이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

CLARITY를 사용하여 마우스 척수에서 세로토닌 섬유 이미징 / CUBIC 기술

10.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53673

⸱

2016년 2월 26일

 ,  , 
1Brain Structure and Function Group, Neuroscience Research Australia, 2School of Medical Sciences, The University of New South Wales

이 논문에서

요약

척추 상상돌기는 통증 인식 및 기타 행동에 중요하며, 세로토닌 섬유는 이러한 섬유 시스템 중 하나입니다. 본 연구는 이러한 세로토닌 섬유의 종결을 조사하기 위해 결합된 CLARITY/CUBIC 프로토콜을 마우스 척수에 적용하는 데 중점을 두었습니다.

초록

척수 긴 하강 섬유 운동 통증 지각, 및 다른 동작을 위해 필수적이다. 이러한 섬유 시스템의 대부분의 척수 광섬유 종단 패턴 철저 종 조사되지 않았다. 척수 돌출 세로토닌 섬유, 조직 학적 섹션에 쥐 주머니쥐 연구되었으며 기능적 의미는 척수에서의 광섬유 종단 패턴에 기초하여 도출되었다. 명확성과 CUBIC 기술 개발과 함께,이 광 시스템 및 세로토닌 척 주상 경로의 알려지지 않은 특징을 밝힐 가능성 척수에서의 분포를 조사하는 것이 가능하다. 여기서는 결합 선명도 CUBIC 기술을 사용하여 마우스 척수 세로토닌 섬유 영상화 상세한 프로토콜을 제공한다. 방법은 COMBIN와 조직 겔 용액 설명과 마우스의 관류를 포함시약을 삭제의 ATION. 척수 조직 바로 아래 2 주 클리어하고, 세로토닌에 대한 후속 면역 염색 미만 십일 년에 완성되었다. 다중 광자 형광 현미경으로 조직을 검사하고, 3D 이미지 Osirix 소프트웨어를 사용하여 재구성 하였다.

서론

척추 돌기는 통증 인식과 같은 다양한 행동의 조절을 담당합니다. 통각(유해) 정보를 전달하는 돌기 중 하나는 후뇌 랩(hindbrain raphe)과 인접한 망상핵(reticular nuclei)1,2에서 유래한 세로토닌 섬유(serotoninergic fibers)를 포함하고 있습니다. 생리학적 및 약리학적 연구는 후뇌의 강간핵에 대한 전기 자극 후 척수의 등쪽 뿔에서 세로토닌 방출이 증가한다는 것을 입증했습니다3-5. 쥐와 주머니쥐에서 세로토닌성 랩척수 섬유는 등쪽 뿔6-8뿐만 아니라 중간 영역7,9,10, 복부 뿔7,11, 심지어 얇은 판 1012,13에도 조밀한 말단을 가지고 있습니다. 마우스에 대한 유사한 연구는 없습니다. 본 연구는 최근 발표된 CLARITY14 방법과 그 변형인 CUBIC15를 사용하여 쥐의 척수에서 후뇌 강피 핵과 인접한 망상 핵에서 발생하는 세로토닌 섬유의 종결 패턴을 매핑하는 것을 목표로 했습니다.

척수의 기존 형광 또는 과산화효소 면역조직화학은 30-40μm 두께의 단면에서 척수의 회백질에서 세로토닌 섬유의 분포를 명확하게 보여줍니다. 그러나 이 접근법은 백질에서 세로토닌 섬유관(serotonergic fiber tract)의 연속성과 회백질에서 그 담보(collateral)의 연속성을 보여주지 않습니다. 조직학적 단면의 3D 재구성이 섬유관에 대한 우리의 지식을 발전시켰지만, 절단으로 인한 조직의 작은 왜곡으로 인해 조직학자와 해부학자들이 단일 관을 따라가는 것은 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 이러한 장애를 피하기 위해 많은 연구자들이 전체 조직 구조를 투명하게 만들고 변경되지 않은 조직의 이미지를 단일 비디오 파일17-21에서 수집하기 위한 다양한 프로토콜을 개발했습니다. 지금까지는 Deisseroth의 그룹14,15에 의해 개발된 투명, 지질 교환, 아크릴아미드 혼성화, 경질, 이미징/면역염색 호환, 조직 하이드로겔(CLARITY) 기술과 Susaki etal 16에 의해 개발된 CUBIC이 가장 성공적이다. 프로토콜이 발표된 이후 많은 연구자들은 이러한 기술을 사용하여 뇌22-25뿐만 아니라 심장, 신장, 장 및 폐26,27를 포함한 생물학적 조직의 다양한 측면을 조사하기 시작했습니다.

