방법 논문

재조합 아데노 - 관련 바이러스 성 벡터의 정위 주사를 통해 파킨슨 병에 대한 알파 - 시누 클레인 기반 쥐 모델 개발

DOI:

10.3791/53670

⸱

2016년 2월 28일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Neurobiology and Gene Therapy, Department of Neurosciences, KU Leuven, 2Division of Nuclear Medicine, Leuven University Hospital - KU Leuven, 3Laboratory for Molecular Virology and Gene Therapy, Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, KU Leuven, 4Leuven Viral Vector Core, KU Leuven

이 논문에서

요약

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이 원고는 바이러스 벡터 매개 국소 유전자 전달이 어떻게 중추 신경계에서 전이 유전자를 발현하는 매력적인 방법을 제공하는지 설명합니다. 이 프로토콜은 파킨슨병에 대한 바이러스 벡터 기반 동물 모델을 개발하기 위해 쥐의 흑질에 바이러스 벡터 주입을 수행하기 위한 모든 중요한 단계를 설명합니다.

초록

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파킨슨 병 (PD)의 분자 경로를 연구하고 새로운 치료 전략을 개발하기 위해, 과학 연구자들은 동물 모델에 의존한다. PD 관련 유전자의 확인은 유전 PD 모델의 개발을 유도 하였다. 대부분의 유전자 변형 α-SYN 마우스 모델은 점진적 α-SYN 병리학을 개발하지만 분명 도파민 세포의 손실 및 도파민 의존 행동 적자를 표시하지 못합니다. 이 장애물은 PD 관련 유전자를 과발현 바이러스 벡터와 흑색질의 직접 타겟팅에 의해 극복되었다. 바이러스 벡터를 사용하여 로컬 유전자 전달은 중추 신경계의 유전자를 발현하는 매력적인 방법을 제공한다. 뇌의 특정 영역 (예 흑색질) 대상이 될 수있는 발현 성인 환경에서 발생 될 수 있으며, 높은 발현 수준이 달성 될 수있다. 또한, 다양한 바이러스 벡터에 따라 서로 다른 시스템을 사용할 수있다. 이 프로토콜은 바이러스 벡터를 수행하기 위해 모든 중요한 단계를 설명쥐의 흑색질 주사 파킨슨 질환 바이러스 벡터 기반의 α- 시누 클레인의 동물 모델을 개발한다.

서론

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PD의 기전을 연구하고, 새로운 치료 전략을 개발 밀접 인간 PD의 병리학 생리학 모터 증상 유사한 동물 모델에 대한 긴급한 필요성이있다. 높은 예측도는, 더 나은 우리는 환자에게 동물 모델에서 새로운 치료법을 변환 할 수 있습니다.

1997 년 제 PARK 유전자 등의 α- 시누 클레인의 발견 (α-SYN)가 제 유전자 PD 모델의 개발을 이끌었다. 인간 야생형 (WT) 또는 돌연변이 (A30p의, A53T)를 과발현 많은 형질 전환 마우스 α-SYN은 지난 10 년 동안 생성되었습니다. α-SYN 과발현의 수준은 병리학의 발전에 중요한 것으로 입증했습니다. 또한 마우스 균주 내생 α-SYN 및 전장 또는 절단 된 형태의 발현 여부 유무 (Magen 및 Chesselet (1)에 의한 심층 분석) 역할을한다. WT 인간의 여러 임상 돌연변이 모두의 과발현 및# 945; 형질 전환 마우스에서 -SYN은 α-SYN의 병리학 적 축적과 신경 기능 장애 2-6을 유도한다. 그러나 지금은 대부분의 형질 전환 α-SYN 마우스 모델은 분명 도파민 세포의 손실 및 도파민 의존 행동 적자를 표시하는 데 실패 할 때까지.

