방법 논문

불멸화 된 다 능성 귀의 전구 세포의 분화를 초기화

DOI:

10.3791/53692

⸱

2016년 1월 2일

 ,  ,  ,  , 
1Cell Biology & Neuroscience, Rutgers University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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불멸의 다능 난이전구세포(iMOP) 세포와 이암 분화를 유지하기 위한 현재 프로토콜에 대해 설명합니다. 감각 상피(sensory epithelia)와 나선형 신경절 뉴런(spiral ganglion neuron, SGN)으로의 분화를 나타내는 배양 조건과 분자 마커가 강조되어 있습니다.

초록

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세포 대체 요법을 위해 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 또는 배아 줄기 세포(ESC)를 사용하는 것은 큰 가능성이 있습니다. 낮은 수율과 분화된 세포의 이질적인 집단을 포함한 몇 가지 한계가 줄기세포 치료의 진행을 방해합니다. 내이 세포 대체 요법을 위한 많은 수의 기능성 유모 세포와 나선 신경절 뉴런(SGN)의 효율적인 분화를 촉진하기 위해 운명적으로 제한된 불멸의 다능성 귀 전구세포(iMOP) 세포주를 생성했습니다. 단일 iMOP 세포의 해리 배양에서 시작하여 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 철회에 의한 세포주기 종료 및 분화를 촉진하는 프로토콜이 설명되었습니다. bFGF 철회 후 증식 세포의 현저한 감소는 EdU 세포 증식 분석을 사용하여 확인되었습니다. 증식의 감소와 동시에 성공적인 분화는 분자 마커의 발현과 형태학적 변화를 초래했습니다. iMOP 유래 이권에서 Cdkn1b(p27KIP) 및 Cdh1(E-cadherin)의 면역염색은 내이 감각 상피로 감별을 위한 지표로 사용되었으며, Cdkn1b 및 Tubb3(신경 세포 β-튜불린)의 면역 염색은 iMOP 유래 뉴런을 식별하는 데 사용되었습니다. iMOP 세포의 사용은 내이 신경감각 전구 세포가 내리는 세포 운명 결정을 이해하는 데 중요한 도구를 제공하며, 많은 수의 iPSC 또는 ESC 유래 유모 세포 및 SGN을 생성하기 위한 프로토콜을 개발하는 데 도움이 됩니다. 이러한 방법은 대체 요법을 위한 이세포 생성 노력을 가속화할 것입니다.

서론

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내이의 기관인 달팽이관, 난실, 주머니 및 세 개의 반고리관은 듣고 균형을 잡는 능력을 매개합니다. 달팽이관 내의 유모 세포는 소리를 전기 신호로 변환하여 나선신경절 뉴런(spiral ganglion neuron, SGN)으로 전달합니다. SGN은 활동 전위를 발사하여 청각 회로를 통해 신경 신호를 전파합니다. 유전적 돌연변이, 이독성 약물 및 큰 소리에 대한 노출은 유모 세포와 SGN 사멸에 기여하여 청력 상실을 초래합니다1-4. 한 번 손실되면 이러한 세포는 대체되지 않습니다. 초기 유모 세포 또는 SGN을 생성하기 위해 iPSC와 ESC를 사용하는 것은 내이 세포 대체 요법에 큰 가능성을 제공합니다5-8. 만능 줄기 세포와 내이 유래 전구 세포는 다양한 성숙 단계에서 유모 세포와 SGN으로 분화할 수 있다는 사실이 쏟아져 나왔습니다. 포유류 배아 줄기 세포(ESC) 및 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 사용하여 기능성 유모 세포와 SGN9-11을 생성할 수 있습니다. 포유류의 내이에서 유래한 줄기세포와 전구세포는 또한 생체 내 세포 대응 물질12-16의 특성을 가진 유모 세포와 뉴런을 형성하는 것으로 나타났습니다.

손실된 유모 세포와 ....

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프로토콜

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1. IMOP 세포의 자기 갱신을 유지

  1. 문화 매체를 iMOP 준비 : DMEM / F12, 1X B27 보충제, 25 μg의 / ㎖ carbenecillin 20 NG / ㎖의 bFGF를. 멸균 시약을 사용하여 iMOP 문화 매체의 50 mL로한다. 37 ° C의 물을 욕조에 50 ML 원뿔에 DMEM / F12의 49 ml의 워밍업.
    1. 해동 50X B27 보충제와 37 ° C의 물을 욕조에 5 분 동안 필터 멸균 100 ㎎ / ㎖ carbenecillin 분취. 실온에서 100 μg의 / ㎖의 bFGF 나누어지는을 녹여. 추가 1 ml의 50 배 B27, 100 μg의 / ㎖의 bFGF를 10 μL와 DMEM / F12에 100 ㎎ / ㎖ carbenecillin의 12.5 μL.
  2. 배양 iMOP 세포 60mm 조직 배양 접시에 미디어의 3 ㎖를 사용합니다. 미디어의 볼륨을 두 배로 매일 문화에 신선한 매체를 추가합니다. 의 bFGF의 농도가 5 ng를 / ㎖ 이하로 떨어지지 않도록해야합니다.
    1. 아래 단계에 나열된 문화 5~7일 후 5 % CO 2 항로 세포와 37 ° C에서 문화 iMOP 세포. (15)로 전송 문화10 ML의 피펫 팁을 사용하여 ML 원뿔.
    3. ....

