여기에서는 MF 표현형을 가진 동결된 위, 소장 및 결장 조직 생성 세포에서 1차 섬유아세포/근섬유아세포(MF) 배양을 분리하고 확립하는 프로토콜이 제시됩니다. 이 세포는 CD90, α-SMA 및 비멘틴을 발현합니다. MF는 효소 활성 및 사이토카인 생산을 포함한 다양한 기능 분석에 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
섬유 아세포 / 근육 섬유 모세포 (MFS)의 발병 기전에서의 역할과 종양 미세 환경 모두 상처 치유 및 홍보에 대한 그들의 공헌 증가 주목을 받고있다. 현재 위장관 (GI) 조직에서 MFS의 분리를위한 많은 기술이 있지만,이 프로토콜은 냉동 조직에서 이러한 기질 세포의 분리의 새로운 요소를 소개합니다. GI 조직 표본을 동결하는 것은뿐만 아니라 전 세계적으로 공동, 바이오 뱅크, 상업 공급 업체의 샘플을 수집 할 수있는 연구자가, 그것도 신선한 샘플의 지연 처리를 허용 할 수 있습니다. 설명 프로토콜은 지속적으로 마커 CD90, α-SMA 및 멘틴을 표현 MF 표현형과 특성 스핀들 모양의 세포를 얻을 것입니다. 이러한 세포가 환자 샘플에서 유래 된 바와 같이, 일차 전지의 사용은 질환 상태 - 즉 암 및 염증성 장 질환으로부터 가깝게 모방 MFS의 이점을 부여한다. 이 기술은 꿀벌이N 위, 소장 및 대장 MF 차 문화 발전에 확인. MF 일차 배양 통로 걸쳐 실험의 광대 한 배열로 사용될 수 있고, 그 순도는 모두 면역 세포 화학 분석에 의해 평가하고, 유동 세포 계측법.
서론
근섬유 아세포는 / 섬유 아세포 (MFS)은 위장관 점막 세포의 풍부한 인구를 나타냅니다. 이러한 기질 세포는 상피 아래에 위치하며, 장내 점막 고유 층 내에서 상호 연결된 네트워크를 형성하고 있습니다. MFS하지 외 기질의 증착 만 담당하지만, 분비 조절을 통해 인접한 상피 1, 2의 전해질 수송 반발 및 장벽 기능에 영향을 미칠 수있다. 또한, MFS 염증 및 조직에서 중요한 역할을하는 것으로 나타났다 3,4- 리모델링. 근섬유 아세포는 또한 암 - 관련 아세포로 알려진 종양 미세 환경의 중요한 부분이며, 종양 세포 성장에 기여 암 줄기 세포 (3)에 대한 틈새의 역할을한다. 신흥 데이터는 MFS는 또한 지역의 항원 제시 세포를 제공 할 수 있음을 시사한다. 또한, MFS 기능 타고난 및 적응 면역 반응의 중요한 규제, produ의사이토 카인과 성장 인자 (5)의 다양한 향하도록.
건강한 사람에서, MFS 세포는이 세포는 vimentin에 긍정적이다. 중간 엽 줄기 세포로부터 분화와 그 세포 표면, 중간 엽 마커, CD90 3, 5에 표현하는 것으로되어 있지만, 상피 및 조혈 세포 마커는 EpCAM과 CD45에 대한 부정적인 각각. 근섬유 아세포가 섬유 아세포의 활성화 된 형태로 제시되고, α-SMA (5)의 식에 의해 비 활성화 된 섬유 아세포에서 구별 될 수있다.
지난 10 년 동안, 인간 대장 점막에서 근육 섬유 모세포의 분리를위한 여러 방법이 게시-주로 원래 Mahida 외. 5-8에서 기술 된 방법에 기초하고있다. 개별 연구는 다양한 장내 점막, 여러 위장관의 영역 (즉, 위, 작은 l로부터 MFS의 분리에 대한 더 보편적 인 프로토콜에서 분리 절차를보고 있지만ARGE 장 점막)이 출판되었습니다. 본 명세서에서 프로토콜은 테스트를 성공적으로 상술 한 조직의 세 종류에 사용되어왔다. . 또한, 냉동 GI 점막에서 MFS를 단리하기위한 절차는보고되지 않았다.