이 장애물은 α-SYN를 과발현 바이러스 벡터와 흑색질 (SN)의 직접 타겟팅에 의해 극복되었다. 바이러스 벡터를 용이하게, 세포를 감염 그들의 숙주 게놈에 유전 물질을 도입하고 새로운 바이러스 입자를 제조하기 위하여 바이러스 게놈을 복제하는 숙주 세포를 강제 바이러스로부터 유도된다. 바이러스는 세포를 입력하고 유전자를 도입 할 수있는 능력을 보유 비 복제 바이러스 벡터를 설계 할 수있다. 바이러스 게놈의 일부를 삭제하고 관심있는 유전자에 의해이를 대체하여, 벡터의인가는 일반적으로 "전달"로 지정된 숙주 세포에서 복제하지 않고 단일 라운드 감염 될 것이다. 바이러스 성 벡터 다이 과발현 유전자 침묵 모두 사용될. 표현 형질 전환 유전자는 리포터 단백질 (예를 들어 녹색 형광 단백질 또는 반딧불 루시 페라 제) 7, 우리는이 논문에서에 초점을 맞출 것이다으로 치료 유전자 치료 응용 프로그램에 8-10에 대한 단백질 또는 일 수있다, 질병 관련 단백질은 질병 모델링 (11)에 사용 -14.

바이러스 성 벡터 매개 유전자 전달은 여러 가지 장점으로 CNS의 유전자를 표현하는 다른 방법을 제공합니다. 로컬 유전자 전달을 이용하여, 뇌의 특정 영역을 대상으로 할 수있다. 또한, 유전자 발현이 발달 동안에 보상기구의 위험을 감소 성인기 유도 될 수있다. 또한, 모델은 다른 종과 변종을 만들 수 있습니다. 그리고 마지막으로, 다른 트랜스 쉽게 결합 될 수있다. 바이러스 벡터를 사용하여, 높은 유전자 발현 수준은 질병의 발병 및 심각도 자주 overexp의 레벨에 의존 때문에 중요 할 수도있는, 달성 될 수있다ression.

다른 바이러스 벡터에 기초하여 여러 가지 시스템들이 개발되어왔다. 벡터 시스템의 선택은 관심의 유전자의 유전자 발현은 표적 세포 및 생물 안전성 문제에 필요한 시간의 크기에 따라 달라진다. 그들은 쥐의 뇌에서 효율적이고 장기적인 유전자 발현으로 이어질 때문에 뇌, 렌티 바이러스 (LV)에서 안정적인 유전자 전달 및 재조합 아데노 관련 바이러스의 경우 (rAAV) 벡터는 이제 선택의 벡터 시스템으로 간주됩니다. SN의 도파민 신경 세포 (DN)의 특정 타겟팅를 들어, rAAV 벡터는 점차 때문에 높은 역가 및 DN의 전달 효율 LV 벡터를 outcompeted있다.

현재 가장 α-SYN 기반 설치류 모델은 새로운 AAV 혈청 형을 이용한 결합 방식에서 개발되었다 (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) 및 벡터 작 제물, 역가 및 순도 15,16 최적화. 벡터 역가뿐만 아니라 벡터 순도 직접 영향모델의 표현형 결과. 과도한 벡터 역가 또는 불충분하게 정제 된 벡터 배치가 아닌 특정 독성이 발생할 수 있습니다. 따라서, 적절한 제어 벡터는 필수적이다. 바이러스 벡터 생산, 업 스케일링 및 정제 과정에서 상당한 시간 투자도 재현 고품질 벡터 배치를 얻기 위해 필수적인 입증했다.

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프로토콜

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모든 동물 실험은 루벤 대학의 생명 윤리위원회 (벨기에)에 의해 1986년 11월 24일 (6백9분의 86 / EEC)의 유럽 공동체위원회 지침에 따라 수행하고 승인됩니다.

1. 재조합 AAV 생산 및 정제

참고 : 이전에 17 설명 된대로 rAAV 벡터의 생산 및 정제 루벤 바이러스 성 벡터 코어 (LVVC)에 의해 수행되었다.

  1. 간단히, 트랜 subconfluent 낮은 (<50) 통로 25kD 선형 폴리에틸렌 이민 (1)의 비율을 150 nm의 NaCl 형질 용액 및 세 가지 플라스미드를 사용하여 점착성 HEK의 293T 세포 : DMEM 배지 2 % 소 태아 혈청을 1 : 1. 5 % CO 2, 37 ℃에서 24 시간 배양 후, 새로운 DMEM 배지 2 % 태아 소 혈청 배지를 교체한다.
    주 : 플라스미드 AAV7 혈청 형에 대한 구조를 포함 CMVie의 제어하에 SYN α-A53T 인간 변이체를 코딩 AAV 전송 플라스미드 synaps 향상된IN1 프로모터와 pAdvDeltaF6 아데노 바이러스 도우미 플라스미드 17.
  2. 일시적 형질 전환 후 매체 오일 수확과 접선 흐름 여과 (17)를 사용하여 집중한다.
  3. iodixanol 단계 구배 (17)를 사용하여 농축 매체로부터 rAAV 벡터 입자를 정제.
  4. 게놈 사본 (GC) 결정을위한 실시간 PCR 표준 기술을 사용합니다. 이 프로토콜, 3.0 E11 GC의 벡터 역가 / ml의 PD (17) α-SYN 계 랫트 모델을 개발하는데 사용되었다.

