 연조직 및 연질 하이드로겔/고분자 재료에서 더 광범위하게 사용할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이 동영상에서는 시스템 구성 요소를 설정하고 네이티브 혈관 조직에 대한 완전한 실험을 수행하는 방법을 보여줍니다.

서론

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오십년 이상에 걸친 연구의 풍부한 역사는 혈관 조직의 기계적 특성을 정량화에 초점을 맞추고있다. 이러한 연구는 우리가 더 혈관 병리 생리 및 동작 모두 이해 효능 / 혈관 내 장치의 호환성 및 지원 설계 및 엔지니어링 혈관의 제조 1-6 구조를 평가하기위한 기초를 제공 할 수있다. 부드러운 조직과 기계적 특성의 구성적인 모델링의 기계적 응답의 정확한 측정은 본질적으로 대부분의 조직 유형에 의해 전시 된 기계적인 이질성, 이방성 및 비선형 성으로 인해 도전하고있다. 또한, 실험 측정은 종종 지역의 기계적 시험의 과정에서 샘플 그립 인터페이스를 도입 복잡성 (즉, 굴곡, 마찰, 응력 집중, 찢어) 및 조직은 살아있는 동물에서 적출되면 기계적 성질의 피할 수없는 변화에 의해 혼동된다.

단축 인장 실험은 고체 재료로 이루어진 시험편에 대해 수행 할 수있는 간단한 기계적 시험 사이이며, 종종 혈관 조직의 기계적인 반응을 평가하는 데 사용된다. 이러한 실험 결과는 모두 천연 및 조직 공학 소스에 유용한 사전 정보를 제공하고, 혈관 벽 7-11의 기계적 동작에 대해 특정 치료, 질환 상태, 또는 화합물의 약물 학적 효과를 비교하는데 사용될 수있다.

연부 조직의 단축 기계적 시험은 일반적으로 가장 일반적으로 개 뼈 또는 링 7,8,12-14 모양의 비교적 균일 한 형상으로 샘플에서 수행됩니다. 그러나 이러한 이상화 기하학에서 중요한 출발 인해 테스트 시스템 내에서 조직의 절개, 격리 및 클램핑과 관련된 문제로 발생할 수 있습니다. 기하학의 모든 비 균일 성이 궁극적으로 이기종 스트레스와 긴장을 야기 할 것이다필드는 샘플의 실제 샘플 형상에 의존 이질성뿐만 아니라, 샘플 크기 (그립에 대하여) 및 9,15,16 재료의 기계적 성질과 정도, 축 확장을 실시하는 경우. 필드 불균질성이 중요 할 때, 상대적으로 파지 위치에 기초하여 샘플 스트레인 계산은 부정확 및 기계적 행동을 평가하기위한 기초 따라서 불충분하다.

영상 분석 시스템은 널리 종종 시편 표면 (17, 18)에인가 높은 조영제 마커를 이용하여 연부 조직의 변형률 측정 용으로 사용되어왔다. 디지털 이미지의 상관 관계, 변형 전후의 시험편의 표면에 계조 강도 값을 비교하여 전체 필드 표면 변형을 측정하는 광학 측정 학적 기법, 연조직 19-21 분석 비디오와 함께 사용되어왔다. 디지털 화상 상관의 여러 가지 이점 interferometr 비교있다측정을 위해 사용될 수있는 IC 방법. 우선, 비접촉 측정 기술로서, 이는 측정 시스템에 영향을 시험편되는 방식으로 인한 재료 특성을 수정 교란 효과를 최소화한다. 둘째, 덜 엄격한 측정 환경을 필요로하고 다른 방법에 비해 감도, 해상도의 넓은 범위를 갖는다. 셋째, 시야 전체의 캡처 기능 부여,이 기술은 평균과 지방 모두 기계적 응답을 특성화 할 수있다. 방법의 자세한 설명은 독자 서튼 (22)에 의해 책을 참조하는 것이 좋습니다.

시료 표면에 변형 필드를 획득하기 위해 2 차원 디지털 화상의 상관 기법 (2D-DIC)이 사용될 수있다. 즉, 시편의 이미지는 무부하 및 다양한로드 상태에서 캡처됩니다. 첫 번째 이미지는 후속 계산을위한 메쉬를 형성하는 부분 집합 (M × M 픽셀)라는 작은 사각형으로 나누어 져 있습니다2D 변형 필드. 변형 된 시료의 각 사각형의 위치가 이미지 매칭 알고리즘을 이용하여 획득된다. 각 정사각형의 동작은 다음의 다항식 피팅 또는 유한 요소 보간을 포함하는 다양한 방법을 통해 변형 구배 및 변형을 유도하는 데 사용할 수있는 변위 필드를 수득 화상별로 화상 추적된다. 본 논문에서는 단축 인장 시험 및 2D-DIC의 통합을 통해 네이티브 혈관 조직의 표면 변형 분야의 평가를위한 상세한 방법을 제공한다.

