방법 논문

효소 다이제스트 및 그라데이션 분리를 사용하여 마우스 피부에서 침투 백혈구의 분리

DOI:

10.3791/53638

⸱

2016년 1월 25일

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Macalester College, 2Department of Medicine, Division of Rheumatic and Autoimmune Diseases, Center for Immunology, University of Minnesota

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 영양이 풍부한 배지에서 마우스 피부의 효소 분해 후 백혈구를 분리하기 위한 구배 분리를 설명합니다. 이렇게 파생된 세포는 다양한 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 이것은 조직 해리 기계와 더 가혹한 트립신 및 디스파제 기반 조직 소화 프로토콜에 대한 효과적이고 경제적이며 개선된 대안입니다.

초록

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쥐 피부를 단일 세포 현탁액으로 해리하는 것은 피부 염증의 설치류 모델에서 침투하는 면역 세포의 특성화와 같은 다운스트림 세포 분석에 필수적입니다. 여기에서는 콜라겐분해효소 D를 사용하여 영양이 풍부한 용액에서 마우스 피부를 소화한 다음 불연속 밀도 구배를 사용하여 조혈 세포를 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이렇게 얻은 세포는 in vitro 연구, in vivo transfer 및 유세포 분석을 포함한 기타 다운스트림 세포 및 분자 분석에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 표현형 특성화 또는 세포 기능과 관련된 표면 단백질의 밀도 또는 세포 생존력을 손상시킬 수 있는 고가의 기계적 해리기, 특수 분리 컬럼, 더 가혹한 트립신 및 디스파제 기반 분해 방법에 대한 효과적이고 경제적인 대안입니다. 당사의 대표 데이터에서 볼 수 있듯이, 이 프로토콜은 생존 가능성이 높은 세포를 생성하고, 특정 면역 세포 subset을 포함하며, 유세포 분석에 사용되는 공통 표면 마커 단백질의 무결성에 영향을 미치지 않았습니다.

서론

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접촉 성 피부염, 습진, 건선, 봉와직염, 비 흑색 종 피부암에 곰팡이 감염 및 농양에 이르기까지 피부 상태는 전세계 50 가장 널리 퍼진 질병들로 발견되었고 2010 1 치명적 질병의 네 번째 선도적 인 글로벌 원인. 따라서, 다양한 피부 병변을 기본 분자 및 세포 메커니즘의 조사 연구에 필요한 활성 영역입니다. 설치류 모델은 아토피 성 피부염 (2), (3), 건선, 또는 포도상 구균 감염 4 같은 염증성 피부 질환의 이해에 도움이 현저하게되어왔다. 마우스 피부 조직의 효소 적 소화, 저렴하고 효율적이며 간단한 프로토콜 나은 피부 질환의 병태 생리를 이해 하류 다양한 용도에 사용할 수있는 세포의 제제를 제공 할 수있다. 여기서, 간단하고 경제적 인 방법은 마우스 피부 효소에 대해 기재되어 다이제스트조직 및 세포 배양, 생체 대체 전송에 사용할 수있는 피부 침투 백혈구의 분리, 유세포 분석 및 분류 또는 유전자 발현 연구를 흐른다. 이 절차의 목적은 통상적으로 전체적인 맞춤 시약 키트 및 기계적 dissociators와 연관된 비용을 최소화하면서 높은 세포 생존율과 피부 백혈구 침윤의 단일 세포 현탁액을 제조하는 공정이다.

