이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

불멸화 된 다 능성 귀의 전구 세포의 분화를 초기화

8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53692

⸱

2016년 1월 2일

 ,  ,  ,  , 
1Cell Biology & Neuroscience, Rutgers University

* These authors contributed equally

이 논문에서

정오 공지

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

요약

불멸의 다능 난이전구세포(iMOP) 세포와 이암 분화를 유지하기 위한 현재 프로토콜에 대해 설명합니다. 감각 상피(sensory epithelia)와 나선형 신경절 뉴런(spiral ganglion neuron, SGN)으로의 분화를 나타내는 배양 조건과 분자 마커가 강조되어 있습니다.

초록

세포 대체 요법을 위해 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 또는 배아 줄기 세포(ESC)를 사용하는 것은 큰 가능성이 있습니다. 낮은 수율과 분화된 세포의 이질적인 집단을 포함한 몇 가지 한계가 줄기세포 치료의 진행을 방해합니다. 내이 세포 대체 요법을 위한 많은 수의 기능성 유모 세포와 나선 신경절 뉴런(SGN)의 효율적인 분화를 촉진하기 위해 운명적으로 제한된 불멸의 다능성 귀 전구세포(iMOP) 세포주를 생성했습니다. 단일 iMOP 세포의 해리 배양에서 시작하여 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 철회에 의한 세포주기 종료 및 분화를 촉진하는 프로토콜이 설명되었습니다. bFGF 철회 후 증식 세포의 현저한 감소는 EdU 세포 증식 분석을 사용하여 확인되었습니다. 증식의 감소와 동시에 성공적인 분화는 분자 마커의 발현과 형태학적 변화를 초래했습니다. iMOP 유래 이권에서 Cdkn1b(p27KIP) 및 Cdh1(E-cadherin)의 면역염색은 내이 감각 상피로 감별을 위한 지표로 사용되었으며, Cdkn1b 및 Tubb3(신경 세포 β-튜불린)의 면역 염색은 iMOP 유래 뉴런을 식별하는 데 사용되었습니다. iMOP 세포의 사용은 내이 신경감각 전구 세포가 내리는 세포 운명 결정을 이해하는 데 중요한 도구를 제공하며, 많은 수의 iPSC 또는 ESC 유래 유모 세포 및 SGN을 생성하기 위한 프로토콜을 개발하는 데 도움이 됩니다. 이러한 방법은 대체 요법을 위한 이세포 생성 노력을 가속화할 것입니다.

서론

내이의 기관인 달팽이관, 난실, 주머니 및 세 개의 반고리관은 듣고 균형을 잡는 능력을 매개합니다. 달팽이관 내의 유모 세포는 소리를 전기 신호로 변환하여 나선신경절 뉴런(spiral ganglion neuron, SGN)으로 전달합니다. SGN은 활동 전위를 발사하여 청각 회로를 통해 신경 신호를 전파합니다. 유전적 돌연변이, 이독성 약물 및 큰 소리에 대한 노출은 유모 세포와 SGN 사멸에 기여하여 청력 상실을 초래합니다1-4. 한 번 손실되면 이러한 세포는 대체되지 않습니다. 초기 유모 세포 또는 SGN을 생성하기 위해 iPSC와 ESC를 사용하는 것은 내이 세포 대체 요법에 큰 가능성을 제공합니다5-8. 만능 줄기 세포와 내이 유래 전구 세포는 다양한 성숙 단계에서 유모 세포와 SGN으로 분화할 수 있다는 사실이 쏟아져 나왔습니다. 포유류 배아 줄기 세포(ESC) 및 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 사용하여 기능성 유모 세포와 SGN9-11을 생성할 수 있습니다. 포유류의 내이에서 유래한 줄기세포와 전구세포는 또한 생체 내 세포 대응 물질12-16의 특성을 가진 유모 세포와 뉴런을 형성하는 것으로 나타났습니다.