하이드로겔 용액(CLARITY)으로 마우스 척수를 고정하고 CUBIC 시약으로 투명화함으로써(원래 CLARITY 프로토콜14,15에 설명된 것보다 훨씬 빠른 방법) 2-3mm 길이의 척수 조직 블록을 2주 이내에 제거하고 세로토닌에 대한 면역형광 염색을 8일 만에 완료했습니다. 화학 작용제의 조합만으로 기존의 면역조직화학을 사용하여 약 1개월 만에 3D 비디오 파일의 개별 섬유 관의 이미지를 생성할 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

윤리 문 : 동물 과목을 포함하는 모든 절차 (승인 ACEC 번호 14 / 94A입니다) 뉴 사우스 웨일즈 대학의 동물 관리 및 윤리위원회 (ACEC)의 지침을 따르십시오.

투명 마우스 척수 1. 준비

  1. 아이스 콜드 하이드로 겔 용액의 조제
    1. 16 % 파라 포름 알데히드 용액의 조제 (PFA)
      1. 70 ml의 미리 예열 증류수 (50-55 °에 C)에 16g 파라 포름 알데히드 분말을 추가하고 파라 포름 알데히드가 용해 될 때까지 가열 자석 교반기에서 교반한다. 참고 :이 솔루션은 이상 55 ° C 열 및 파라 포름 알데히드는 독성이 알고 있어야하는 것을 허용하지 않습니다.
      2. 실린더에 파라 포름 알데히드 용액을 전송하고 100 ㎖에 증류수를 추가합니다. 4 ℃의 냉장고를 사용하여 파라 포름 알데히드 용액을 냉각.
    2. 증류수 26.25 mL에 125 mg의 VA-044 개시제를 용해 4 용액을 냉각C의 냉장고 °.
    3. 차가운 5 ㎖ 아크릴 아미드 수용액 (40 %) 1.25 mL의 비스 용액 (2 %) (주의 : 비스 아크릴 아미드 솔루션은 유전 적 결함이나 암을 유발할 수 있고, 독성), 5 ㎖의 10 배 PBS, 12.5 ml의 16 % PFA 용액 및 얼음 VA-044의 개시제 용액.
    4. 얼음 위의 솔루션을 섞는다.
      주 : 전량을 50 ㎖이다.
  2. 마우스 척수의 관류 및 컬렉션
    1. 0.9 % 생리 식염수에 희석 케타민 (80 ㎎ / ㎏) 및 xyzaline (5 ㎎ / ㎏)의 복강 내 주사로 마우스를 마취. 마우스의 투여 량은 생쥐의 경우보다 더 낮을 수있다.
    2. 마우스가 다리의 피부에 핀치에 응답하지 않습니다 일단 흄 후드에 적합한 플라스틱 표면에, (접착 테이프가 효과가있다) 떨어져 몸에서 마우스의 사지를 고정합니다.
    3. 가슴 위에 마우스 피부를 잘라 후 뼈 가슴은 가위로 가슴을 노출.
    4. 25 G 바늘 토륨에 부착하여, 연동 펌프를 사용하여튜브의 E 단부는 심장의 좌심실로 니들을 삽입 약 10 ㎖ / 분의 속도를 피 종료점을 만든 다음 40 ml의 0.9 % 생리 식염수로 세정을 시작 우심방 자르지.