기존의 피부 조직 해리 방법 5-7 낮은 세포 생존 및 표면 마커의 무결성 결과, 또는 사용자 정의 효소 키트와 고가의 조직 해리 기계 8-11 필요할 수 있습니다. 마우스 귀 피부 조직의 소화가 합리적으로, 12 ~ 13 유행 높은 각화 피부 조직을 소화하는 동안 (예를 들면 측면에서) 비 세포 파편 많은 양의 오염 된 세포 준비가 발생할 수 있습니다. 최근의 연구에서, 자이드와 동료가 2.5 mg을 90 분 동안 마우스 측면 피부를 소화 / ㎖ 디스 파제, FOLLO3 ㎎ / ㎖의 콜라게나 제 (7)에 의해 45 분 결혼. 또 다른 연구에서, 이들 연구자들은 트립신 / EDTA, 콜라겐 III의 사용을 포함하는, 2.5 시간의 조합으로 여러 소화 배양을 사용하고, (5) 디스 파제. 다른 제조업체의 트립신으로 처리 잴 포유 동물 세포에서 14-15 세포 표면 단백질의 무결성에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다 트립신의 사용은 피부 효소 소화에 권장되지 않는다. 또한, 디스 파제는 CD4 및 CD8α T 세포의 증식 능력에 심각한 영향을 미칠 수 및 CD62L (16)와 같은 일반적인 T 세포 활성화 마커를 포함, 최소 20 분자의 표면 풍요 로움에 영향을 미칩니다. 다른 프로토콜은 소화 매체 (6)에 RPMI 1640을 사용합니다. 그러나, RPMI에 Mg2 +, Ca2 + 등의 존재는 광범위한 세포 응집 (17)가 발생할 수있다.

조직 분리를위한 이상적인 프로토콜은 높은 세포 생존 능력, 낮은 목표로한다세포 응집, 최소한의 손상의 수준은 표면 단백질을 세포합니다. 고품질 림프절 간질 세포 제제는 짧은 효소 배양, 칼슘 및 마그네슘이없는 배지 2+ 프로토콜을 사용하여 수행하고, 트립신을 피하고 18 디스 파제되었다. 그러나, 이러한 유형의 프로토콜은 전체 마우스 피부의 해리에 대해 확립되지 않았다.

여기에서, 프로토콜은, 해리 분리 및 알레르겐 - 도전 마우스 옆구리 피부에서 피부 백혈구 침윤을 풍부하게 기재되어있다. 간략하게, 절제된 피부 소화 조직을 연화 초과 각질이나 지방 조직을 제거하기 위해 1 시간 동안 10 % 소 태아 혈청 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)로 미리 배양된다. 이것은 0.7 mg을 함께 30 분간 효소 분해 단계 뒤에 / ㎖의 콜라게나 D. 콜라게나 D 그것을 만드는 최소 세포 표면 마커의 농도에 대한 영향, 및 시험관 (16, 18)에서 T 세포 증식에는 영향을주지표면 단백질의 특성을 포함하는 애플리케이션에 매우 적합하다. 효소 분해 후, 불연속 밀도 구배 원심 분리는 단일 세포 현탁액으로부터 상피 세포 및 잔해를 제거하고, 조혈 세포 농축 하였다. 중요한 것은,이 절차는 비싼 열 기반 자기 세포 분리 시약 및 티슈 기계 8-11 해리를 방지하고 기본 생의학 연구소에 위치한 재료 및 장비로 수행 될 수있다. 여기에서이 프로토콜 (19 각색) 이전에 감응 ND4 스위스 쥐 합텐 옥사 졸론 (황소)와 측면 피부에서 도전 세번 백혈구를 분리하는데 사용 하였다. 세포는 파라 메트릭 멀티 - 유동 세포 계측법을 사용하여 분석 하였다. 이 기술은 최소한의 파편과 계측법 영향 SK에 T 림프구와 호중구의 침윤을 측정하기 위해 파라 메트릭 다중 흐름으로 분석 하였다 격리 림프구의> 95 %의 생존율을 가진 세포 현탁액을 수득에서.

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프로토콜

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주 : 통상적으로 음식과 물을 무료로 이용할 수와 보관 8~12주 세 여자 ND4 스위스 웹스터 마우스는, 이러한 연구에 사용 하였다 (B13S1)에 사용되는 실험 프로토콜은 매 켈리 스터 대학교의 IACUC에 의해 승인되었다..