여기, 우리는 효소 소화를 기반으로하는 최적화 된 방법을 제시하고, 동시에 문화에 대한 인간의 장내 점막 MFS의 분리를 허용 갓 소화, 단일 세포, 점막 준비에 분석 유동 세포 계측법. 이 기술은 확실하게 MF 표현형과 차 문화를 산출한다. 또한, 동일한 방법뿐만 아니라 위 및 소장 동결 조직 시료로부터 MFS를 분리하는데 사용될 수있다. 신선한 GI 조직으로부터 근육 섬유 모세포의 분리는 전술 한 내용; 그러나, 냉동 검체의 사용은 많은 이점을 제공한다. 즉, 연구자들은 capabi가 전 세계에 걸쳐 공동 작업자의 숫자에서 수집하고 저장하는 조직 할 수있을 것입니다lity 냉동 조직 샘플을 제공합니다. 또한, 연구진은 현재 실험 일정과 충돌에 절연을위한 조직을 처리 수술실 및 / 또는 내시경 제품군 즉시에서 폐기 조직의 컬렉션을 찾을 수 있습니다. 또한, 수술의 예측할 수없는 특성으로 인해, 조직 조달은 처리 조직에 대해 남아있는 시간을 제한 할 매우 늦게 하루에 발생할 수 있습니다. 나중에 처리를 위해 조직을 동결하는 것은 이러한 문제를 개선 할 것이다.
마지막으로,이 방법은 성공적으로 대장 암과 염증성 장 질환 등의 질병 상태에서, 대장 위 및 소장 근육 섬유 모세포의 분리에 활용되고있다.
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프로토콜
폐기 인간의 수술 환자의 조직과 차 문화의 설립을 얻기위한 프로토콜은 텍사스 의료 분기 및 뉴 멕시코 임상 시험 심사 보드의 대학의 대학에 의해 승인되었다. 인체 조직 표본의 조달을위한 일반적인 요건은 다음과 같다. MFS 냉동 조직, 바이오 뱅크 및 상업 공급 업체에서 고립 될 수 있기 때문에 또한 실행 가능한 옵션입니다 있습니다.
1. 인체 조직을 구합니다
- 승인 기관 심사위원회에 인간의 대장 조직을 얻기 위해 프로토콜을 제출합니다.
- 연구를 위해 인체 조직을 얻기 위해 일반 외과 및 / 또는 대장 외과 의사와 협력을 설정합니다. 그들이 진단을 위해 필요하지 않습니다 및 연구를 위해 지정 될 수있다 조직을 결정하는 바와 같이 병리 부서와의 협력은 필수입니다.
- grossl 후 종양에서 조직을 제공하기 위해 병리학 조언종양 정상적인 점막 Y 적어도 5cm. 즉시 얼음처럼 차가운 세척 매체에 샘플을 배치하고 얼음에 배치합니다. 병리학 연구를 위해 안전하게들 수 조직의 양을 결정할 것이다. MF 분리에 필요한 최소한의 티슈는 1.5 mm 2이다.
- 미래의 격리를위한 -80 ° C에서 차 문화 또는 동결과 장소를 설정 얻어진 조직 중 즉시 사용합니다.
- -80 ℃에서 동결 미디어 (아래 참조), 저장의 1 ml의 극저온 튜브에 배치, 2 MM 2 개 - 나중에 분리에 대한 동결 경우, 약 1로 조직을 잘라. 참고 :이 프로토콜을 이용, 4 년 동안 동결 조직에서 MFS의 성공적인 분리가 관찰되었다.
2. 시약 준비
- 콜라게나 솔루션의 경우 : 칼슘과 행크의 균형 소금 용액 (HBSS) 100 U / ㎖ 콜라게나 제 I, II 및 IV 준비 / 마그네슘 2+ (재료 표 참조 ). 주의 : 콜라게나 제 활성 단위 농도 및 순도 월 점막 세포 표면 에피토프 티슈 소화 및 / 또는 보존 효율을 방해 할 수 벤더 벤더마다 다르다. 이러한 가능성을 방지하기 위해 함정, 순도 (≥95 %)의 가장 높은 정도 콜라겐을 사용하여 활성 단위의 농도에 기초하여 상기 스톡 용액을 제조 하였다.
- 10 밀리그램 / ㎖ (3.55 UA / mg)을 물 기반 DNase의 주식 솔루션을 준비합니다.
- 워시 매체를 준비합니다 (MEM : 89 ml에, 항생제 - 안티 곰팡이, 100 배 : 1 ml의 열 불 활성화 FCS : 10 ㎖)
- MEM : 섬유 아세포 성장 미디어를 준비 500ml의 병; L- 글루타민 (200 mM)을 5 ㎖; MEM 비 필수 아미노산, 100 배 용액 5 ml의; 염산 시프로플록사신 (10 ㎎ / ㎖) 570 μL; 항생제 안티 곰팡이, 100 배 용액 10 ml의; 피루브산 나트륨 (100 mM)을 5 ㎖; 열 불 활성화 FCS : 50 ㎖
- 동결 매체 제조 : 섬유 아세포 성장 배지 10 %의 디메틸 설폭 시드 부가 (DMSO)와 (시약 2.4) 후 - 필터링을 아이돌0.22 μm의 필터로 ilize.