    5. 완료되면, 35 ml의 차가운 얼음 하이드로 겔 용액으로 마우스를 관류.
      참고 : 10 ML의 속도로 관류 / 분 신경 조직의 부종을 방지 할 수 있습니다.
    6. 블레이드와 뒷면에 피부를 절개하고 척추 옆 근육을 제거합니다. 일측에 척추 아치를 절단하고, 다른 쪽에게 튀기는 후 미세 시저와 척주에서 척수를 취할.
  3. 마우스 척수 지우기
    1. 밤새 4 ℃에서 하이드로 겔 용액을 15 ml의에서 척수를 놓습니다.
    2. 겔 용액 10 ㎖를 제거하고 5 ㎖ 튜브에 척수 세그먼트 용액의 나머지를 붓는다. 그것이 완전히 찰 때까지 겔 용액 5 ㎖ 튜브를 채우기.
    3. 5 ㎖ 튜브의 맨 위에 파라 필름의 작은 조각을 스트레칭 후 튜브 목 파라 필름 랩. 참고 : 파라 필름 접촉을 하이드로 겔 솔루션을 확인하고 하이드로 겔 용액과 파라 필름 사이에 거품이 없습니다.
    4. 37 년 5 ML 튜브를 넣어   ° C 오븐에서 밤새. 이 겔하게까지 하이드로 겔 솔루션을 관찰한다.
    5. 오븐에서 5 ML 튜브를 타고 (예 : 삽 1 ML의 피펫 팁 등) 스패너와 튜브에서 젤을 제거합니다. 겔에 거친 조직을 고집하여 척수 조직에서 젤을 제거하고 (겔 조직에 충실하고, 따라서 조직에 의해 제거됩니다) 떨어진 거친 조직을.
    6. 척수 조직으로부터 겔을 제거 후, ​​쉐이커상에서 24 시간 동안 1X PBS (PH 7.4)와 척수 4 회 반복한다.
    7. 3.85 g의 우레아 및 385 g의 N, N, N ', N'- 테트라 키스 (2- 히드 록시 프로필) ethylenediam 용해 CUBIC 클리어 용액을 준비5.38 용액에 오프라인은 증류수.
      주 : 뜨거운 교반기가 사용됩니다. 분명히하고 실온까지 냉각 후, 용액에 2.31 g의 폴리에틸렌 글리콜 모노 메틸 -p- isooctylphenyl 에테르 / 트리톤 X-100을 추가한다.
      참고 :이 세 가지 화학 물질 10 g을 하나의 마우스입니다.
    8. 면도날 2-3 mm 길이 세그먼트로 coronally 마우스 척수를 잘라 위의 CUBIC 청소 용액 5 ㎖로했습니다. 37 ℃ 오븐에서 진탕 놓고   3 일간 C를 °.
    9. 3 일 후 새로운 하나에 청소 솔루션을 변경합니다. 주 : 상기 용액은 사용 전에 제조한다.
    10. 2 ~ 3 일 후에 CUBIC 청소 솔루션을 새로 고침 후, 글꼴 8 문자 용지에 조직의 투명성을 확인합니다. 이 투명한 경우, 글자 삭제 조직을 통해 알 수있다. (0.1 % 트리톤-X100)는 조직 4 회 (6 시간마다)을 씻어 청소 용액을 제거하고 PBST의 4를 가하여.

