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방법 논문

휴대 Mitophagy을위한 마커 EYFP - 파킨 집계의 평가를위한 시간 경과 비디오 현미경

6.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53657

⸱

2016년 5월 4일

 ,  ,  , 
1Department of Cancer Biology, Thomas Jefferson University, SKCC, 2Department of Medical Oncology, Thomas Jefferson University, SKCC, 3Kazan Federal University

이 논문에서

요약

여기에서는 손상된 미토콘드리아를 선택적으로 제거하는 동안 EYFP-Parkin의 시간적 동원을 측정하기 위한 타임랩스 비디오 현미경 접근 방식에 대해 자세히 설명합니다. 손상된 미토콘드리아의 EYFP-Parkin-dependent 제거의 이러한 동적 과정은 다양한 실험 조건에서 세포 건강의 지표로 사용될 수 있습니다.

초록

타임랩스 비디오 현미경은 살아있는 세포의 실시간 이미징으로 정의할 수 있습니다. 이 기술은 서로 다른 시점의 이미지 수집에 의존합니다. 시간 간격은 현미경 통합 카메라를 제어하는 컴퓨터 인터페이스를 통해 설정할 수 있습니다. 이러한 종류의 현미경 검사는 매우 빠른 사건과 이러한 사건 동안 관찰된 세포 구조에 의해 생성된 신호를 획득할 수 있는 능력을 모두 필요로 합니다. 이미지를 수집한 후, 관심 분자 이벤트의 역학을 보여주기 위해 전체 실험의 동영상을 조립합니다. 타임랩스 비디오 현미경은 생물 의학 연구 분야에서 광범위한 응용 분야를 가지고 있으며 세포 이벤트의 역학을 실시간으로 추적할 수 있는 강력하고 독창적인 도구입니다. 이 기술을 통해 이동, 분열, 신호 전달, 성장 및 사멸과 같은 세포 이벤트를 평가할 수 있습니다. 또한 형광 분자 프로브를 사용하여 DNA, RNA 또는 단백질과 같은 특정 분자를 표시하고 분자 경로와 기능을 추적할 수 있습니다. 타임랩스 비디오 현미경 검사는 여러 가지 장점이 있으며, 그 중 가장 큰 장점은 단일 세포 수준에서 데이터를 수집할 수 있다는 점으로, 세포 생물학 분야의 연구를 위한 고유한 기술입니다. 그러나 타임랩스 비디오 현미경 검사에는 고품질 이미지 획득을 방해할 수 있는 한계가 있습니다. 이미지는 두 가지 외부 요인에 의해 손상될 수 있습니다. 온도 변동, 진동, 습도 및 내부 요인; pH, 세포 운동성. 여기에서는 타임 랩스 비디오 현미경 접근 방식을 사용하여 손상된 미토콘드리아의 선택적 제거를 추적하기 위해 강화 황색 형광 단백질(EYFP)과 융합된 특정 단백질인 Parkin의 동적 획득을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

서론

거대 자가포식은 재활용 또는 에너지 생산을 목적으로 세포 기관 및 단백질과 같은 손상되거나 기능 장애가 있는 세포 구성 요소의 이화 분해를 포함하는 세포 내 과정입니다. 이 대사 과정을 시작하기 위해 세포는 손상된 세포 구성 요소를 자가포식솜(autophagosome)으로 알려진 이중막 구조로 삼키며, 이 구조는 리소좀과 융합하고 그 내용물이 분해되고 재활용됩니다 1,2. 자가포식에는 크게 두 가지 유형이 있는데, 하나는 비선택적인 것이고 선택적인 것입니다. 비선택적 자가포식 과정은 세포가 영양이 부족한 상태에 있고 필수 영양소와 에너지를 모두 제거해야 할 때 발생합니다. 그러나 선택적 자가포식은 독성이 있을 수 있는 기능 장애/손상된 소기관과 단백질의 제거를 중재하기 위해 발생합니다. 가장 많이 연구된 선택적 자가포식 과정 중 하나는 미토파지 1,3-5라고 하는 미토콘드리아를 제거하는 것입니다.