rAAV의 α-SYN 2. 정위 주입 쥐의 SN 벡터 (그림 2)

  1. 펠렛 음식과 수돗물에 무료로 액세스 할 수있는 정상적인 12 시간 조명 / 어두운주기에 따라 약 2백-2백50그램 무게 하우스 팔주 세 여성 위 스타 쥐.
  2. 복강에 쥐를 제출 (IP) 케타민의 혼합물 (60 ㎎ / ㎏) 및 메데 토미 (/ kg, 0.4 mg)을 포함 마취. 쥐를 마취하고 반응하지 않는되면다른 발을 압박 할 때, 마이크로 - 트랜스 주입기를 사용하여 상기 인식 쥐의 뒤에 마이크로 폰더 피하 투여. 마이크로 트랜스 폰더가 올바르게 배치 및 판독 장치에 의해 판독 될 수 있는지 확인합니다.
  3. 두피의 위에 머리를 잘라. 두피와 귀 모두에 국소 마취제를 적용합니다. 무균 기술을 사용하여 층류 하에서 수술 절차의 나머지를 수행한다.
  4. 두 귀 바, 입과 코 막대를 사용하여 정위 헤드 프레임에서 쥐를 놓습니다. 체온의 저하를 방지하기 위해 용지 담요 쥐 본체 커버. 건조에서 눈을 방지하기 위해 안구 윤활제를 적용합니다.
  5. 이소프로판올 70 %에 jodium 1 %와 두피를 소독하고 두피의 중간 선에 작은 절개를합니다. 조심스럽게 두개골의 세포막을 멀리 긁어 식염수로 씻어. 몇 분 동안 두개골 건조를 할 수 있습니다. 브레 그마 및 람다 : 두개골 봉합과 두 개의 기준점을 준수하십시오.
  6. SN에 rAAV 벡터를 주입하기 위해, 브레 그마 향해 좌표를 정의한다 (전후 : 5.3 mm; mediolateral : 2.0 mm와 dorsoventral : 경질 계산을 7.2 mm).
    주 : 관심있는 각각의 영역에 대한 삼차원 좌표 해부학 기준점으로 브레 그마인가, 래트 뇌 정위 아틀라스을 사용하여 계산 될 수있다.
  7. rAAV 벡터와 10 μL의 미세 주입 주사기 (30 게이지 20mm)를 입력하고 전동 마이크로 인젝션 펌프와 연결 정위 기기에 넣습니다. 벡터의 방울을 방출하여 볼륨을 조절하고, 다가 세척 세제의 pH 9 (예 : RBS)에서 제거한다.
  8. 시각 헤드가 똑바로 머리를 프레임에 고정되어 있는지 확인하고, 좌우 축으로 평가하고 있습니다. 조심스럽게 시각적 브레 그마 및 람다의 전후 및 mediolateral 좌표를 정의하고 정위 프레임의 dorsoventral 팔에 30 게이지 20mm 바늘을 사용하여 높이를 측정한다.
    1. 오전 허용브레 그마 및 람다 사이에 높이 0.3 mm 차이의 aximum. 다시 브레 그마에 바늘을 놓고 전후와 정위 프레임의 mediolateral 팔을 움직여 전후 및 mediolateral 좌표를 적용합니다.
  9. 주입 위치에서, 두개골의 높이를 측정하고 브레 그마의 높이로부터 0.3 mm 차이하지 않도록. 약 2mm의 직경 두개골에 구멍을 뚫는다. 경질의 높이를 측정,이 dorsoventral 좌표를 적용 할 기준이 될 것입니다. 또는 두개골 (0.9 mm)에 대한 고정 된 두께를 뺍니다.
  10. 26 게이지 바늘을 사용하여 경질 침투 살균 티슈로 피를 흡수한다. 모든 출혈을 진행하기 전에 멈출 때까지 기다립니다.
  11. 천천히 (좌표 dorsoventral) 10 μL의 미세 주입 주사기가 미리 결정된 깊이로 뇌에 벡터 솔루션과 함께 미리로드 삽입합니다. 장소에 바늘로 1 분을 기다립니다. 3 μl를 주입0.25 μL의 처리량 동력 미세 주입 펌프를 사용하여 (rAAV2 / 7 α-SYN 또는 eGFP는 제어 벡터의 3.0 E11 게놈 복사 / ㎖ (중간 벡터 투여) 또는 1.0 E12 GC / ㎖ (높은 벡터 복용량)) 벡터 솔루션 / 분.
  12. 주사 후, 천천히 제거하기 전에 다른 5 분 위치에 바늘을 유지. 코팅 꼰 폴리 에스테르 3.0을 사용하여 두피 스티치, 70 % 이소프로판올에 1 % jodium로 소독하고 부드럽게 정위 악기에서 동물을 제거합니다. 먼저, 두 귀 바 코와 입을 줄을 풉니 다.
  13. 마취를 바꾸려면, 0.5 ㎎ / ㎏ atipamezole 복강 쥐를 주입하고 깨어 때까지 38 ° C의 가열 접시에 깨끗한 케이지에 쥐를 놓습니다. 체온 저하를 방지하기 위해 용지 담요 쥐 커버.
  14. 첫 번째 시간 동안 음식과 물에 쉽게 액세스를 제공합니다. 처음 몇 일 동안 쥐를 모니터링합니다. 필요한 경우 진통제를 적용합니다.
    주 : t에서 바늘을 제거 할 필요가 없다그는 두개골. 1~2주 후 두개골이 완전히 수리 및 stiches가 느슨해.