3. 효소 다이제스트 인간의 조직
- 조직이 따뜻한 (~ 37 ° C) 물에 동결 미디어, 장소 cryovial에 동결 된 경우 조직 및 미디어가 해동 될 때까지.
- 4 - 조직의 2mm 2 개 5, 칼슘 / 마그네슘 2+없이 두 번 HBSS 10 mL로 조직을 씻는다.
- 조직이 중력에 의해 정착되면, 조심스럽게 샘플을 회전하지 않고 상층 액을 버린다.
- 샘플 콜라게나 제 용액 10 ㎖를 추가로 멸균의 DNase /의 RNase가없는 튜브로 조직 혼합액을 전송 내장 된 샘플 해리 용 로터. 상피 세포의 기저 부분을 둘러싸는 점막 고유 층의 비 세포 분획을 형성하는 세포 외 기질을 해리 콜라게나 제를 사용한다.
- 단단히 가까운 튜브 및 dissociator (예를 들어, GentleMACs)의 소매에 거꾸로 부착. 연구소는 T로 액세스 권한이없는 경우그는 장비 상술 유사한 결과를 얻기 위해 각각의 분해 공정의 시간을 증가시킨다.
- 프로그램 h_tumor_01을 실행, 미리 설정된 프로파일은 기계 (- 실행 당 268 원과 4,000 rpm으로,에 이르기까지 간헐적 인 펄스와 36 초 총 지속 시간, 1,000)에 포함.
- 프로그램의 종료 후, 관 dissociator로부터 분리.
- 140 rpm에서 진탕 기에서 연속 회전에서 37 ° C에서 45 분 동안 샘플을 품어. 주 : 조직 샘플의 양을 변화시키기위한, 소화 시간은 비례 적으로 감소하거나 증가 될 수있다 (즉, 조직의 더 많은 양의 추가적인 시간이 필요할 수 있음).
- dissociator의 소매에 거꾸로 튜브를 연결합니다.
- (- 실행 당 235 원으로, 4,000 RPM 1,000에 이르기까지 간헐적 인 펄스, 37 초 총 시간)을 선택하고 프로그램 h_tumor_02를 실행합니다.
- 프로그램의 종료 후, 관 dissociator로부터 분리.
- DNase의 주식 솔루션의 50 μl를 추가. / 해리 죽은 세포와 응집 셀에 이르게 세포 파편의 DNA의 일부를 제거하기 위해 DNase를 사용합니다.
- 60 rpm에서 진탕에 연속 회전에서 37 ° C에서 30 분 동안 샘플을 품어.
- 다시 dissociator의 소매에 거꾸로 튜브를 연결합니다.
- (- 실행 당 168 원으로, 4,000 RPM 1,000에 이르기까지 간헐적 인 펄스, 37 초 총 시간)을 선택하고 프로그램 h_tumor_03를 실행합니다.
주 : 조직이 완전히 분해되지 않는 경우 20 ° C에서 10 분 동안 250 × g에서 원심 분리, 세포 해리 용액 2 ml의 상등액을 폐기 재현 탁하고 실온에서 10 분 동안 배양한다. - 멸균 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 전달합니다.
- 20 ° C에서 10 분 동안 250 × g에서 원심 분리 세포 현탁액. 대기음이 완전히 뜨는.
- 세척 세포 칼슘 / 마그네슘 2+없이 두 번 HBSS 25 mL를 펠렛과 상층 액을 버린다.
- 마지막으로 이전했다H는, 실험실에서 사용 가능한 자동화 된 셀 카운팅 시스템을 사용하거나 수동 혈구를 사용하여 세포 수를 카운트. MF 차 문화의 생성을위한 분석 단계 3.19.1 동안 진행 또는 단계 3.19.2 동안 진행 유동 세포 계측법 사용 MFS의 정렬.
- 분리 및 순수 MF 문화의 성장 (그림 1)의 경우, 미디어의 3 ㎖에 4 × 10 6 셀을 배정하는 데 필요한 섬유 아세포 절연 매체의 적절한 양의 마지막 원심 분리에 resuspend 세포 펠렛에서 뜨는을 버리고 당 잘 6 아니라, 세포 배양은 처리 플레이트. 3.20 단계로 진행합니다.
- 분석을 위해 또는, 유동 세포 계측법 (24)의 섬유 아세포 분리 미디어 2 ㎖에 2 × 10 6까지 배치 아니라, 낮은 바인딩 플레이트와 5 % CO 2와 37 ° C에서 O / N을 배양하여 MFS의 정렬. 이것은 효소 적 절차에 의해 영향을받을 수있는 세포 표면 에피토프를 복원하는 것이다. 그런 다음 세포 현탁액을 수집하고 복구 세포를 계산하고 진행및 면역 염색에 대한 분석 8 유동 세포 계측법.