미토콘드리아는 세포 대사를 위한 중앙 소기관이며 전자 전달 사슬, 지방산 산화 및 트리카르복실산(TCA) 회로를 통한 산화적 인산화를 통해 아데노신 삼인산(ATP)의 주요 공급원입니다. 또한 미토콘드리아는 활성산소종(ROS) 생성을 조절하고 세포 사멸 경로에 참여하는 단백질을 방출합니다 6-8.

PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1) 및 Parkin RBR E3 ubiquitin ligase (Parkin)는 미토파지 과정에 관여하는 핵심 단백질입니다. Parkin은 미토콘드리아 품질 관리를 통해 세포를 건강하게 유지함으로써 세포 사멸을 방지할 수 있습니다9. 미토콘드리아 막 전위가 손실되면 세포질 Parkin은 PINK1에 의해 미토콘드리아로 모집됩니다. 이 동원은 미토파지 10의 순차적인 사건을 유발합니다. 미토파지가 근본적인 미토콘드리아의 품질 관리 과정이며, 이 과정의 이상이 질병을 유발한다는 광범위한 증거가 있습니다 7. 예를 들어, 상염색체 열성 파킨슨병은 파킨슨병(Parkin)과 PINK1(각각 PARK2와 PINK1)을 암호화하는 유전자의 돌연변이와 관련이 있다 11. 미토콘드리아 건강의 품질 관리는 ROS12 축적에 기여하는 미토콘드리아를 제거하는 데 필수적입니다. 세포 내 ROS가 과도하게 존재하면 핵 DNA와 미토콘드리아 DNA(각각 DNA와 mt DNA)가 손상될 수 있습니다.

여기에서는 분리제인 카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)-페닐히드라존(FCCP)의 체외 투여를 통해 불멸화된 마우스 배아 섬유아세포에서 파킨 매개 미토파지가 유도된 후 파킨의 응집을 추적하는 타임랩스 비디오 현미경 접근 방식을 보여줍니다. FCCP는 외부 미토콘드리아 막을 가로질러 양성자를 단락시켜 ATP 합성을 방해하여 전자 전달 사슬 13에서 산화적 인산화를 분리합니다. 미토콘드리아 막의 탈분극을 유발하면 미토콘드리아가 파괴되고 파킨에 의존하는 선택적 제거가 이루어집니다. 그러므로, 형광 마커(enhanced yellow fluorescent protein, EYFP)와 융합된 Parkin을 인코딩하는 발현 벡터로 관심 세포를 transfection하는 것은 mitophagic process 동안 Parkin의 동원을 추적하기 위한 형광 태그로 사용할 수 있습니다. 미토콘드리아를 시각화하기 위해 시토크롬 c 산화효소 소단위 VIII(Mito)의 미토콘드리아 표적화 염기서열을 포함하는 적색 형광 단백질(DsRed2)을 인코딩하는 pDsRed2-Mito를 공동 트랜스펙션했습니다. pDsRed2-Mito는 미토콘드리아14의 형광 표지를 위해 설계되었습니다. Parkin이 미토콘드리아 막으로 전좌하는 데 필요한 시간을 측정할 수 있으며 세포 건강을 간접적으로 측정할 수 있습니다. 예를 들어, 특정 관심 유전자에 대해 녹아웃된 세포주가 FCCP에 의한 미토파지 유도 후 Parkin의 더 빠르거나 느린 모집을 보여주는 경우, 해당 유전자 산물은 세포의 신진대사 속도를 생리학적 상태로 유지하고 질병의 발병을 예방하는 데 중요한 역할을 할 것이라고 말할 수 있습니다. 따라서 타임 랩스 비디오 현미경 검사는 분자 과정 동안 표지된 단백질의 역학을 추적하고 이러한 과정이 병리학적 상태에서 어떻게 영향을 받는지 이해하는 데 있어 기초 및 임상 연구 응용 분야 모두에 매우 강력한 도구를 제공합니다.