손실된 유모 세포와 SGN을 대체하기 위해 iPSC 또는 ESC 유래 otic 전구 세포를 사용하는 것은 효율적인 분화가 필요합니다. 내이에서 생착된 줄기 유래 전구 세포의 부적절한 분화 또는 지속적인 증식은 내이 기능을 악화시키고 내이에서 기형종 형성과 같은 종양 유발 위험을 초래할 수 있습니다17. 배양 조건을 개발하고 이암 전구 동물의 분화를 이해해야 할 분명한 필요성이 있습니다. 이러한 방법을 개발하는 한 가지 전략은 내이 발달 과정에서 신경감각 전구 세포가 내린 세포 운명 결정을 요약하는 것입니다. 이의 증식을 방지하고 귀 전구 세포를 유모 세포 또는 SGN으로 유도하는 프로토콜은 대체 요법의 안전성과 효능을 개선하는 데 도움이 될 것입니다.

발달 과정에서 내이는 능형체 5와 6 사이의 제한된 영역에서 표면 외배엽이 두꺼워지는 것으로 시작하여 이판(otic placode)이 됩니다. 이파리(otic placode)가 이파리(otic cup)를 형성하기 위해 침입할 때, 이파리의 앞쪽 영역에 있는 세포들의 집합체는 내이(內耳)의 유모 세포와 뉴런의 전구체를 포함하는 신경-감각-관능 도메인(neural-sensory-competent domain, NSD)을 발생시킨다18. 내이가 발달하는 마우스, 닭 및 제브라피시의 운명 매핑 연구는 지지 세포와 이소 뉴런19-22를 둘러싼 감각 유모 세포를 생성하는 신경 감각 전구 세포의 여러 집단을 제안합니다. 높은 이동성 그룹 전사 인자인 Sox2는 감각 세포 사양화와 관련이 있으며 내이 전구 세포에 대한 마커로 사용됩니다23,24. 내이에서 Sox2 발현 수준을 감소시키는 저형성 돌연변이는 달팽이관의 유모 세포, 지지 세포 및 SGN의 손실을 초래합니다25,26.

세포 운명 결정을 받는 귀 전구 세포를 연구하기 위해, 달팽이관 전구 세포를 발현하는 Sox2의 불멸화 다분화능 전구 세포주(iMOP) 세포주를 운명 제한으로 설정했습니다. iMOP 세포는 원래 배아 E12.5-13.5 달팽이관에서 유래했으며 c-Myc 레트로바이러스에 감염되었습니다27. iMOP 세포는 이구(otosphere)로 알려진 군락을 형성하는 세포로 지속적으로 증식할 수 있으며, 유모 세포로 분화하여 세포와 SGN을 지지할 수 있습니다27. iMOP 세포가 뚜렷한 이염 계통으로 분화하는 능력을 이해하면 이러한 연구 결과를 적용하여 iPSC 또는 ESC 유래 유모 세포 및 SGN을 효율적으로 생성할 수 있습니다.효율적인 분화 프로토콜은 기존 치료법에 적합하지 않은 내이 질환의 세포 대체 요법을 위한 새로운 길을 열 것입니다. 체외 세포 배양을 통해 이세포 생성에 있어 중요한 문제는 세포가 분화를 진행하고 있는지 확인하는 데 도움이 되는 분화 마커를 갖는 것입니다. Cdkn1b(p27KIP)는 내이 발달에서 분화를 위한 초기 표지자로 광범위하게 사용되어 왔지만, iMOP 세포에서 Cdkn1b의 발현과 이것이 분화와 어떤 상관관계가 있는지는 다루어지지 않았습니다. 이 연구에서는 현재 배양 조건과 Cdkn1b 발현이 iMOP 분화의 다른 마커와 어떤 상관관계가 있는지 설명합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. IMOP 세포의 자기 갱신을 유지

