이 프로토콜은 영양이 풍부한 배지에서 마우스 피부의 효소 분해 후 백혈구를 분리하기 위한 구배 분리를 설명합니다. 이렇게 파생된 세포는 다양한 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 이것은 조직 해리 기계와 더 가혹한 트립신 및 디스파제 기반 조직 소화 프로토콜에 대한 효과적이고 경제적이며 개선된 대안입니다.
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이 논문에서
요약
초록
쥐 피부를 단일 세포 현탁액으로 해리하는 것은 피부 염증의 설치류 모델에서 침투하는 면역 세포의 특성화와 같은 다운스트림 세포 분석에 필수적입니다. 여기에서는 콜라겐분해효소 D를 사용하여 영양이 풍부한 용액에서 마우스 피부를 소화한 다음 불연속 밀도 구배를 사용하여 조혈 세포를 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이렇게 얻은 세포는 in vitro 연구, in vivo transfer 및 유세포 분석을 포함한 기타 다운스트림 세포 및 분자 분석에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 표현형 특성화 또는 세포 기능과 관련된 표면 단백질의 밀도 또는 세포 생존력을 손상시킬 수 있는 고가의 기계적 해리기, 특수 분리 컬럼, 더 가혹한 트립신 및 디스파제 기반 분해 방법에 대한 효과적이고 경제적인 대안입니다. 당사의 대표 데이터에서 볼 수 있듯이, 이 프로토콜은 생존 가능성이 높은 세포를 생성하고, 특정 면역 세포 subset을 포함하며, 유세포 분석에 사용되는 공통 표면 마커 단백질의 무결성에 영향을 미치지 않았습니다.
서론
접촉 성 피부염, 습진, 건선, 봉와직염, 비 흑색 종 피부암에 곰팡이 감염 및 농양에 이르기까지 피부 상태는 전세계 50 가장 널리 퍼진 질병들로 발견되었고 2010 1 치명적 질병의 네 번째 선도적 인 글로벌 원인. 따라서, 다양한 피부 병변을 기본 분자 및 세포 메커니즘의 조사 연구에 필요한 활성 영역입니다. 설치류 모델은 아토피 성 피부염 (2), (3), 건선, 또는 포도상 구균 감염 4 같은 염증성 피부 질환의 이해에 도움이 현저하게되어왔다. 마우스 피부 조직의 효소 적 소화, 저렴하고 효율적이며 간단한 프로토콜 나은 피부 질환의 병태 생리를 이해 하류 다양한 용도에 사용할 수있는 세포의 제제를 제공 할 수있다. 여기서, 간단하고 경제적 인 방법은 마우스 피부 효소에 대해 기재되어 다이제스트조직 및 세포 배양, 생체 대체 전송에 사용할 수있는 피부 침투 백혈구의 분리, 유세포 분석 및 분류 또는 유전자 발현 연구를 흐른다. 이 절차의 목적은 통상적으로 전체적인 맞춤 시약 키트 및 기계적 dissociators와 연관된 비용을 최소화하면서 높은 세포 생존율과 피부 백혈구 침윤의 단일 세포 현탁액을 제조하는 공정이다.
기존....
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프로토콜
주 : 통상적으로 음식과 물을 무료로 이용할 수와 보관 8~12주 세 여자 ND4 스위스 웹스터 마우스는, 이러한 연구에 사용 하였다 (B13S1)에 사용되는 실험 프로토콜은 매 켈리 스터 대학교의 IACUC에 의해 승인되었다..
옥사 졸론 1. 과민성 및 도전
- 날 0
- 4 L 뚜껑 유리 항아리의 하단에 메쉬 아래에 배치 흡수성 수건에 3 ㎖ 이소 플루 란을 추가하여 마취 챔버를 준비합니다. 피사체가 충분히 마취 때까지 여기에서 사용 ND4 암컷 마우스를 들어, 챔버 내의 시간은 30 ~ 60 초이고; 마우스 변형이 사용을위한 마취 관리를 최적화 할 수 있습니다.
- 각 마취 마우스의 뒷면을 면도하고 동물 머리 트리머를 사용하여 측면에.
- 1 일
- 무수 에탄올로 -4-에 톡시 -2- 페닐 -2- 옥사 졸린 -5- 온 (옥스)의 2 % 용액을 제조하고, 인큐베이터에서 회전판에 15 분 동안 50 ℃에서 배양한다.
- 간단히 마취1.1.1에서 설명하고 약 20 μL 각의 여러 직렬 응용 프로그램에서 다시 면도 2 % 황소의 100 μl를 적용 할 이소 플루 란 마취를 사용하여 마우스. 건조 할 수있는 솔루션을 직렬 응용 프로그램 사이에 5 ~ 10 초를 ....
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결과
콜라게나 D 미디어 처리 대조군과 비교시 비장 세포는 T 세포상의 CD4 및 CD8 α 비슷한 수준의 치료를 보여
먼저, T 세포의 서브 세트에 리니지 및 활성화 마커의 주파수 및 풍부 표면에 콜라게나 D의 잠재적 효과는 대조군으로 차 림프 조직을 사용하여 평가 하였다. 비장 세포 현탁액 ND4 마우스로부터 얻어진 HBSS 미디어와 함께 1 시간 동안 세척 하였다. (위의 섹션 4에 기술 된 바와 같이) 다음에, 반 세포 / ㎖의 콜라게나 D 0.7 mg의 실시. 잔여 세포를 HBSS 제어 매질에 재현 탁 하였다. 이어서, 비장 세포 모두 분획 섹션 5에서 전술 한 바와 같이 밀도 구배 원심 분리를 사용하여 처리 하였.......