2를. 면역 형광 염색법

  1. 37 ° C 오븐에서 진탕 기에서 3 일 : 차 항체 용액에서 척수 세그먼트를 품어 (PBST 100 항 세로토닌은 토끼에서 제기, 1 희석).
  2. 항체 용액을 제거하고 4 PBST를 가하여 (0.1 % 트리톤 X100)는 37 ° C의 오븐에서 척수 세그먼트 4 회 (매 6 시간)을 씻어.
  3. 37 ° C 오븐에서 진탕 기에서 3 일간 조직을 배양 : PBST 용액을 제거하고 이차 항체 솔루션을 추가 (PBST 100 594 복합 염소 항 - 토끼 IgG의를 1 희석).
  4. 이차 항체 용액을 제거하고 37 ° C 오븐에서 통에 하루 척수 세그먼트 4 번 씻어 (6 시간마다) PBST 4를 가하여. 다음날 조직 이미징을위한 준비가되어 있습니다.

3. 이미지

  1. PBST 용액을 제거하고, 심지어 조직의 굴절률을 85 % 글리세롤 (4)를 가하여.
    2. 조직의 선명도를 확인합니다. 그것은 약 1 시간 분명되면 멀티 포토 형광 현미경 유지 프레임 맞는 크고 얇은 유리 슬라이드 상 조직을 넣어.
  2. 척수 조직 옆에 85 % 글리세롤을 몇 방울을 넣어 22 X 50mm 유리 커버 슬립이 그것을 커버 슬립.
    참고 : 척수의 방향은 이미지가 어떻게 보이는지를 결정한다.
  3. 다중 광자 형광 현미경의 유지 프레임에 유리 슬라이드를 넣고 빛 경로로 조직을 이동합니다.
  4. 헬륨 네온 레이저 라인 594 nm의 선택 및 라이브 화상에 양 신호의 밝기를 검사하여 최적의 레벨로 레이저의 세기를 조절한다.
  5. (물, NA 0.7) 20X 대물 렌즈를 이용하여 척수 조직의 스캔 영역을 선택하고, Z 스택을 만들 준비하고,이 3 μm로 설정된 각 단계의 깊이.
  6. 20X 미만의 objec Z 스택의 상단부터 하단까지의 조직을 검사적인하고 (오일 중, NA 1.4)를 63X 대물 각각 (스텝 크기는 1 ㎛였다). 3D 소프트웨어 (28)를 이용하여 3 차원 영상을 재구성한다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

이 섹션은 명확성과 CUBIC 프로토콜의 조합을 사용하여 투명 마우스 척수 세로토닌 항체 염색의 결과를 나타낸다. 우리는 (또한 비디오 (1) 그림 1 참조) 세로토닌 섬유는 복부 뿔의 복부 부분에서 우위와 척수의 모든 라미에 존재하는 것으로 나타났다. 제어 조직은 긍정적 인 섬유 (결과가 표시되지 않은)하지 않았다. 복부 호른에서 조밀 세로토닌 섬유 복부 혼 ventromedial 부분에 존재하고 이들이 복부 혼 측방으로 연장 (도 2,도 비디오 2 참조). 일부 면역 양성 섬유는 또한 후각 또는 중앙 운하쪽으로 복부 혼에서 확장 할 수 있습니다. 면역 양성 섬유 후각 모든 엽층에 존재하지만, 양의 섬유 사이의 작은 갭은, 특히 횡 방향으로 라미 나 (2, 4)에 존재후각의 일부. 후각에서 세로토닌 섬유의 대부분은 작은 직경이고 그 중 소수는 큰 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

이 프로토콜은 결합 된 선명도와 CUBIC 기술로 마우스 척수의 이미지 세로토닌 섬유하는 방법을 보여줍니다 설명했다. 이 청 등. 14 토 메르 외. (15)에 의해 개발 된 수동적 지우기 프로토콜에 비해 빨리 소거 과정을 소개하고 척수 조직이 아니라 클리어시 하이드로 겔에 의해 지원 될 수있다.

청 등. (14)와 토 메르 등. (15)에 의해보고 된 마우스 척수의 고정시 중요한 단계는 모든 솔루션은 화학 물질의 중합을 방지 얼음에 냉각 유지하는 것입니다. 다른 중요한 단계는 신경 조직의 팽창을 방지하기 위해 하이드로 겔 용액으로 천천히 마우스 관류한다. 겔 용액을 겔화하기 위해서는 탈이 요구된다. 이에 대한 대안으로, 우리는 HYD 사이에 공기 방울이 튜브의 상단을 덮도록 파라 필름을 사용하지 않고 남겨rogel 솔루션 및 파라 필...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 호주 연구 위원회 통합 뇌 기능을 위한 우수 센터(ARC Centre Grant CE140100007), NHMRC 프로젝트 보조금(#1086643)의 지원을 받았습니다. George Paxinos 교수는 NHMRC 보조금(#1043626)의 지원을 받고 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
광개시제 VA044Wakova-044/225-02111http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
40% 아크릴아미드 용액Bio Rad161-0140http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution
2% Bis 용액Bio Rad161-0142http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31-
879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d
파라포름알데히드시그마158127http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en®ion=AU
요소머크 밀리포어66612http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612
N,N,N',N'-테트라키스(2-하이드록시프로필) 에틸렌디아민머크 밀리포어821940http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-테트라-2-프로판올,MDA_CHEM-821940
트리톤-X 100머크 밀리포어648462http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462
자당SigmaS0389http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en®ion=AU
세로토닌 항체Merck MilliporeAB938http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938
염소 안티 토끼 IgG (H+L) 보조 항체, Alexa Fluor® 594 conjugateLife Technologies  A-11012https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
다광자 현미경LeicaLeica TCS SP5 MP STEDhttp://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/