  1. 문화 매체를 iMOP 준비 : DMEM / F12, 1X B27 보충제, 25 μg의 / ㎖ carbenecillin 20 NG / ㎖의 bFGF를. 멸균 시약을 사용하여 iMOP 문화 매체의 50 mL로한다. 37 ° C의 물을 욕조에 50 ML 원뿔에 DMEM / F12의 49 ml의 워밍업.
    1. 해동 50X B27 보충제와 37 ° C의 물을 욕조에 5 분 동안 필터 멸균 100 ㎎ / ㎖ carbenecillin 분취. 실온에서 100 μg의 / ㎖의 bFGF 나누어지는을 녹여. 추가 1 ml의 50 배 B27, 100 μg의 / ㎖의 bFGF를 10 μL와 DMEM / F12에 100 ㎎ / ㎖ carbenecillin의 12.5 μL.
  2. 배양 iMOP 세포 60mm 조직 배양 접시에 미디어의 3 ㎖를 사용합니다. 미디어의 볼륨을 두 배로 매일 문화에 신선한 매체를 추가합니다. 의 bFGF의 농도가 5 ng를 / ㎖ 이하로 떨어지지 않도록해야합니다.
    1. 아래 단계에 나열된 문화 5~7일 후 5 % CO 2 항로 세포와 37 ° C에서 문화 iMOP 세포. (15)로 전송 문화10 ML의 피펫 팁을 사용하여 ML 원뿔.
  3. HBSS의 50 ㎖에 0.5 M EDTA의 pH 8.0의 0.1 ml에 희석하여 HBSS에 1 mM의 EDTA를 확인합니다. 사전 따뜻한 1 mM의 EDTA는 37 ° C의 물을 욕조에 HBSS로했다.
  4. 중력 침강 또는 5 분 200 XG에서 원심 분리하여 수확 세포. 실온에서. 10 분 - 중력 침강를 들어, 5 37 ° C 배양기에서 문화를 포함하는 15 ML 원뿔을 배치합니다. 그 시간 후, otospheres이 15 ml의 원추형의 바닥에 수집 관찰.
    참고 : 과도한 원심력 세포 손상의 원인이 될 수 있습니다.
  5. 조심스럽게 흡인 세포 펠렛을 방해하지 않고 피펫을 흡입 2 ㎖의를 사용하여 미디어를 보냈다. 펠렛을 셀에 미리 예열 1 mM의 EDTA HBSS 용액 0.5ml를 추가합니다. P1000 피펫을 사용하여 부드럽게 피펫 아래로 2-3 회. 37 ° C에서 원추형 배치 및 단일 세포로 분리를 용이하게하기 <5 분 동안 배양한다.
  6. 부드럽게 otospheres가 해리되어 있는지 확인 셀 솔루션을 소용돌이 친다. 더 OTO 경우구가 원뿔의 바닥에 침전, 세포를 분해한다. 배양 시간은 다를 수 있습니다.
    참고 : EDTA와 장기간 배양 과도한 세포 사망을 초래할 것입니다.
  7. 37 ° C에서 세포를 제거 EDTA를 중화하고 희석 미디어 2 ㎖를 추가합니다. RT에서 5 분 동안 200 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집한다. 대기음 아웃 2 ml의 흡입 피펫을 사용하여 세포를 씻어 1X PBS 5 mL를 추가 EDTA를 희석.
  8. 실온에서 5 분 동안 200 XG에서 세포를 스핀 다운 및 2 ml의 흡입 피펫을 사용하여 1X PBS를 대기음. 3 번 - 부드럽게 내려 2를 피펫 팅에 의해 iMOP 배양액 0.5 ㎖에 P1000 피펫을 사용하여 세포를 재현 탁.
  9. 해당 카세트 (28)와 미세 입자 계수기를 사용하여 세포를 카운트. iMOP 세포의 합류 판 ~ 6 X10 6 셀이 포함됩니다. 미디어 (100) 및 계산을위한 카세트에 셀 솔루션의 75 UL을 추가 세포 1을 희석. iMOP의 cultu에서 6cm 접시에 플레이트 1 × 10 6 세포미디어 재 (~ 1 : 10 희석). 통로 iMOPs 모든 5-7일.
    참고 : 큰 otospheres을 형성하거나 차별화 조직 배양 접시의 바닥에 부착 세포. 문화가 융합을 통해 경우 세포는 죽을 것이다.