옥사 졸론 1. 과민성 및 도전

  1. 날 0
    1. 4 L 뚜껑 유리 항아리의 하단에 메쉬 아래에 배치 흡수성 수건에 3 ㎖ 이소 플루 란을 추가하여 마취 챔버를 준비합니다. 피사체가 충분히 마취 때까지 여기에서 사용 ND4 암컷 마우스를 들어, 챔버 내의 시간은 30 ~ 60 초이고; 마우스 변형이 사용을위한 마취 관리를 최적화 할 수 있습니다.
    2. 각 마취 마우스의 뒷면을 면도하고 동물 머리 트리머를 사용하여 측면에.
  2. 1 일
    1. 무수 에탄올로 -4-에 톡시 -2- 페닐 -2- 옥사 졸린 -5- 온 (옥스)의 2 % 용액을 제조하고, 인큐베이터에서 회전판에 15 분 동안 50 ℃에서 배양한다.
    2. 간단히 마취1.1.1에서 설명하고 약 20 μL 각의 여러 직렬 응용 프로그램에서 다시 면도 2 % 황소의 100 μl를 적용 할 이소 플루 란 마취를 사용하여 마우스. 건조 할 수있는 솔루션을 직렬 응용 프로그램 사이에 5 ~ 10 초를 기다립니다.
    3. 다시 이외의 지역에 2 % 황소 솔루션을 유출 방지 및 응용 프로그램 사이에 건조 할 수있는 솔루션을 기다려야주의하십시오.
  3. 일 5-7
    1. 절대 에탄올 (황소)의 1 % 용액을 제조하고, 인큐베이터에서 회전판에 15 분 동안 50 ℃에서 배양한다.
    2. 부드럽지만 확실히 위를 향하도록 복부와 목, 꼬리베이스의 목덜미에 마우스를 고정하고 목은 약간 (복강 내 주사에 대한 파악과 유사) 아래로 기울어 여러 직렬 응용 프로그램에서 면도 측면에 1 % 황소의 100 μl를 적용 상술 한 바와 같이 시간을 복용 후 피부를 건조.
    3. 대조군 마우스를 들어, 면도 플랜에 무수 에탄올 차량의 100 μL를 적용케이.

2. 옆구리 피부 수확

  1. 이산화탄소 흡입을 사용하여 쥐를 안락사, 조심스럽게 10cm 수술 용 가위로 측면 피부 (~ 피부의 25mm X 25mm)의 원하는 영역을 절제.
  2. 깨끗한, 날카로운 칼날을 사용하여 수술, 플랭크 피부에서 과다 지방 및 결합 조직을 얻어 긁어.
  3. 칼슘 또는 마그네슘, 5mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA),없이, 페놀 레드 10 ㎖ RT HBSS를 [함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 3 마우스의 옆구리 피부의 3 개 배치 된 10 mM 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 라진 에탄 술폰산 (HEPES), 및 10 % 소 태아 혈청 (FBS)].

3. 사전 소화 조직 세탁기

  1. 37 ° C로 유지 건식 비 가스실 배양기에서 30 분 동안 회전 접시에 피부 절편을 함유하는 장소 튜브.
  2. 인큐베이션 기간의 끝에서 10 초 동안 격렬하게 소용돌이.
  3. 70 μm의 통하여 튜브의 내용을 변형여과기는 세척 버퍼를 무시하고 조직을 수집합니다. 단일 여과기는 생물 처리 그룹 내 전체 과정에 걸쳐 재사용 할 수있다.
  4. 집게의 쌍을 사용하여, (전술 한 바와 같이 EDTA, HEPES, 및 FBS 함유) 신선 RT HBSS 매체 10 ㎖를 함유하는 새로운 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 여과기에서 플랭크 피부 옮긴다.
  5. 조직 조각이 평균 면적의 약 2.2 mm X 2.2 mm가되도록 튜브 내로 침지 외과 해부 위 12.5 cm 쌍과, 플랭크 피부의 각 부분을 말하다.
  6. 37 ° C로 유지 건식 비 가스실 배양기에서 30 분 동안 회전 접시에 피부 절편을 함유하는 장소 튜브.
  7. 배양의 마지막에 10 초 동안 격렬하게 소용돌이