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결과

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IMOP 세포에서 bFGF의 탈퇴 감소 확산

iMOP 세포의 증식능을 감소시키고 iMOP 세포의 분화를 개시하기 위해,는 bFGF를 배양으로부터 회수 하였다. 성장 인자 철수 증식을 감소 함을 확인하려면, 에듀 통합은 증식 분석으로 사용 하였다. (bFGF를하지 않고) iMOP 문화 미디어 (bFGF를 함유) 및 감각 상피 미디어에서 배양 otospheres 배양 otospheres에서 에듀를 통합 세포의 비율을 비교 하​​였다. Otosphere 문화 수확 및 고정 염기 아날로그 에듀와 펄스했다. 통합 에듀 뉴클레오티드는 형광 Alexafluor 488 지드는 클릭 - 화학을 이용하여 표시 하였다. 의 bFGF의 부재 하에서 성장 otospheres에서 세포의 bFGF (도 1A-F)와 함께 배양 .......

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토론

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IMOP 문화 모니터링

신규 iMOP 세포주의 분화를 자기 갱신을 유지 및 촉진시키기위한 프로토콜을 설명하는 추가 도금 포맷 (표 1)을 포함한다. 일상적인 확장과 iMOP 세포의 분화에 도움이되는 몇 가지 중요한 단계가 설명되어 있습니다. 다 능성 줄기 세포 배양과 마찬가지로, iMOP 세포는 이론적으로 불명확 수명을 갖는다. 세포주가 제대로 유지되도록하려면, iMOP 문화가 일상적으로 세포 생존,자가 재생과 분화 가능성에 대해 모니터링된다. 분리 한 후 세포 생존을 확인하려면, 우리는 트리 판 블루 염색을 사용합니다. 일반적으로, 세포의 70 % 이상이 분해 후에 실용적이다. 수행 C-Myc와 및 Sox2이 항체와 면역 염색, iMOP 세포의자가 재생을 모니터링 할 수 있습니다. 증식 배양 조건에서 iMOP 세포는 18 시간 ~의 두 배의 시간이 있습니다. 수행 또는 자체 갱신 마커의 발현의 변화시간을 ublin.......

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 Duncan and Nancy MacMillan Faculty Development Chair Endowment Fund(K.Y.K.), Busch Biomedical Research Grant(K.Y.K.) 및 Rutgers Faculty Development Grant(K.Y.K.)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
CoolCell LX 무알코올 세포 동결 용기BioCisionBCS-405
극저온 바이알 (2 ml) Corning430654
1.5 두께 유리 커버 슬립 (원형 12mm)전자 현미경 과학72230-01
DMEM / F12Life Technologies11320-082
Neurobasal MediumLife Technologies21103
인산염 완충 식염수 (PBS) pH 7.4Life Technologies10010-023
Hank's 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)Life Technologies14025-092
B27 보충제 (50X) Serum FreeLife Technologies17504-0441 ml 분취액
L-Glutamine(200 mM)으로 저장 Life Technologies25030-0815 ml 분취수로 저장
Natural Mouse LamininLife Technologies23017-0151 mg/ml 분주액으로 저장
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Life TechnologiesC10337
Synth-A-Freeze 냉동 보존 미디어Life TechnologiesA12542-01
Prolong Gold Antifade MountantLife Technologies47743-73610 mg/ml 100 µ로 저장; l 부분 표본
Moxi Z Mini 자동 세포 카운터Orflo MXZ001
Moxi Z 카세트 타입 SOrflo MXC002
재조합 쥐 섬유아세포 성장 인자, 염기성(bFGF)Peprotech450-33H20에서 0.1% BSA에 재현탁하고 20mg/ml 분취량으로 저장
Poly-D-LysineSigmaP78861X PBS에 재현탁하고 10mg/ml 100 µ로 저장; l 분취량
카르베니실린, 디소듐 솔Thermo Fisher ScientificBP2648-110 mM Hepes pH 7.4에 재현탁 및 100 mg/ml로 분취
ml 피펫 개별 포장 페이퍼백 (200/케이스)Thermo Fisher Scientific1367811D
10 ml 피펫 개별 포장 페이퍼백 (200/케이스)Thermo Fisher Scientific1367811E
조직 배양 처리된 Biolite 24-웰 플레이트Thermo Fisher Scientific130188
조직 배양 처리된 Biolite 6-웰 플레이트Thermo Fisher Scientific130184 
조직 배양 처리된 6cm 접시Thermo Fisher Scientific130181 
EMD Millipore Millex 멸균 주사기 PVDF 필터 기공 크기: 0.22 & mThermo Fisher ScientificSLGV033RS
TipOne 필터 피펫 팁 0.1 - 10 μ l 길쭉한 필터 팁USA Scientific1120-3810
TipOne 필터 피펫 팁 1 - 20 μ l 필터 팁USA Scientific1120-1810
TipOne 필터 피펫 팁 1 - 200 μ 엘  필터 팁USA Scientific1120-8810
TipOne 필터 피펫 팁 101 - 1000 μ l 필터 팁USA Scientific1126-7810
15ml 원뿔형 튜브 멸균 25개 튜브 20봉지(500개 튜브)USA Scientific1475-0511
50ml 원뿔형 튜브 멸균 25개 튜브(500개 튜브) 20봉지USAScientific1500-1211
5

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Petit, C., Richardson, G. P. Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function. Nat Neurosci. 12 (6), 703-710 (2009).
  2. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary'....

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iMOPbFGFEdUCdkn1b Cdh1Cdkn1b Tubb3

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