- 5 % CO 2, 37 ℃에서 세포를 성장한다. 80 %의 합류 MF 단층 ~의 형성 (그림 1D-E)까지 3 일 - 매 2 미디어를 변경합니다.
- 통로 6 웰 플레이트에서 비율 1에서와 T25 플라스크에 세포 : 1 ~ 10 성장 - 100 % 컨 플루 - 섬유 아세포 성장 매체의 14 일 (80)을 달성했다.
- 2 : 1 비율로 T75 세포 T25에서 세포를 계대에 의해 문화를 확장합니다. 세포가 포화 상태에 도달하면, 이전에 5 바와 같이 유동 세포 계측법에 의해 사용 고립 MF 순도의 분석을 위해 하나의 플라스크를 사용합니다. 3 : 1 비율로 MF 문화의 또 다른 T75 플라스크를 동결 또는 통로.
참고 : EpCAM-, CD31-, CD45-, 멘틴의 + α-SMA +, CD90 + : 유동 세포 계측법에 의해 분석 할 때,이 중간 엽 기원의 GI 점막 기질 MF 문화에서 성장하는 것은 다음과 같은 표현형을 때 것으로 예상된다.
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결과
이 효소 소화 프로토콜을 사용하여, 우리는 지속적으로 분리하고 위장관 수술 표본과 생체 검사 (그림 1)에서 MF 인구 굿 CD90 + 점막 기질 세포 성장을 할 수 있었다. 6 웰 플레이트 (그림 1A-B)로 단핵 세포 현탁액 시드 - 5 보이는 MF 식민지 증식은 2 일에 관찰 할 수있다. MF 차 문화 도달 ~ 50 - 11 (그림 1C-D) - 7 일 70 %의 합류.
냉동 위장 조직에서 분리 된 1 차 근섬유 아세포 (MFS)를 그림. 인간의 MFS의 20X 배율은 인간의 대장 점막의 냉동 검...
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토론
이 프로토콜은 잠재적 인 암 예후 바이오 마커 및 치료 대상으로 기질 세포의 매우 중요한 성장의 빛만을 조사 어플리케이션을 위해 개발되었지만, 나중에 사용하기 위해 "기능적"biospecimens을 고정 할 수있는 능력은 상당한 이점을 제공한다. 이 개인화 된 약 10, 11의 개발을 진행하는 역할을하는 등의 추가 도구를 제공 할 수있는, 임상 biorepository의 생성을위한 독특한 장점을 나타낸다. 이전에 냉동 간질 혈관 분획으로부터 분리 된 지방 유래 중간 엽 줄기 세포에 대해보고 된 결과와 유사하게, 우리는했다 마커 및 증식 / 면역 / 염증 반응과 MFS의 신진 대사 활동이 냉동 점막 검체에서 분리 된 어떤 큰 변화가 관찰되지. (12) 그러나, 우리는 세포 외 마커 증착과 같은 비 시험 응답의 일부 등이 다를 수 있음을 배제하지 않는다 . 따라서, 알 수없는 작업의 이러한 경우에 / unre이식 된 이벤트는, 연구자 MFS가 동일인의 냉동과 신선한 조직으로...
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 미국 국립보건원(National Institute of Health, 1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) 및 텍사스 대학교 의학부의 중개 과학 연구소(Institute for Translational Sciences)의 지원을 받았으며 임상 및 중개 과학상(8UL1TR000071)을 수상했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| MEM, 1x | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| 소듐피루브레이트 | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| 항생제-항진균제, 100x | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-글루타민, 100x | 코닝 | 25-005-CI | |
| MEM 비필수 아미노산 | 코닝 | 25-025-CI | |
| 디메틸 설폭사이드(DMSO) 하이브리-맥스 | 시그마-알드리치 | D2650 | |
| DL-디티오트레이톨 용액(DTT) | 시그마-알드리치 | 646563 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| 콜라겐 분해 효소 Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| 콜라겐 분해 효소에서 클로스트리듐 히스톨리티쿰, 유형 II | 시그마-알드리치 | C1764 | |
| 클로스트리듐 히스톨리티쿰의 콜라겐분해효소, 유형 IV | 시그마-알드리치 | C5138 | |
| Accumax 세포 해리 용액 | 시그마-알드리치 | A7089 | |
| 젠틀MACS C 튜브 | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| 젠틀MACS 해리기 | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess 자동 세포 계수기 | Invitrogen | C10227 | |
| 세포 여과기 (70 µ m) | Corning | 352350 | |
| PE 마우스 안티 휴먼 Vimentin | BD Biosciences | 562337 | 클론 RV202 |
| FITC 단일 클론 안티 액틴, α - 평활 근육 | 시그마 - Aldrich | F3777 | 클론 1A4 |
| APC 마우스 안티 휴먼 CD90 | BD Biosciences | 559869 | 클론 5E10 |
참고문헌
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