피부 4. 콜라게나 소화

  1. , 70 ㎛의 여과기를 통하여 튜브의 내용물을 걸러 모아 새로운 50 ml를 함유하는 원뿔형 튜브에 10 ㎖ FRE 플랭크 피부 편을 전송할SH, RT HBSS 미디어가 0.7 mg을 보충 / 디를 콜라게나 ㎖로
  2. 37 ° C로 유지 건식 비 가스실 배양기에서 30 분 동안 회전 접시에 소화 매체 피부 절편을 함유하는 장소 튜브.
  3. 배양의 말에 적극적으로 10 초 동안 튜브의 소용돌이 내용.
  4. 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 70 μm의 여과기를 통해 튜브의 필터 내용; 소화 조직을 함유하는 관류를 유지하고 스트레이너 버리고 피부 파편의 측면.
  5. 350g에서 5 분간 HBSS 매체 원심 50ml에 플로우 스루를 세척하고 상등액을 가만히 따르다.

5. 밀도 구배 원심 분리

  1. 혈청 피펫을 사용하여, 각각의 샘플에 대한 새로운 15ml의 원뿔형 튜브로 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)로 3 ㎖ RT 67 % 밀도 구배 원심 분리 배지를 추가한다.
  2. 페놀 레드와 HBSS에 5 ml의 RT 44 % 밀도 기울기 원심 분리 미디어 세포 펠렛을 Resuspend.
  3. 신사LY 층 혈청 피펫을 사용하여 67 %의 밀도 구배 원심 분리 배지 샘플의 상부에 세포를 포함하는 44 %의 밀도 구배 원심 분리 배지 5 ㎖. 가장 느린 속도에 피펫을 설정하고, 원뿔 튜브의 벽을 따라 피펫을 배치해야합니다. , 동요하지 않도록주의 중단, 또는 기울기를 반전.
  4. 가장 낮은 설정으로 설정 가속, 원심 분리기 균형있는 것을 확인하고, 실온에서 20 분 동안 931 XG에 그라데이션을 브레이크를 해제하고, 원심 분리기.
  5. 원심 분리 후, 조심스럽게 원심 분리기에서 그라디언트를 제거하고 부드럽게 똑바로 튜브를 들고 실험실 벤치에 운반 할 것. 5 ㎖ 플라스틱 전달 피펫을 사용하여, 새로운 15ml의 원뿔형 튜브에 44 % 및 67 %의 밀도 구배 원심 분리 및 전송 매체의 계면에 전지 층을 제거한다. 인터페이스가 표시되지 않는 경우, 단순히 67 % -44 %의 경계에서 액체의 약 2 mL를 제거합니다.
  6. INTE으로부터 세포를 함유하는 원뿔형 튜브를 채우기2 % 1X 빙냉 PBS에서 FBS, 350 XG에서 5 분 동안 원심 분리 세포 및 상등액을 가만히 따르다와 rface.
    주 : 소화 단계가 37 ℃이며, 밀도 구배 원심 분리 배지를 RT 단계에 있기 때문에 이것은 세포가 냉각 될 수 있음은 처음 / 감기 있었다. 셀 (1)에 재현 탁 될 수있다 : 1 트리 판 블루 희석 수 및 생존력 정보이 시점에서 얻을 수있다.

