척추 상상돌기는 통증 인식 및 기타 행동에 중요하며, 세로토닌 섬유는 이러한 섬유 시스템 중 하나입니다. 본 연구는 이러한 세로토닌 섬유의 종결을 조사하기 위해 결합된 CLARITY/CUBIC 프로토콜을 마우스 척수에 적용하는 데 중점을 두었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
척수 긴 하강 섬유 운동 통증 지각, 및 다른 동작을 위해 필수적이다. 이러한 섬유 시스템의 대부분의 척수 광섬유 종단 패턴 철저 종 조사되지 않았다. 척수 돌출 세로토닌 섬유, 조직 학적 섹션에 쥐 주머니쥐 연구되었으며 기능적 의미는 척수에서의 광섬유 종단 패턴에 기초하여 도출되었다. 명확성과 CUBIC 기술 개발과 함께,이 광 시스템 및 세로토닌 척 주상 경로의 알려지지 않은 특징을 밝힐 가능성 척수에서의 분포를 조사하는 것이 가능하다. 여기서는 결합 선명도 CUBIC 기술을 사용하여 마우스 척수 세로토닌 섬유 영상화 상세한 프로토콜을 제공한다. 방법은 COMBIN와 조직 겔 용액 설명과 마우스의 관류를 포함시약을 삭제의 ATION. 척수 조직 바로 아래 2 주 클리어하고, 세로토닌에 대한 후속 면역 염색 미만 십일 년에 완성되었다. 다중 광자 형광 현미경으로 조직을 검사하고, 3D 이미지 Osirix 소프트웨어를 사용하여 재구성 하였다.
서론
척추 돌기는 통증 인식과 같은 다양한 행동의 조절을 담당합니다. 통각(유해) 정보를 전달하는 돌기 중 하나는 후뇌 랩(hindbrain raphe)과 인접한 망상핵(reticular nuclei)1,2에서 유래한 세로토닌 섬유(serotoninergic fibers)를 포함하고 있습니다. 생리학적 및 약리학적 연구는 후뇌의 강간핵에 대한 전기 자극 후 척수의 등쪽 뿔에서 세로토닌 방출이 증가한다는 것을 입증했습니다3-5. 쥐와 주머니쥐에서 세로토닌성 랩척수 섬유는 등쪽 뿔6-8뿐만 아니라 중간 영역7,9,10, 복부 뿔7,11, 심지어 얇은 판 1012,13에도 조밀한 말단을 가지고 있습니다. 마우스에 대한 유사한 연구는 없습니다. 본 연구는 최근 발표된 CLARITY14 방법과 그 변형인 CUBIC15를 사용하여 쥐의 척수에서 후뇌 강피 핵과 인접한 망상 핵에서 발생하는 세로토닌 섬유의 종결 패턴을 매핑하는 것을 목표로 했습니다.
척수의 기존 형광 또는 과산화효소 면역조직화학은 30-40μm 두께의 단면에서 척수의 회백질에서 세로토닌 섬유의 분포를 명확하게 보여줍니다. 그러나 이 접근....
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프로토콜
윤리 문 : 동물 과목을 포함하는 모든 절차 (승인 ACEC 번호 14 / 94A입니다) 뉴 사우스 웨일즈 대학의 동물 관리 및 윤리위원회 (ACEC)의 지침을 따르십시오.
투명 마우스 척수 1. 준비
- 아이스 콜드 하이드로 겔 용액의 조제
- 16 % 파라 포름 알데히드 용액의 조제 (PFA)
- 70 ml의 미리 예열 증류수 (50-55 °에 C)에 16g 파라 포름 알데히드 분말을 추가하고 파라 포름 알데히드가 용해 될 때까지 가열 자석 교반기에서 교반한다. 참고 :이 솔루션은 이상 55 ° C 열 및 파라 포름 알데히드는 독성이 알고 있어야하는 것을 허용하지 않습니다.
- 실린더에 파라 포름 알데히드 용액을 전송하고 100 ㎖에 증류수를 추가합니다. 4 ℃의 냉장고를 사용하여 파라 포름 알데히드 용액을 냉각.
- 증류수 26.25 mL에 125 mg의 VA-044 개시제를 용해 4 용액을 냉각C의 냉장고 °.