비 침습적 PET 영상, 행동 테스트 및 면역 조직 화학적 분석을 사용하여 3 rAAV2의 평가 / 7 α-SYN 주입 된 쥐

  1. (DAT)를 도파민 수송을 정량화 작은 동물 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 및 DA 수송기 등의 추적을 사용하여 결합, 비 침습적 개별 동물에서 시간이 지남에 흑질 선조체 도파민 신경 변성의 역학을 따르 [18 F] -FECT (16) .
  2. 도파민 신경 퇴행의 레벨이 자발적 앞다리 사용을 평가하기 위해, 래트에서 모터의 손상을 유도하는 실린더 시험 쥐 피사체에 충분한 지의 여부를 검사한다.
    1. 후방 후 벽과 착륙을 따라 수직 운동하는 동안 유리 실린더 및 비디오 테이프 동작 넓은 명확한 20cm에서 쥐를 놓습니다. 20 개의 각 앞발에 의해 콘택트 수가 점수콘택트 렌즈. 채점 기준에 대한 자세한 설명을 참조 Schallert 등. (18)는 총 앞다리 접촉의 비율 (왼쪽 플러스 오른쪽 앞발)와 같은 장애 앞다리 연락처 (예를 들어 왼쪽 앞발)의 수를 표현한다.
      주 : 동일하게 두 발을 사용하여 비 병변 대조군이 시험에서 약 50 %의 점수합니다.
  3. 유전자 발현 및 도파민 세포 손실 수준을 평가하기 위해 면역 조직 화학적 (IHC) 분석을 수행한다.
    1. 다른 최종 단계에서, 나트륨 펜 토바 비탈 (60 ㎎ / ㎏, IP)의 과다 복용으로 쥐를 희생하고 PBS (19)의 4 % 파라 포름 알데히드 다음 차가운 식염수로 intracardial 관류를 수행합니다. 밤새 4 ° C에서 뇌를 흥분시키는 및 진동 마이크로톰을 사용하여 50 μm의 두께 코로나 뇌 부분을 잘라.
    2. α-SYN 발현 수준 및 제작을 분석 α-SYN 및 티로신 히드 록 실라 제에 대한 항체를 사용하여 자유 부동 부분에 IHC 염색을 수행신경 퇴행 (16)의 VEL.

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결과

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실험의 전체적인 구조는도 1에 도시되어있다

A53T α-SYN의 rAAV 칠분의이 매개 과발현은 도파민에 의존하는 모터 적자를 유도한다.
α-SYN 과발현 레벨 래트 모터 손상을 유도하기에 충분한 지의 여부를 조사하기 위해, 우리는 자발적 앞다리 사용 (도 3A)을 평가하기 위해 실린더 시험 랫트를 실시. 삼주에서 주사 후, 상당한 모터의 손상은 투여 A53T의 α-SYN rAAV2 / 7 벡터의 3.0 E11 GC / ㎖를받은 쥐에서 관찰되었다. 주입 후 사주에서 자발적 반대측 (좌측) 앞발 사용의 50 % 감소는 eGFP는 rAAV2 / 7 동물을 주입 한 반면 앞발 사용 (도 3b)에는 비대칭 없었다 관찰 하였다. 높은 A53...