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프로토콜

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참고 : 아래에서 설명하는 절차는 컬럼비아 사우스 캐롤라이나 대학, 사우스 캐롤라이나에서 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜의 일환으로 수행되었다.

1. 조직 수집 및 해부

  1. 조직 해부하기 전에 모든 수술 도구를 소독. 오토 클레이브 외과 가위 및 정밀 표준 집게뿐만 아니라 15 분 15 PSI의 압력과 121 ° C의 온도에서 수술 블레이드.
  2. 신선한 돼지 (7 개월 된 랜드 레이스 남성, 60-70kg) 지역 도축장에서 그대로 대동맥과 신장 한 세트를 획득. 다시 아이스 1 % 인산염 완충 식염수 (PBS) 용액에 실험실에 전송 티슈.
  3. 즉시 도착시, 수술 가위와 집게를 사용하여 주변 조직에서 복부 대동맥을 격리 할 것.
  4. PBS (PH 7.2)로 가득 50 ML의 주사기를 사용하여 용기를 세 번 씻으십시오. 가위와 집게를 사용하면, 포스만큼 혈관 주위 조직을 제거시료의 완전성을 손상시키지 않고 환되는.
  5. 세로 용기의 중간 부 상에 날카로운 면도날을 배치하고 용기 길이 방향 축에 수직 인 확인. 면도날 세 순차적 원주 인하를 적용하여 약 20 mm의 폭과 두 개의 링 샘플 각을 만듭니다.
  6. 수직 블레이드 반경 방향으로 배향되도록, 하나의 링 시료에 날카로운 면도날을 위치. 단축 기계 테스트 스트립 형태의 샘플 결과 반경 컷을 산출하기 위해 급성 힘을 적용합니다. 100mm 유리 페트리 접시에 샘플을 놓고 표면의 반점의 응용 프로그램까지 PBS에 잠수함. 제 2 링 샘플에 대해 반복합니다.

표면 스페 클 패턴 2. 창조

  1. 압력 밸브에 에어 브러쉬를 연결합니다.
  2. 노즐 직경의 노즐 60 ~ 100 μm의의 얼룩을 산출 할 수있는 에어 브러쉬의 직경 (적절한 범위를 조정해야) 예비 연구로부터 결정될.
  3. 에어 브러쉬의 중력 공급기에 검은 조직 마킹 염료의 약 2 ml에 붓고.
  4. 약 0.5 미터 떨어진 샘플에서 에어 브러쉬를 놓습니다.
  5. 페트리 접시에서 샘플을 제거합니다. PSI (100)의 분사 압력하에 약 5 초 동안 샘플의 내막 조직 표면에 마킹 염료 스프레이. 스페 클 패턴이 균일하게 시료 표면을 커버하도록 세 번 반복합니다.