- 차가운 5 ㎖ 아크릴 아미드 수용액 (40 %) 1.25 mL의 비스 용액 (2 %) (주의 : 비스 아크릴 아미드 솔루션은 유전 적 결함이나 암을 유발할 수 있고, 독성), 5 ㎖의 10 배 PBS, 12.5 ml의 1....
- 16 % 파라 포름 알데히드 용액의 조제 (PFA)
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결과
이 섹션은 명확성과 CUBIC 프로토콜의 조합을 사용하여 투명 마우스 척수 세로토닌 항체 염색의 결과를 나타낸다. 우리는 (또한 비디오 (1) 그림 1 참조) 세로토닌 섬유는 복부 뿔의 복부 부분에서 우위와 척수의 모든 라미에 존재하는 것으로 나타났다. 제어 조직은 긍정적 인 섬유 (결과가 표시되지 않은)하지 않았다. 복부 호른에서 조밀 세로토닌 섬유 복부 혼 ventromedial 부분에 존재하고 이들이 복부 혼 측방으로 연장 (도 2,도 비디오 2 참조). 일부 면역 양성 섬유는 또한 후각 또는 중앙 운하쪽으로 복부 혼에서 확장 할 수 있습니다. 면역 양성 섬유 후각 모든 엽층에 존재하지만, 양의 섬유 사이의 작은 갭은, 특히 횡 방향으로 라미 나 (2, 4)에 존재후각의 일부. 후각에서 세로토닌 섬유의 대부분은 작은 직경이고 그 중 소수는 큰 .......
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토론
이 프로토콜은 결합 된 선명도와 CUBIC 기술로 마우스 척수의 이미지 세로토닌 섬유하는 방법을 보여줍니다 설명했다. 이 청 등. 14 토 메르 외. (15)에 의해 개발 된 수동적 지우기 프로토콜에 비해 빨리 소거 과정을 소개하고 척수 조직이 아니라 클리어시 하이드로 겔에 의해 지원 될 수있다.
청 등. (14)와 토 메르 등. (15)에 의해보고 된 마우스 척수의 고정시 중요한 단계는 모든 솔루션은 화학 물질의 중합을 방지 얼음에 냉각 유지하는 것입니다. 다른 중요한 단계는 신경 조직의 팽창을 방지하기 위해 하이드로 겔 용액으로 천천히 마우스 관류한다. 겔 용액을 겔화하기 위해서는 탈이 요구된다. 이에 대한 대안으로, 우리는 HYD 사이에 공기 방울이 튜브의 상단을 덮도록 파라 필름을 사용하지 않고 남겨rogel 솔루션 및 파라 필.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 호주 연구 위원회 통합 뇌 기능을 위한 우수 센터(ARC Centre Grant CE140100007), NHMRC 프로젝트 보조금(#1086643)의 지원을 받았습니다. George Paxinos 교수는 NHMRC 보조금(#1043626)의 지원을 받고 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 광개시제 VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| 40% 아크릴아미드 용액 | Bio Rad | 161-0140 | http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution |
| 2% Bis 용액 | Bio Rad | 161-0142 | http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d |
| 파라포름알데히드 | 시그마 | 158127 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en®ion=AU |
| 요소 | 머크 밀리포어 | 66612 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612 |
| N,N,N',N'-테트라키스(2-하이드록시프로필) 에틸렌디아민 | 머크 밀리포어 | 821940 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-테트라-2-프로판올,MDA_CHEM-821940 |
| 트리톤-X 100 | 머크 밀리포어 | 648462 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462 |
| 자당 | Sigma | S0389 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en®ion=AU |
| 세로토닌 항체 | Merck Millipore | AB938 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938 |
| 염소 안티 토끼 IgG (H+L) 보조 항체, Alexa Fluor® 594 conjugate | Life Technologies | A-11012 | https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| 다광자 현미경 | Leica | Leica TCS SP5 MP STED | http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/ |
참고문헌
- Rivot, J. P., Chaouch, A., Besson, J. M. Nucleus raphe magnus modulation of response of rat dorsal horn neurons to unmyelinated fiber inputs: partial involvement of serotonergic pathways. J Neurophysiol. 44 (6), 1039-1057 (1980).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C.
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