6. 차단 및 염색 유세포 분석

  1. 블록 FcγRII / 비특이적 항체 염색을 방지하기 위해 세포상의 수용체 III. 접합 결합하는 CD16 / 32 (2.4G2)에 대한 항체와 블록 FcγRII / III 수용체의 100 희석 : 여기에 설명 된 실험을 위해, 1을 포함하는 2 % FBS와 PBS에 항체 마스터 믹스를 확인합니다.
  2. CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8α (53-6.7), CD11b를 (M1 / 70)의 CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 (대한 항체의 적절한 마스터 믹스와 차단 된 세포를 품어 30-F11) CD45R(RA3-6B2), CD62L는 (MEL-14), 및 LY-6G / LY-6C (GR-1) (RB6-8C5)뿐만 아니라 화려한 바이올렛 (510) 라이브 / 죽은 얼룩은 죽은 세포를 식별합니다. 희석 제조업체에서 권장하거나 이전에 연구자들에 의해 최적화 된 모든 항체를 사용합니다. (100) 희석 : 여기에 설명 된 실험을 위해, (1) 모든 항체를 사용합니다.
  3. 2 % FBS와 50 μL 1X PBS 염색 버퍼에 세포에 resuspend을 씻으십시오. 형광 데이터는 유세포에 취득 될 때까지 얼음 상에 유지한다.
    주 : 보정 파라미터 형광 데이터의 취득 전에 림프 조직 및 (CD4 또는 CD8과 같은) 공통의 세포 표면 항원에 미리 최적화하는 것이 중요하다.
  4. 분석 계측법 하류 흐름 세포의 수를 증가 염색 된 세포의 전체 샘플들로부터 데이터를 수집한다.

7. 다음과 같은 단계를 수행하는 표준 방법을 사용하여 유동 세포 계측법 데이터 분석

  1. 앞으로 분산의 림프구 지역에 우선, 게이트측면 산란 (지역) 음모에 의해 (지역).
  2. 그런 다음, 이중선을 분석 방지하기 위해 측면 분산 (폭)에 의해 전방 산란 (폭)를 사용하여 하나의 셀을 선택합니다. 이것은 또한 사이드 산란 플롯에 의해 가로 전방 산란 높이로 달성 될 수있다.
  3. 이어서, 혈통 게이트 (는 CD11b, CD11c 양성 및 CD45R / B220) -negative 및 CD3 양성 이벤트 제외하는 대 식세포, 수지상 세포와 B 세포를 각각과 목표인지를 한정은 T 세포 구획 분석 이 여기로, T 세포에 침투 평가한다.
  4. 다음, 라이브 / 죽은 얼룩을 제외 살아있는 세포에 문입니다.
  5. 마지막으로, 관심의 세포 인구에 게이트 (대표 결과 섹션 참조).

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결과

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콜라게나 D 미디어 처리 대조군과 비교시 비장 세포는 T 세포상의 CD4 및 CD8 α 비슷한 수준의 치료를 보여
먼저, T 세포의 서브 세트에 리니지 및 활성화 마커의 주파수 및 풍부 표면에 콜라게나 D의 잠재적 효과는 대조군으로 차 림프 조직을 사용하여 평가 하였다. 비장 세포 현탁액 ND4 마우스로부터 얻어진 HBSS 미디어와 함께 1 시간 동안 세척 하였다. (위의 섹션 4에 기술 된 바와 같이) 다음에, 반 세포 / ㎖의 콜라게나 D 0.7 mg의 실시. 잔여 세포를 HBSS 제어 매질에 재현 탁 하였다. 이어서, 비장 세포 모두 분획 섹션 5에서 전술 한 바와 같이 밀도 구배 원심 분리를 사용하여 처리 하였다....

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토론

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이러한 아토피 성 피부염이나 건선과 같은 피부 질환의 설치류 모델에서 피부에 상주하는 백혈구의 변화를 특성화하는 염증 세포의 유입과 질병 병리 사이의 기계적 연결을 이해하는데 중요하다. 여기에서 우리는 대부분의 생물 의학 연구 실험실에서 발견되는 기본 장비로 피부 조직에서 백혈구를 분리하는 경제적 인 방법을 설명합니다. 이 상대적으로 빠른 기술은 실험실 벤치에서 시간에 손을-최소화하면서 자원을 보존하는 데 도움 비싼 조직 해리 기계 및 사용자 정의 튜브 및 시약의 사용을 방지 할 수 있습니다. 부드러운 효소 소화 및 불연속 구배 분리는 상피 세포와 파편, 및 분리 된 세포의 대부분은 유세포 분석, 세포 분류, 전송, 세포 배양 물 및 생체 외 자극 분석법에 포함 하류 다양한 용도에 사용될 수 제거. 콜라게나 제 효소와 D 다이제스트 T 세포 표면 마커 무결성 및 preser에 영향을주지VES의 세포 생존. 이 프로토콜은 쉽게 측면 이외의 영역들로부터 피부를 처리하기 위해 수정 될 수있다.

