여기에서는 손상된 미토콘드리아를 선택적으로 제거하는 동안 EYFP-Parkin의 시간적 동원을 측정하기 위한 타임랩스 비디오 현미경 접근 방식에 대해 자세히 설명합니다. 손상된 미토콘드리아의 EYFP-Parkin-dependent 제거의 이러한 동적 과정은 다양한 실험 조건에서 세포 건강의 지표로 사용될 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
타임랩스 비디오 현미경은 살아있는 세포의 실시간 이미징으로 정의할 수 있습니다. 이 기술은 서로 다른 시점의 이미지 수집에 의존합니다. 시간 간격은 현미경 통합 카메라를 제어하는 컴퓨터 인터페이스를 통해 설정할 수 있습니다. 이러한 종류의 현미경 검사는 매우 빠른 사건과 이러한 사건 동안 관찰된 세포 구조에 의해 생성된 신호를 획득할 수 있는 능력을 모두 필요로 합니다. 이미지를 수집한 후, 관심 분자 이벤트의 역학을 보여주기 위해 전체 실험의 동영상을 조립합니다. 타임랩스 비디오 현미경은 생물 의학 연구 분야에서 광범위한 응용 분야를 가지고 있으며 세포 이벤트의 역학을 실시간으로 추적할 수 있는 강력하고 독창적인 도구입니다. 이 기술을 통해 이동, 분열, 신호 전달, 성장 및 사멸과 같은 세포 이벤트를 평가할 수 있습니다. 또한 형광 분자 프로브를 사용하여 DNA, RNA 또는 단백질과 같은 특정 분자를 표시하고 분자 경로와 기능을 추적할 수 있습니다. 타임랩스 비디오 현미경 검사는 여러 가지 장점이 있으며, 그 중 가장 큰 장점은 단일 세포 수준에서 데이터를 수집할 수 있다는 점으로, 세포 생물학 분야의 연구를 위한 고유한 기술입니다. 그러나 타임랩스 비디오 현미경 검사에는 고품질 이미지 획득을 방해할 수 있는 한계가 있습니다. 이미지는 두 가지 외부 요인에 의해 손상될 수 있습니다. 온도 변동, 진동, 습도 및 내부 요인; pH, 세포 운동성. 여기에서는 타임 랩스 비디오 현미경 접근 방식을 사용하여 손상된 미토콘드리아의 선택적 제거를 추적하기 위해 강화 황색 형광 단백질(EYFP)과 융합된 특정 단백질인 Parkin의 동적 획득을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.
서론
거대 자가포식은 재활용 또는 에너지 생산을 목적으로 세포 기관 및 단백질과 같은 손상되거나 기능 장애가 있는 세포 구성 요소의 이화 분해를 포함하는 세포 내 과정입니다. 이 대사 과정을 시작하기 위해 세포는 손상된 세포 구성 요소를 자가포식솜(autophagosome)으로 알려진 이중막 구조로 삼키며, 이 구조는 리소좀과 융합하고 그 내용물이 분해되고 재활용됩니다 1,2. 자가포식에는 크게 두 가지 유형이 있는데, 하나는 비선택적인 것이고 선택적인 것입니다. 비선택적 자가포식 과정은 세포가 영양이 부족한 상태에 있고 필수 영양소와 에너지를 모두 제거해야 할 때 발생합니다. 그러나 선택적 자가포식은 독성이 있을 수 있는 기능 장애/손상된 소기관과 단백질의 제거를 중재하기 위해 발생합니다. 가장 많이 연구된 선택적 자가포식 과정 중 하나는 미토파지 1,3-5라고 하는 미토콘드리아를 제거하는 것입니다.
미토콘드리아는 세포 대사를 위한 중앙 소기관이며 전자 전달 사슬, 지방산 산화 및 트리카르복실산(TCA) 회로를 통한 산화적 인산화를 통해 아데노신 삼인산(ATP)의 주요 공급원입니다. 또한 미토콘드리아는 활성산소종(ROS) 생성을 조절하고 세포 사멸 경로에 참여하는 단백질을 방출합니다 6-8
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프로토콜
모두 발현 벡터 EYFP - 파킨과 pDsRed2 - 미토와 섬유 아세포 1. Electroporation에
- 100 ㎎ / ㎖ DMEM (둘 베코 변형 이글 배지), 10 % 소 태아 혈청, 2 밀리몰 / ℓ L- 글루타민, 100 U / ㎖의 페니실린으로 보충 된 배지를 이용하여 10cm 조직 배양 플레이트에 불멸화 마우스 배아 섬유 아세포 성장 및 37 ℃에서 5 % CO 2를 함유하는 가습 분위기 스트렙토.
- 80 %의 세포 생장에서 HPO 4 KH 2.4 g을 멸균 흡인 완전한 DMEM 배지를 버리고 멸균 1X 인산 완충 용액 10 ㎖ (PBS) (NaCl을 80 g, KCl을 2.0 g, 나트륨이 14.4 g을 추가 7.4) : 2 PO 4 1 L은 H 2 O, PH 증류.