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토론
이러한 아토피 성 피부염이나 건선과 같은 피부 질환의 설치류 모델에서 피부에 상주하는 백혈구의 변화를 특성화하는 염증 세포의 유입과 질병 병리 사이의 기계적 연결을 이해하는데 중요하다. 여기에서 우리는 대부분의 생물 의학 연구 실험실에서 발견되는 기본 장비로 피부 조직에서 백혈구를 분리하는 경제적 인 방법을 설명합니다. 이 상대적으로 빠른 기술은 실험실 벤치에서 시간에 손을-최소화하면서 자원을 보존하는 데 도움 비싼 조직 해리 기계 및 사용자 정의 튜브 및 시약의 사용을 방지 할 수 있습니다. 부드러운 효소 소화 및 불연속 구배 분리는 상피 세포와 파편, 및 분리 된 세포의 대부분은 유세포 분석, 세포 분류, 전송, 세포 배양 물 및 생체 외 자극 분석법에 포함 하류 다양한 용도에 사용될 수 제거. 콜라게나 제 효소와 D 다이제스트 T 세포 표면 마커 무결성 및 preser에 영향을주지VES의 세포 생존. 이 프로토콜은 쉽게 측면 이외의 영역들로부터 피부를 처리하기 위해 수정 될 수있다.
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공개 사항
저자는 공개 재정적 또는 기타 관심 회원이 없습니다.
감사의 글
국립 보건원 (DC에 NIH R15 NS067536-01A1), 국립 Vulvodynia 협회 (DC에 수상), 그리고 매 켈리 스터 대학교는이 작업을 지원했다. 인증 기관은 아놀드와 로벨 베크 재단 자금 매 켈리 스터 대학교 베크 학자 프로그램에서 교제를 받았다. BTF 및 TM은 JDRF 2-2011-662 지원합니다. 우리는 기술적 조언 박사 제이슨 Schenkel 박사 줄리아 루이스 감사, 그들의 도움과 지원에 대한 Chatterjea 랩의 모든 현재의 전 멤버.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 페놀이 적색, 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 액체 | Sigma Aldrich | 55021C | 사용하는 날까지 멸균 상태를 유지하십시오. |
| 헤페스, ≥ 99.5% (적정) | Sigma Aldrich | H3375 | |
| EDTA 디소듐 염 용액 | Sigma Aldrich | E7889 | 사용하는 날까지 멸균 상태를 유지하십시오. |
| 소 태아 혈청, USDA, 열 비활성화, 프리미엄 셀렉트 | MidSci | S01520HI | 사용하는 날까지 멸균 상태를 유지하십시오. |
| Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C; C) | Sigma Aldrich | P1644 | 멸균 상태를 유지하십시오. Percoll은 사용하기 전에 멸균 10X PBS로 등장 음으로 만들어야합니다. |
| 트리머 콤보 키트 | Kent Scientific | CL9990-1201 | 더 큰 트리머를 사용하여 옆구리와 등을 면도하십시오. |
| 4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one | Sigma Aldrich | E0753-10G | 50°C에서 100% EtOH에 용해됩니다. C를 회전판에서 15분 동안 누릅니다. |
| 정제된 안티 마우스 CD16/CD32 (2.4G2) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | 유세포 분석을 위한 항체 염색 중 비특이적 항체 결합을 차단하는 데 사용되는 항체 |
| anti-CD3ε-BV650 (145-2C11) | Becton Dickinson | 564378 | 유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체 |
| anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) | eBioscience | 47-0042-80 | 유동 세포를 염색하는 데 사용되는 항체 cytometry |
| anti-CD8α-BV785 (53-6.7) | BioLegend | 100749 | 유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체 |
| anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) | eBioscience | 48-0112-80 | 유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체 |
| anti-CD11c-eFluor450 (N418) | eBioscience | 48-0114-80 | 유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체 |
| anti-CD44-BV711 (IM7) | Becton Dickinson | 563971 | 유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체 |
| anti-CD45-FITC (30-F11) | Tonbo Biosciences | 35-0451-U025 | 유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체 |
| anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) | eBioscience | 48-0452-80 | 유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체 |
| anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) | BioLegend | 104431 | 유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체 |
| anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) | BioLegend | 108407 | 유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체 |
| Ghost Dye-BV510 | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | 유세포 분석을 위한 생존 염료 |
| LSR Fortessa | Becton Dickinson | N/A | 세포 분석기(18개 파라미터) |
| 클로스트리듐의 콜라겐분해효소 D histolyticum | Roche Applied Science | 11088858001 | 분취 액 건조 효소를 HBSS에서 페놀 레드, 칼슘 없음, 마그네슘 없이 1mL 분취액으로 만듭니다. -20°C에서 즉시 보관하십시오. C는 최대 6개월 동안 사용할 수 있습니다. |
| ND4 스위스 암컷 마우스 | Harlan | 0-32 | 8-12 주; 전통적으로 음식과 물을 무료로 이용할 수 있도록 수용되었으며 Macalester College의 IACUC 지침에 따라 사용됩니다. |
참고문헌
- Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).
- Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K.
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