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공개 사항

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저자는 공개 재정적 또는 기타 관심 회원이 없습니다.

감사의 글

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국립 보건원 (DC에 NIH R15 NS067536-01A1), 국립 Vulvodynia 협회 (DC에 수상), 그리고 매 켈리 스터 대학교는이 작업을 지원했다. 인증 기관은 아놀드와 로벨 베크 재단 자금 매 켈리 스터 대학교 베크 학자 프로그램에서 교제를 받았다. BTF 및 TM은 JDRF 2-2011-662 지원합니다. 우리는 기술적 조언 박사 제이슨 Schenkel 박사 줄리아 루이스 감사, 그들의 도움과 지원에 대한 Chatterjea 랩의 모든 현재의 전 멤버.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
페놀이 적색, 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 액체Sigma Aldrich55021C사용하는 날까지 멸균 상태를 유지하십시오.
헤페스, ≥ 99.5% (적정)Sigma AldrichH3375
EDTA 디소듐 염 용액Sigma AldrichE7889사용하는 날까지 멸균 상태를 유지하십시오.
소 태아 혈청, USDA, 열 비활성화, 프리미엄 셀렉트MidSciS01520HI사용하는 날까지 멸균 상태를 유지하십시오.
Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C; C)Sigma AldrichP1644멸균 상태를 유지하십시오. Percoll은 사용하기 전에 멸균 10X PBS로 등장 음으로 만들어야합니다.
트리머 콤보 키트Kent ScientificCL9990-1201 더 큰 트리머를 사용하여 옆구리와 등을 면도하십시오.
4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-oneSigma AldrichE0753-10G50°C에서 100% EtOH에 용해됩니다. C를 회전판에서 15분 동안 누릅니다.
정제된 안티 마우스 CD16/CD32 (2.4G2)Tonbo Biosciences70-0161유세포 분석을 위한 항체 염색 중 비특이적 항체 결합을 차단하는 데 사용되는 항체
anti-CD3ε-BV650 (145-2C11)Becton Dickinson564378유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체
anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)eBioscience47-0042-80유동 세포를 염색하는 데 사용되는 항체 cytometry
anti-CD8α-BV785 (53-6.7)BioLegend100749유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체
anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)eBioscience48-0112-80유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체
anti-CD11c-eFluor450 (N418)eBioscience48-0114-80유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체
anti-CD44-BV711 (IM7)Becton Dickinson563971유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체
anti-CD45-FITC (30-F11)Tonbo Biosciences35-0451-U025유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체
anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)eBioscience48-0452-80유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체
anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)BioLegend104431유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체
anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)BioLegend108407유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체
Ghost Dye-BV510Tonbo Biosciences13-0870-T100유세포 분석을 위한 생존 염료
LSR FortessaBecton DickinsonN/A세포 분석기(18개 파라미터)
클로스트리듐의 콜라겐분해효소 D histolyticumRoche Applied Science11088858001분취 액 건조 효소를 HBSS에서 페놀 레드, 칼슘 없음, 마그네슘 없이 1mL 분취액으로 만듭니다. -20°C에서 즉시 보관하십시오. C는 최대 6개월 동안 사용할 수 있습니다.
ND4 스위스 암컷 마우스Harlan0-328-12 주; 전통적으로 음식과 물을 무료로 이용할 수 있도록 수용되었으며 Macalester College의 IACUC 지침에 따라 사용됩니다. 
가 함유된 HBSS 는

참고문헌

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