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토론

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프로토콜 내에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 벡터 역가뿐만 아니라 벡터 순도는 직접 모델 표현형 결과에 영향을 미친다. 과도한 벡터 역가 또는 불충분하게 정제 된 벡터 배치가 아닌 특정 독성이 발생할 수 있습니다. 따라서, 높은 품질 벡터 배치 및 적절한 제어 벡터의 사용은 필수적이다. 또한, 고정대에 쥐의 머리의 정확한 위치와 좌표의 정확한 결정은 흑질 타겟팅 필수적이다. 주사 부위에 두개골에 구멍을 시추 한 결과, 여백을 건드리지 않고 바로 쥐의 뇌에 바늘을 삽입하는 것이 중요하다. 바늘 천천히 벡터 누출을 방지하기 위해, 바이러스 벡터를 주입 한 후 제거되어야한다. 마지막으로, 봉합 후에 두피 다른 동물의 stiches 팅을 방지하기 위해 70 % 이소프로판올 1 % jodium 살균한다. 또는 다른 방부제 시약사용될 수있다.

설명 된 방법은 또한 파킨슨 병 24 rAAV2 / 7 α-SYN 계 생쥐 모델을 개발하는데 사용될 수있다. 생쥐에서는 ...

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공개 사항

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저자는 관심의 실제 또는 잠재적 충돌이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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저자는 뛰어난 기술 지원을 요리스 반 Asselberghs 앤 반 Santvoort 감사합니다. 연구는 EC-FP6 프로그램 'DiMI'(LSHB-CT-2005-512146), FP7 RTD 프로젝트 MEFOPA (HEALTH에 의해, IWT-데런 (/ 80020 IWT SBO), FWO 데런 (G.0768.10)에 의해 투자되었다 -2009-241791), FP7 프로그램 'INMiND'(HEALTH-F2-2011-278850), KU 루벤 (IOF-KP / 07 / 001, m / 08 / 052A, IMIR PF / 10 / 017), 및 MJFox 재단 (대상 확인 2010). A. 반 데르 Perren와 C. Casteels는 과학 연구의 플랑드르 기금의 박사 후 동료입니다. K. 반 Laere는 과학 연구의 플랑드르 기금의 수석 임상 사람이다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
암컷 8주 된 Wistar 쥐Janvier/200-250 g
케타민 (Nimatek)Eurovet 동물 건강804132
Medetomidine (Dormitor)Orion-Pharma/ Janssen 동물 건강1070-499
  두피와 귀를 위한 국소 마취제: Xylocaï ne 2% 젤Astrazeneca0137-547
TerramycinePfizer0132-472
Bupré 노르핀 (Vetergesic)Ecuphar2623-627
Jodium 1% 이소프로판올VWR0484-0100
스테레오택틱 헤드 프레임Stoeling/
Hamilton 주사기 (30 게이지 -20 mm -pst 2)Hamilton/ Filter Service7803-07
atipamezole (Antisedan)Orion-Pharma/Elanco1300-185
rAAV A53T & 알파, -SYN 벡터LVVC, KU Leuven/https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/
나트륨 펜토 바르비탈 (Nembutal)Ceva Sant é0059-444
마이크로톰MicromHM650
토끼 다클론 시누클레인 AbChemicon50381:5,000
토끼 다클론 TH AbChemicon1521:1,000
루테튬 옥시오르토실리케이트 검출기 기반 FOCUS 220 단층 촬영Siemens/ Concorde Microsystems/
radioligand: 18F-FECT사내/
L-도파: Prolopa 125Roche6 mg/kg ip.
DMEM, GlutamaxLife TechnologiesN° 31331-093
태아 소 혈청Life TechnologiesN° 10270-106
25 kD 선형 폴리에틸렌이민 (PEI)Polysciences/
OptiPrep 밀도 그라디언트 매체: 요오딕사놀시그마D1556-250ML
OptimenLife TechnologiesN° 51985-026
Paxinos 1 watston steretactic atlas, 제 4 판Elsevier/

참고문헌

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