- 멸균 흡입하여 PBS를 버리고 트립신 - EDTA 0.25 % 1 ㎖를 추가합니다. (- 3 분 2) 세포가 분리 될 때까지 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션. _, 완전한 DMEM 배지 4 ML을 추가 세포를 재현 탁하고 10을 꺼내(6) 상기 혈구 계산을위한 세포 현탁액 L.
참고 : 16 코너 사각형의 한 세트의 셀의 개수는 ....
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결과
여기서, 우리는 시간 경과 비디오 현미경은 단일 세포에 형광 태그 단백질의 분자 이벤트를 수행하는 데 사용할 수있는 강력한 기술이다 방법을 보여줍니다. 대표 결과는 또한이 기술은 높은 품질의 이미지의 취득을 허용하는 방법을 보여줍니다. 분자 프로세스의 이미지가 획득 될 때, 우리는 다른 방법을 분석 할 수있는 기회를 가질 수있다. 여기서는 선택적 미토콘드리아 손상을 제거 세포 항상성을 유지하는 중요한 분자 과정 유도 mitophagy 프로세스의 개시 사이의 시간 간격을 분석한다.
이 기술은 다양한 애플리케이션을 발견한다. 그러한 세포 이동 또는 조사되어야하는 공정에 관련된 중요한 분자의 표지 분자를 통해 마이크로 이벤트로 매크로 셀룰러 프로세스를 모니터링하기 위해 사용할 수있다.
오 : 유지-.......
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토론
저속 현미경은 장시간 휴대 역학의 관찰 시간에 하나의 관측으로부터 생균 촬상 확장 기술로 정의 될 수있다. 그것은 관찰자 실시간 단일 형광 표지 된 단백질을 확인하고 단일 생균 내부 동적를 수행 할 수 있기 때문에이 방법은 단순 또는 공 초점 현미경 생균과 구별된다. 사실, 공 초점 현미경 쉽게 형광 항체를 이용하여 면역 표지 된 단백질을 식별하지만, 상기 셀 및 그 실제 환경에서의 분자 이벤트를 관찰 할 수 없다.
시간 경과 비디오 현미경은 주로 HEK293 (16)와 같은 다른 세포 유형, 기본 뉴런 (17)와 헬라 세포 (18) 분자 프로세스를 모니터링 연구에 사용뿐만 아니라 임상 적 임신과 같은 응용 프로그램과 이수성 (19, 20)을 예측을 가지고 있습니다. 시간 경과 현미경 embryolog 제공임상 임신 배아 발달에 대한 추가 정보 주의자하고,이 정보는 전송 가능한 배아를 선택하는 .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 NIH 보조금(1R01CA137494, R01CA132115, R01CA086072 to R.G.P.), Kimmel Cancer Center NIH Cancer Center Core 보조금 P30CA056036(R.G.P.), 유방암 연구 재단의 보조금, Dr. Ralph and Marian C. Falk Medical Research Trust(R.G.P.)의 관대한 보조금 및 펜실베니아 보건부(R.G.P.)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 이 연구는 부분적으로 American Italian Cancer Foundation 박사후 연구원(G.D.)과 Sidney Kimmel Cancer Center의 Bioimaging Shared Resource(NCI 5, P30, CA-56036)의 지원을 받았습니다. 보건부는 분석, 해석 또는 결론에 대한 책임을 구체적으로 부인합니다. 이 원고와 관련된 이해 상충은 없습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Corning Life Science | 10-013-CV | 37 °에서 예열; C 사용 전 |
| 페놀-프리 DMEM | 코닝 생명 과학 | 17-205-CV | 37 °에서 사전 예열; C 사용 전 |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | 37 °에서 사전 예열; C 사용 전 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | 37 °에서 사전 예열; C 사용 전 |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Corning Life Science | 30-002-CI | 37 °에서 사전 예열; C 사용 전 |
| EYFP-PARKIN 발현 벡터 | Addgene | 23955 | |
| pDsRed2-Mito 발현 벡터 | Clontech | 632421 | |
| Nucleofector 2B 장치 | LONZA | AAD-1001S | |
| Nucleofector for kit R NIH/3T3 | LONZA | VCA-1001 | |
| ZEISS AXIOVERT 200M 도립 현미경 | CARL ZEISS | ||
| 카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)-페닐히드라존(FCCP) | 시그마-알드리치 | C2920 | |
| 메타모프 | 분자 장치 | 실험 빌더 | |
| 이미지J | 국립 보건 연구소 | 실험 빌더 |
참고문헌
- Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 9-14 (2011).
- Zhi, X., Zhong, Q. Autophagy in cancer. F1000Prime Rep. 7, 18(2015).
- Ding, W. X., Yin, X. M.
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