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프로토콜

모두 발현 벡터 EYFP - 파킨과 pDsRed2 - 미토와 섬유 아세포 1. Electroporation에

  1. 100 ㎎ / ㎖ DMEM (둘 베코 변형 이글 배지), 10 % 소 태아 혈청, 2 밀리몰 / ℓ L- 글루타민, 100 U / ㎖의 페니실린으로 보충 된 배지를 이용하여 10cm 조직 배양 플레이트에 불멸화 마우스 배아 섬유 아세포 성장 및 37 ℃에서 5 % CO 2를 함유하는 가습 분위기 스트렙토.
    1. 80 %의 세포 생장에서 HPO 4 KH 2.4 g을 멸균 흡인 완전한 DMEM 배지를 버리고 멸균 1X 인산 완충 용액 10 ㎖ (PBS) (NaCl을 80 g, KCl을 2.0 g, 나트륨이 14.4 g을 추가 7.4) : 2 PO 4 1 L은 H 2 O, PH 증류.
    2. 멸균 흡입하여 PBS를 버리고 트립신 - EDTA 0.25 % 1 ㎖를 추가합니다. (- 3 분 2) 세포가 분리 될 때까지 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션. _, 완전한 DMEM 배지 4 ML을 추가 세포를 재현 탁하고 10을 꺼내(6) 상기 혈구 계산을위한 세포 현탁액 L.
      참고 : 16 코너 사각형의 한 세트의 셀의 개수는 셀 × 104 / ㎖의 수에 해당되도록 혈구가 설계된다.
  2. 일렉트로 과정 24 시간 이전에 10cm의 조직 배양 접시 위에 시드 1 × 106 세포.
  3. 멸균 흡입에 의해 완전한 DMEM 매체를 취소하고 멸균 PBS 10 ㎖를 추가합니다. 멸균 흡입하여 PBS를 버리고 트립신 - EDTA 0.25 % 1 ㎖를 추가합니다. (- 3 분 2) 세포가 분리 될 때까지 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션. 완전 DMEM 배지 4 ㎖에 첨가하고 15 ㎖의 튜브에 세포를 재현 탁.
  4. 냉장 원심 분리기 (4 °에 C)를 사용하여 5 분 동안 250 XG에서 세포를 스핀 다운. 멸균 흡인에 의해 뜨는을 취소하고 멸균 PBS 1 ml의 펠렛을 재현 탁. 4 ° C에서 5 분 동안 250 XG에서 세포를 스핀 다운.
  5. 멸균 흡입하여 상층 액을 버리고, 100 μL O를 추가전기에 대한 F 솔루션 믹스 세포 펠렛에 (82 기업 솔루션 (1)의 전기 솔루션 V + 18 μL의 μL) 부드럽게 피펫 팅하여 펠렛을 재현 탁 (자세한 내용은 사용 설명서를 참조하십시오). 세포 현탁액에서 EYFP - 파킨 (여기 / 방출 527분의 514) 및 1 μg의 pDsRed2 - 미토 (여기 / 방출 620분의 565)의 2 μg의 추가.
  6. 일회용 파스퇴르를 사용하여 멸균 큐벳에 대한 해결책을 (모두 도구 키트와 함께 제공)로 이동하고, 미리 설정된 프로그램 NIH / 3T3 U-030 (단일 펄스 전압을 200 V, 용량 960 μF, 펄스 시간이 20 밀리 초를 사용 electroporate , 펄스 수 : 1).
  7. 37 ℃에서 5 % CO 2를 함유하는 가습 분위기 중에서 즉시 일렉트로 후 신선한 미리 예열 완전 DMEM 배지 500 ㎕를 추가하고, 6cm 조직 배양 플레이트 라이브 영상 급의 전지를 시드 및 부화 24 시간.