실험 3. 성능

  1. 조직 접착제를 사용하여 플라스틱 스트립 (1cm 폭 X 1cm 길이 X 0.5 cm 두께)에 샘플의 양 끝을 연결합니다. 조직 커팅 보드에 샘플을 놓습니다. 이 평평하도록 샘플을 놓고 디지털 캘리퍼스를 사용하여 치수를 측정한다.
  2. 기계적 시험에 대한 시스템 제어를 시작합니다. 시스템이 홈 화면을 제어에서 "설정"탭에있는 작업 표시 줄의 "파형"를 선택합니다.
  3. 광고-4 mm (시스템에 지정된 초기 위치에 대하여 4mm 연장)에 기계적 시험기의 상부 그립 바로 위치. 조심스럽게 기계 테스터의 상부 그립에 한 플라스틱 스트립 (3.1 시편에 부착) 확보 및 샘플 자유롭게 중지 할 수 있습니다. 샘플 및 상부 그립 사이의 거리가 2mm 미만인되도록 디지털 캘리퍼를 사용한다.
  4. 샘플의 자유 단을 연장하지 않고 확보 할 수 있도록 수동 하부 그립의 위치를​​ 조정한다. 부드럽게 기계적 시험기의 하부 그립으로 샘플의 자유 단에 부착 된 플라스틱 스트립을 고정.
    1. 샘플 및 하부 그립 사이의 거리가 2mm 미만인되도록 디지털 캘리퍼를 사용한다. 시스템 로드셀 제로. 시료의 길이를 측정하고 글로벌 원주 균주의 계산을위한 기준 길이로 사용.
  5. 기계적 시험 프로토콜을 입력합니다. t에 사용되는 프로토콜그의 데모 0.01 mm / sec의 속도로 변위 18 % 시료 길이를 확장 4 축 변위 사이클을 수반한다.
  6. 일시적으로는 수화 유지하기 위해 나머지 시험 프로토콜을 통해 샘플에 PBS 스프레이.
  7. 로딩 프레임으로부터 1.5 m 위치된다 삼각대에 카메라 (5 메가 픽셀 카메라, 100mm 렌즈, 3.49 ㎛의 화소 크기) 마운트. 카메라와 시료 표면 깊이의 가장 낮은 필드에 카메라를 설정하고보기의 전체 필드에 포커스가되도록의 정렬을 조작하여 수직 확인합니다.
  8. 촬상 소프트웨어를 연다.
  9. 옵션 "을 선택 시스템"에서 "PGR-2"를 선택합니다.
  10. 이미지를 저장할 수있는 프로젝트 경로를 선택 분석합니다.
  11. "타임 스퀘어"아이콘을 클릭하고 5 초로 획득 간격을 지정합니다.
  12. 샘플의 명확도를 얻을 수 있도록 렌즈의 노출, 개구 수 및 초점을 조절.
  13. 샘플에 적절한 조명을 제공하는 LED의 위치를​​ 조정합니다.
  14. 시료 표면의 화상을 얻을 촬상 소프트웨어에서 "시작"아이콘을 클릭.
  15. 이미지 분석 소프트웨어를 엽니 다.
  16. 획득 된 이미지를 가져옵니다. 개인 반점을 확대 한 다음이 개인 반점에서 픽셀 수를 계산합니다.
    참고 : 대표 검은 반점을 확인합니다. 유사한 높은 값을 갖는 스페 클 양쪽 픽셀 사이의 직선 거리로 스펙 클 크기를 정의. 허용되는 스페 클의 크기, 전형적인 스펙 클의 폭 방향의 픽셀 수는 3 픽셀보다 커야한다. 가능하면 측정의 공간 해상도를 향상시키기 위해, 대부분의 얼룩은 스펙 클의 폭을 가로 질러 더 이상 5-7 화소를 가져야한다. 따라서,이 경우의 일반적인 반점 사이 10 μm의 작은에서 23 μm의 선형 치수에서 가장 큰에서 범위 것입니다. 적절한 부분 집합을 확인하려면크기, 일반적인 서브 세트는 그 폭에 걸쳐 적어도 흰색 3과 3 검은 얼룩을 가져야한다. 전형적인 스펙 클 선형 치수 5 픽셀이면, 각 서브 세트는 선형 31x31 사이즈가 적어도 105 μm의 것이다. 서브 세트의 중심 간 간격은 선형 치수의 1/6 이상이어야한다. 따라서 31x31 서브 세트 크기, 거리는 직선 거리로 18 μm의 픽셀을 나타내는 5이다.
  17. 스페 클 패턴의 품질을 확인한 후, 동시에 테스트를 시작하는 이미지 캡처 소프트웨어에서 시스템의 "실행"아이콘 "시작"아이콘을 클릭합니다.
  18. 카메라와 촬상 소프트웨어를 사용하여 시험에 걸쳐 일련의 이미지를 캡쳐.

실험 후 4. 정리 절차

  1. 생물 학적 가방에 폐기 샘플을 놓고 가방을 닫습니다. 적절한 처리를 위해 사우스 캐롤라이나 대학의 환경 보건 및 안전 (EHS)의 부서를 호출합니다.
  2. 인산염을 준비증류수에 세제 살균제의 1:64 희석 비율을 무료로 소독액. 20 분 동안이 솔루션에 수술 도구를 만끽 해보세요.
  3. 충분히 증류수 4.2에 설명 된 항목을 헹군다. 종이 타월을 이용하여 툴을 건조 후 70 % 에탄올 용액으로 스프레이 그들. 다시 종이 타월을 사용하여 수술 도구를 건조 및 수술 도구 상자에 다시 넣어.

