재조합 아데노 - 관련 바이러스 성 벡터의 정위 주사를 통해 파킨슨 병에 대한 알파 - 시누 클레인 기반 쥐 모델 개발

요약

이 원고는 바이러스 벡터 매개 국소 유전자 전달이 어떻게 중추 신경계에서 전이 유전자를 발현하는 매력적인 방법을 제공하는지 설명합니다. 이 프로토콜은 파킨슨병에 대한 바이러스 벡터 기반 동물 모델을 개발하기 위해 쥐의 흑질에 바이러스 벡터 주입을 수행하기 위한 모든 중요한 단계를 설명합니다.

초록

파킨슨 병 (PD)의 분자 경로를 연구하고 새로운 치료 전략을 개발하기 위해, 과학 연구자들은 동물 모델에 의존한다. PD 관련 유전자의 확인은 유전 PD 모델의 개발을 유도 하였다. 대부분의 유전자 변형 α-SYN 마우스 모델은 점진적 α-SYN 병리학을 개발하지만 분명 도파민 세포의 손실 및 도파민 의존 행동 적자를 표시하지 못합니다. 이 장애물은 PD 관련 유전자를 과발현 바이러스 벡터와 흑색질의 직접 타겟팅에 의해 극복되었다. 바이러스 벡터를 사용하여 로컬 유전자 전달은 중추 신경계의 유전자를 발현하는 매력적인 방법을 제공한다. 뇌의 특정 영역 (예 흑색질) 대상이 될 수있는 발현 성인 환경에서 발생 될 수 있으며, 높은 발현 수준이 달성 될 수있다. 또한, 다양한 바이러스 벡터에 따라 서로 다른 시스템을 사용할 수있다. 이 프로토콜은 바이러스 벡터를 수행하기 위해 모든 중요한 단계를 설명쥐의 흑색질 주사 파킨슨 질환 바이러스 벡터 기반의 α- 시누 클레인의 동물 모델을 개발한다.

서론

PD의 기전을 연구하고, 새로운 치료 전략을 개발 밀접 인간 PD의 병리학 생리학 모터 증상 유사한 동물 모델에 대한 긴급한 필요성이있다. 높은 예측도는, 더 나은 우리는 환자에게 동물 모델에서 새로운 치료법을 변환 할 수 있습니다.

1997 년 제 PARK 유전자 등의 α- 시누 클레인의 발견 (α-SYN)가 제 유전자 PD 모델의 개발을 이끌었다. 인간 야생형 (WT) 또는 돌연변이 (A30p의, A53T)를 과발현 많은 형질 전환 마우스 α-SYN은 지난 10 년 동안 생성되었습니다. α-SYN 과발현의 수준은 병리학의 발전에 중요한 것으로 입증했습니다. 또한 마우스 균주 내생 α-SYN 및 전장 또는 절단 된 형태의 발현 여부 유무 (Magen 및 Chesselet ^(1)에 의한 심층 분석) 역할을한다. WT 인간의 여러 임상 돌연변이 모두의 과발현 및# 945; 형질 전환 마우스에서 -SYN은 α-SYN의 병리학 적 축적과 신경 기능 장애 ^2-6을 유도한다. 그러나 지금은 대부분의 형질 전환 α-SYN 마우스 모델은 분명 도파민 세포의 손실 및 도파민 의존 행동 적자를 표시하는 데 실패 할 때까지.

이 장애물은 α-SYN를 과발현 바이러스 ....

프로토콜

모든 동물 실험은 루벤 대학의 생명 윤리위원회 (벨기에)에 의해 1986년 11월 24일 (6백9분의 86 / EEC)의 유럽 공동체위원회 지침에 따라 수행하고 승인됩니다.

1. 재조합 AAV 생산 및 정제

참고 : 이전에 ¹⁷ 설명 된대로 rAAV 벡터의 생산 및 정제 루벤 바이러스 성 벡터 코어 (LVVC)에 의해 수행되었다.

1. 간단히, 트랜 subconfluent 낮은 (<50) 통로 25kD 선형 폴리에틸렌 이민 (1)의 비율을 150 nm의 NaCl 형질 용액 및 세 가지 플라스미드를 사용하여 점착성 HEK의 293T 세포 : DMEM 배지 2 % 소 태아 혈청을 1 : 1. 5 % CO _2, 37 ℃에서 24 시간 배양 후, 새로운 DMEM 배지 2 % 태아 소 혈청 배지를 교체한다.
   주 : 플라스미드 AAV7 혈청 형에 대한 구조를 포함 CMVie의 제어하에 SYN α-A53T 인간 변이체를 코딩 AAV 전송 플라스미드 synaps 향상된IN1 프로모터와 pAdvDeltaF6 아데노 바이러스 도우미 플라스미드 ^17.
2. 일시적 형질 전환 후 매체 오일 수확과 접선 흐름 여과 ^(17)를 사용하여 집중한다.
3. iod....