2. 시간 경과 비디오 현미경

    사용하기 전에 37 ° C에서 현미경의 챔버의 온도를 설정합니다.
  1. 이때, 실험 프로토콜을 수행 할 특정 라이브 영상 매체를 준비한다. 다음과 같이 라이브 영상 매체를 준비; 혼합 DMEM 페놀없이 10 % 소 태아 혈청, 2 밀리몰 / ℓ L- 글루타민, 100U / ml 페니실린 및 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신으로 보충. 수욕에서 37 ° C에서 라이브 영상 매체를 미리 가온.
  2. 멸균 흡인 일렉트릭 세포의 배지를 버리고 P1000 피펫을 사용하여, 미리 예열 라이브 영상 배지 1 ㎖을 추가하고, 37 ℃에서 30 분 동안 플레이트를 배양한다.
  3. 37 ℃의 온도에서 안정한 이미 현미경의 챔버 내의 플레이트 잠복기, 유입 5 % CO 2 중.
  4. 주요 움직임이나 진동을 방지 현미경의 챔버로 일렉트릭 세포와 접시를 놓습니다.
  5. 소프트웨어 인터페이스를 사용하여, 두 fluore를 검출하기 위해서 현미경을 설정할공동 형질 벡터에 의해 코딩되는 융합 단백질에서에서 scence 신호 EYFP-파킨 및 (여진 범위 495 nm의 발광 범위 녹색 520-550 나노 미터, 510)를 pDsRed2-미토 (여진 최대 558 nm의 발광 최대 583 nm의 빨간).
    1. 시간 경과 비디오 현미경 소프트웨어를 엽니 다. 상단 메뉴에서 pDsRed2 - 미토에 대한 EYFP - 파킨과 로다 민에 대한 FITC를 선택합니다. 상단 메뉴에서 배율 (20 배)을 선택합니다.
  6. 소프트웨어 인터페이스를 사용하여, 두 공동 형질 발현 벡터를 단일 셀의 모양과 위치를 등록한다. 10 셀의 최소마다 실험 조건 (실험 그룹)에 대해 수집 될 때까지이 단계를 반복합니다.
    1. 메뉴 "앱"을 선택하고 멀티 차원 취득을 클릭합니다. 다중 차원 취득 창에서 이러한 인수의 수, 각 수집 및 기록 된 셀의 위치 사이의 시간 간격과 필요한 매개 변수를 선택합니다. 획득 "을 클릭합니다"인수 과정을 시작합니다.
  7. EYFP - 파킨과 15 분의 총 간격 이미지마다 5 분을 수집 DsRed2 - 미토 형광 신호 모두의 기저 인수를 시작합니다.
  8. 최종 작업 농도보다 두 배 높은 FCCP의 농도로 예열 라이브 영상 매체를 준비 (0.1-10 μM, 세포 유형에 따라 다름).
  9. 인수 과정을 중단하고 P1000 피펫을 사용하여 현미경의 챔버 내부의 플레이트에 FCCP에 미리 예열 라이브 영상 매체의 부드럽게 1ml를 추가합니다.
  10. 이전에 기록 된 위치를 이용하여 3 시간의 총 시간 동안, 한 바와 같이, 획득 프로세스를 재시작. 를 분석하고 수집이 끝날 때 mitophagic 과정의 비디오를 만들기 위해 모든 획득 된 영상을 저장합니다.

3. 분석

  1. 개인용 컴퓨터의 "티파니"형식의 모든 획득 된 영상을 수집
  2. 그래픽 소프트와 이미지를 엽니 다도자기와 시간 간격을 정의는 (사진 매 5 분을 취득) 미토콘드리아 막에 파킨의 채용을 보여주는 첫 번째 이미지에 FCCP와 미토콘드리아 유도 - 탈분극에서 발생했습니다. 실험 그룹의 각 셀에 대해 이러한 분석을 반복합니다.
  3. 실험 그룹 이름의 스프레드 시트에 열의 첫 번째 셀을 레이블. 각 실험군의 경우, 10 셀의 최소의 파킨 모집을위한 시간 간격을 측정한다. 파킨 모집하기위한 계산 시간 간격의 평균을 각 실험군의 표준 편차를 정의하는 (평균 ± SD를, N = 10).
    1. 열 하나의 계산 된 시간 간격으로 구성합니다. 모든 열은 N = 실험군의 10 측정이 포함되어 있습니다.
    2. 수식 작성기 메뉴에서 기능 "평균"을 선택합니다. 열의 데이터를 선택합니다. 수식 작성기 메뉴에서 기능 "표준 편차"를 선택합니다. 실리열의 데이터 캐럿.
  4. 통계적 방법을 사용하여, 실험군 간의 mitophagy의 동적 상당한 차이를 정의하기 위해 적절한 통계인가 실험군과 비교. (예를 들어, 두 그룹 = 스튜던트 t- 검정 세 이상의 그룹 = ANOVA 플러스 사후 시험)