로컬 스트레인 필드를 측정 5. 이미지 분석

  1. 이미지 분석 소프트웨어를 엽니 다.
  2. 분석 할 필요가있는 모든 이미지를 선택, "얼룩 이미지"탭을 클릭합니다.
  3. 사각형 도구를 클릭하고 첫 번째 이미지에 대한 관심의 영역을 선택합니다.
  4. 일부 크기 41 × 41 픽셀과 스텝 크기 5 픽셀 입력합니다.
  5. 소프트웨어에서 분석 탭을 시작을 클릭 최적화 된 8 트랩으로 보간을 선택; 가우스와 같은 옵션 제로 정규화 제곱 차이와 일부의 무게와 같은 기준을 선택합니다.
  6. 소프트웨어의 기본값으로 임계 값 옵션을 설정합니다.
  7. 시작 분석 탭의 후 처리 하위 탭을 클릭합니다. 옵션 변형 계산을 클릭하고 필터의 크기와 소프트웨어에 기본적으로 필터의 유형을 둡니다. 선택 텐서는 라그랑주을 입력합니다.
  8. 데이터 탭을 선택하고 표면 변형 필드의 시각화에 대한 모든 분석 이미지를 선택합니다.

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결과

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혈관 조직에 경 사진 축 확장 시험에서 취득한 기계 데이터는 주어진 변위 속도로 적용 샘플 변위 관계 대 부하로 구성되어 있습니다. 본 연구에서는 축성 기계적 시험과 함께, 2D-DIC 다양한 변형 상태에서 직교하는 방향에서 시료의 표면 변형 필드를 측정하기 위해 사용된다. 혈관 조직의 점탄성 특성은 기계적 전처리 이전의 하중 - 변위 곡선 이력의 주목할만한 정도에 명시되어있다. 히스테리시스가 점진적으로 (그림 1)이 감소되는 것을 특징으로하는 기계적 시험의 재현성을 촉진하고 탄성 기계적인 반응을 얻으려면 조직은 여러 하역주기를 통해 미리 조정된다. 대단히 조심 샘플 준비 및 설치에도 불구하고, 2D-DIC 측정 얻어진 내막 표면 변형 장 모두에서 매우 불균일 함을 입증 원주와 길이 방향. 예상 한 바와 같이, 로컬 원주 변형률 값은 적용된 샘플 변위 증가. 원주 변형 패턴은 일반적으로 이질성 샘플 그립 계면 부근에 비해 샘플의 중심에서 ...

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토론

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이전의 연구는 샘플 18,20,21,23,24 균주를 평가 염료 비디오 추적 방법의 넓은 범위를 사용하였으나, 우리의 목표는 본 평가 용 2D-DIC와 커플 일축 인장 시험에 포괄적 인 방법을 제공하는 것이다 혈관 조직 샘플의 표면 변형. 샘플 축성 로딩이 일어나 고해상도 카메라와 실내 이미지 분석 소프트웨어를 변형 필드는 소정의 표면 영역 내에 측정 할 수있다. 혈관 조직의 기계적 시험에 특히 관련성, 제시된 기술은 직접 다시 구성적인 재료 특성의 식별을 가능하게 평면 이중 축 시험에서 표면 변형을 평가하기 위해 적용 할 수 있습니다.

디지털 화상 상관 분석을 용이하게하기 위하여, 스펙 클 패턴은 샘플 표면에 적용된다. 반점을 위해 이용 페인트는 쉽게 대부분의 연부 조직 표면에 부착 조직 표시 염료입니다. 을 달성하기 위해콘트라스트 양질 및 스펙 클 패턴, 60-100 ㎛, 최적 반점 크기의 적절한 밀도는 0.5 m의 거리가 분무 에어 브러쉬의 노즐 직경...

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공개 사항

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저자는 관심의 잠재적 인 충돌이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

소프트웨어 및 기술 지원은 상관 솔루션 통합 (www.correlatedsolutions.com)의 호의였다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
단축 인장 기계 테스터Enduratec3230 AT/HR
블루 티슈 마킹 염료http://www.ebay.com/itm/Tissue-Marking-Dye-in-Bottles-2oz-Bottle-1-ea-/201193551510?pt=LH_DefaultDomain_0&hash=item2ed811f696
분무기Anest-iwataCM-B사용자 정의 미크론 B
카메라포인트 그레이GS2-GE-50S5M-C
렌즈TokinaAT-X M100
혈관 조직Caughman Inc
0.9% 염화나트륨 주사 PBSBAXTER HEALTHCARE CORP.
Vic_snap상관 솔루션
Vic_2D상관 솔루션
Wintest 4.1Bose ElectroForce
조직 접착제  3M 베트본드 1469SB
소독제 Fisher Scientific04-355-13Decon BDD Bacdown 세제 소독제

참고문헌

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