결과

실험의 전체적인 구조는도 1에 도시되어있다

A53T α-SYN의 rAAV 칠분의이 매개 과발현은 도파민에 의존하는 모터 적자를 유도한다.
α-SYN 과발현 레벨 래트 모터 손상을 유도하기에 충분한 지의 여부를 조사하기 위해, 우리는 자발적 앞다리 사용 (도 3A)을 평가하기 위해 실린더 시험 랫트를 실시. 삼주에서 주사 후, 상당한 모터의 손상은 투여 A53T의 α-SYN rAAV2 / 7 벡터의 3.0 E11 GC / ㎖를받은 쥐에서 관찰되었다. 주입 후 사주에서 자발적 반대측 (좌측) 앞발 사용의 50 % 감소는 eGFP는 rAAV2 / 7 동물을 주입 한 반면 앞발 사용 (도 3b)에는 비대칭 없었다 관찰 하였다. 높은 A53.......

토론

프로토콜 내에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 벡터 역가뿐만 아니라 벡터 순도는 직접 모델 표현형 결과에 영향을 미친다. 과도한 벡터 역가 또는 불충분하게 정제 된 벡터 배치가 아닌 특정 독성이 발생할 수 있습니다. 따라서, 높은 품질 벡터 배치 및 적절한 제어 벡터의 사용은 필수적이다. 또한, 고정대에 쥐의 머리의 정확한 위치와 좌표의 정확한 결정은 흑질 타겟팅 필수적이다. 주사 부위에 두개골에 구멍을 시추 한 결과, 여백을 건드리지 않고 바로 쥐의 뇌에 바늘을 삽입하는 것이 중요하다. 바늘 천천히 벡터 누출을 방지하기 위해, 바이러스 벡터를 주입 한 후 제거되어야한다. 마지막으로, 봉합 후에 두피 다른 동물의 stiches 팅을 방지하기 위해 70 % 이소프로판올 1 % jodium 살균한다. 또는 다른 방부제 시약사용될 수있다.

설명 된 방법은 또한 파킨슨 병 ²⁴ rAAV2 / 7 α-SYN 계 생쥐 모델을 개발하는데 사용될 수있다. 생쥐에서는 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
암컷 8주 된 Wistar 쥐	Janvier	/	200-250 g
케타민 (Nimatek)	Eurovet 동물 건강	804132
Medetomidine (Dormitor)	Orion-Pharma/ Janssen 동물 건강	1070-499
두피와 귀를 위한 국소 마취제: Xylocaï ne 2% 젤	Astrazeneca	0137-547
Terramycine	Pfizer	0132-472
Bupré 노르핀 (Vetergesic)	Ecuphar	2623-627
Jodium 1% 이소프로판올	VWR	0484-0100
스테레오택틱 헤드 프레임	Stoeling	/
Hamilton 주사기 (30 게이지 -20 mm -pst 2)	Hamilton/ Filter Service	7803-07
atipamezole (Antisedan)	Orion-Pharma/Elanco	1300-185
rAAV A53T & 알파, -SYN 벡터	LVVC, KU Leuven	/	https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/
나트륨 펜토 바르비탈 (Nembutal)	Ceva Sant é	0059-444
마이크로톰	Microm	HM650
토끼 다클론 시누클레인 Ab	Chemicon	5038	1:5,000
토끼 다클론 TH Ab	Chemicon	152	1:1,000
루테튬 옥시오르토실리케이트 검출기 기반 FOCUS 220 단층 촬영	Siemens/ Concorde Microsystems	/
radioligand: 18F-FECT	사내	/
L-도파: Prolopa 125	Roche		6 mg/kg ip.
DMEM, Glutamax	Life Technologies	N° 31331-093
태아 소 혈청	Life Technologies	N° 10270-106
25 kD 선형 폴리에틸렌이민 (PEI)	Polysciences	/
OptiPrep 밀도 그라디언트 매체: 요오딕사놀	시그마	D1556-250ML
Optimen	Life Technologies	N° 51985-026
Paxinos 1 watston steretactic atlas, 제 4 판	Elsevier	/