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결과

여기서, 우리는 시간 경과 비디오 현미경은 단일 세포에 형광 태그 단백질의 분자 이벤트를 수행하는 데 사용할 수있는 강력한 기술이다 ​​방법을 보여줍니다. 대표 결과는 또한이 기술은 높은 품질의 이미지의 취득을 허용하는 방법을 보여줍니다. 분자 프로세스의 이미지가 획득 될 때, 우리는 다른 방법을 분석 할 수있는 기회를 가질 수있다. 여기서는 선택적 미토콘드리아 손상을 제거 세포 항상성을 유지하는 중요한 분자 과정 유도 mitophagy 프로세스의 개시 사이의 시간 간격을 분석한다.

이 기술은 다양한 애플리케이션을 발견한다. 그러한 세포 이동 또는 조사되어야하는 공정에 관련된 중요한 분자의 표지 분자를 통해 마이크로 이벤트로 매크로 셀룰러 프로세스를 모니터링하기 위해 사용할 수있다.

오 : 유지-...

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토론

저속 현미경은 장시간 휴대 역학의 관​​찰 시간에 하나의 관측으로부터 생균 촬상 확장 기술로 정의 될 수있다. 그것은 관찰자 실시간 단일 형광 표지 된 단백질을 확인하고 단일 생균 내부 동적를 수행 할 수 있기 때문에이 방법은 단순 또는 공 초점 현미경 생균과 구별된다. 사실, 공 초점 현미경 쉽게 형광 항체를 이용하여 면역 표지 된 단백질을 식별하지만, 상기 셀 및 그 실제 환경에서의 분자 이벤트를 관찰 할 수 없다.

시간 경과 비디오 현미경은 주로 HEK293 (16)와 같은 다른 세포 유형, 기본 뉴런 (17)와 헬라 세포 (18) 분자 프로세스를 모니터링 연구에 사용뿐만 아니라 임상 적 임신과 같은 응용 프로그램과 이수성 (19, 20)을 예측을 가지고 있습니다. 시간 경과 현미경 embryolog 제공임상 임신 배아 발달에 대한 추가 정보 주의자하고,이 정보는 전송 가능한 배아를 선택하는 ...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 NIH 보조금(1R01CA137494, R01CA132115, R01CA086072 to R.G.P.), Kimmel Cancer Center NIH Cancer Center Core 보조금 P30CA056036(R.G.P.), 유방암 연구 재단의 보조금, Dr. Ralph and Marian C. Falk Medical Research Trust(R.G.P.)의 관대한 보조금 및 펜실베니아 보건부(R.G.P.)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 이 연구는 부분적으로 American Italian Cancer Foundation 박사후 연구원(G.D.)과 Sidney Kimmel Cancer Center의 Bioimaging Shared Resource(NCI 5, P30, CA-56036)의 지원을 받았습니다. 보건부는 분석, 해석 또는 결론에 대한 책임을 구체적으로 부인합니다. 이 원고와 관련된 이해 상충은 없습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEMCorning Life Science10-013-CV37 °에서 예열; C 사용 전
페놀-프리 DMEM코닝 생명 과학17-205-CV37 °에서 사전 예열; C 사용 전
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF244237 °에서 사전 예열; C 사용 전
L-GlutamineGibco2503037 °에서 사전 예열; C 사용 전
페니실린/스트렙토마이신Corning Life Science30-002-CI37 °에서 사전 예열; C 사용 전
EYFP-PARKIN 발현 벡터Addgene23955
pDsRed2-Mito 발현 벡터Clontech632421
Nucleofector 2B 장치LONZAAAD-1001S
Nucleofector for kit R NIH/3T3LONZAVCA-1001
ZEISS AXIOVERT 200M 도립 현미경CARL ZEISS
카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)-페닐히드라존(FCCP)시그마-알드리치C2920
메타모프분자 장치실험 빌더
이미지J국립 보건 연구소실험 빌더

참고문헌

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