참고문헌

  1. Rivot, J. P., Chaouch, A., Besson, J. M. Nucleus raphe magnus modulation of response of rat dorsal horn neurons to unmyelinated fiber inputs: partial involvement of serotonergic pathways. J Neurophysiol. 44 (6), 1039-1057 (1980).
  2. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Struct Funct. 215 (3-4), 159-186 (2011).
  3. Sorkin, L. S., McAdoo, D. J., Willis, W. D. Raphe magnus stimulation-induced anti-nociception in the cat is associated with release of amino acids as well as serotonin in the lumbar dorsal horn. Brain Res. 618 (1), 95-108 (1993).
  4. Rivot, J. P., Chiang, C. Y., Besson, J. M. Increase of serotonin metabolism within the dorsal horn of the spinal cord during nucleus raphe magnus stimulation, as revealed by in vivo electrochemical detection. Brain Res. 238 (1), 117-126 (1982).
  5. Hentall, I. D., Pinzon, A., Noga, B. R. Spatial and temporal patterns of serotonin release in the rat's lumbar spinal cord following electrical stimulation of the nucleus raphe magnus. Neuroscience. 142 (3), 893-903 (2006).
  6. Bullitt, E., Light, A. R. Intraspinal course of descending serotoninergic pathways innervating the rodent dorsal horn and lamina X. J Comp Neurol. 286 (2), 231-242 (1989).
  7. Jones, S. L., Light, A. R. Termination patterns of serotoninergic medullary raphespinal fibers in the rat lumbar spinal cord: an anterograde immunohistochemical study. J Comp Neurol. 297 (2), 267-282 (1990).
  8. Marlier, L., Sandillon, F., Poulat, P., Rajaofetra, N., Geffard, M., Privat, A. Serotonergic innervation of the dorsal horn of rat spinal cord: light and electron microscopic immunocytochemical study. J Neurocytol. 20 (4), 310-322 (1991).
  9. Morrison, S. F., Gebber, G. L. Axonal branching patterns and funicular trajectories of raphespinal sympathoinhibitory neurons. J Neurophysiol. 53 (3), 759-772 (1985).
  10. Barman, S. M., Gebber, G. L. The axons of raphespinal sympathoinhibitory neurons branch in the cervical spinal cord. Brain Res. 441 (1-2), 371-376 (1988).
  11. Martin, G. F., Cabana, T., Ditirro, F. J., Ho, R. H., Humbertson, A. O. Jr Raphespinal projections in the North American opossum: evidence for connectional heterogeneity. J Comp Neurol. 208 (1), 67-84 (1982).
  12. Bowker, R. M., Westlund, K. N., Coulter, J. D. Origins of serotonergic projections to the lumbar spinal cord in the monkey using a combined retrograde transport and immunocytochemical technique. Brain Res Bull. 9 (1-6), 271-278 (1982).
  13. Watkins, L. R., Griffin, G., Leichnetz, G. R., Mayer, D. J. Identification and somatotopic organization of nuclei projecting via the dorsolateral funiculus in rats: a retrograde tracing study using HRP slow-release gels. Brain Res. 223 (2), 237-255 (1981).
  14. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  15. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  16. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  17. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  18. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  19. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  20. Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  21. Ertürk, A., Bradke, F. High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO). Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).
  22. Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. Light microscopy mapping of connections in the intact brain. Trends Cogn Sci. 17 (12), 596-599 (2013).
  23. Spence, R. D., et al. Bringing CLARITY to gray matter atrophy. NeuroImage. 101, 625-632 (2014).
  24. Ando, K., et al. Inside Alzheimer brain with CLARITY: senile plaques, neurofibrillary tangles and axons in 3-D. Acta Neuropathol. 128 (3), 457-459 (2014).
  25. Zhang, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Struct Funct. , (2015).
  26. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 781(2015).
  27. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  28. Rosset, A., Spadola, L., Ratib, O. OsiriX: an open-source software for navigating in multidimensional DICOM images. J Digit Imaging. 17, 205-216 (2004).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

CLARITY3D
CLARITY를 사용하여 마우스 척수에서 세로토닌 섬유 이미징 / CUBIC 기술
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.