2. 동결 융해 IMOP 세포

  1. 해동 전에 동결 세포에 4 ° C에 대한 해결책을 평형화에 의해 합성 동결 매체를 준비합니다.
  2. iMOP 세포의 합류 6cm 접시에서 세포를 수집합니다. 15 ML 원뿔로 - (8 × 10 6 세포 ~ 6) 10ml를 피펫 및 전송 세포를 사용합니다.
  3. 중력 침강 또는 실온에서 5 분 200 XG에서 원심 분리하여 수확 세포. otospheres가 작은 경우, 세포가 중력 침강에 의해 해결되지 않습니다. 옵션 : 총 세포 수를 결정하는 단계 1.9을 사용하여 세포를 계산합니다.
  4. 대기음 뒤에 느슨한 세포 펠렛을 유지하면서 피펫을 흡입 2 ㎖를 사용하여 미디어를 보냈다.
  5. CE를 재현 탁하는 합성 동결 미디어의 0.25 ML을 추가~ 5 × 5 × 106 3 세포 / ml의 밀도로 LLS. 부드럽게 P1000 피펫으로 세포를 피펫. 팁을 여과 1 mL를 P1000 피펫을 사용하여 극저온 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다.
  6. 알코올 무료 냉​​동 컨테이너에 튜브를 놓고 온도에 도달 할 때까지 -80 ° C ~ 분당 온도 1 ° C를 감소 -80 ℃에서 냉동 컨테이너를 배치합니다.
  7. 세포를 장기간 저장을 위해, 액체 질소 저장 탱크의 증기 상에 튜브를 전송. 문화에 대한 세포를 해동, -80 ℃에서 냉동 세포를 포함하는 극저온 유리 병을 평형.
  8. 37 ° C의 물을 욕조에 미리 따뜻한 iMOP 문화 미디어.
  9. 37 ℃의 수욕 바이알의 저부 소용돌이에 의해 신속하게 냉동 바이알을 해동. 마지막 얼음 결정이 사라지면 해동 세포에 미리 예열 iMOP 문화 미디어의 1 ML을 추가합니다. 전사 15ml의 원뿔형으로 iMOP 세포 배양 배지의 추가적인 4를 가하여
  10. 15 ml의 공동 스핀5 분 nical. 200 XG에서 보낸 매체를 대기음. 6cm iMOP 접시에 배양 배지 및 세포 플레이트 2 ㎖의 세포를 재현 탁. 확장을 위해 5 %, 37 ℃에서 이산화탄소를 문화를 품어.

3. 감각 상피에 IMOP 세포를 차별화

  1. DMEM / F12, 1X B27 보충제, 25 μg의 / ㎖ carbenecillin : iMOP 감각 상피 분화 매체의 50 ㎖를 준비합니다. iMOP 감각 상피 분화 매체의 50 mL로한다. 37 ° C의 물을 욕조에 50 ML 원뿔에 DMEM / F12의 49 ml의 워밍업. 해동 50X의 B27 보충제, 5 분 동안 100 mg을 / ㎖ carbenecillin 분취. 37 ° C의 물을 욕조에. 1 ml의 50X B27와 DMEM / F12에 100 ㎎ / ㎖ carbenecillin의 12.5 μl를 추가합니다.
  2. , 수확, 재현 탁을 해리와 카운트 세포는 1.4-1.9 단계를 반복
  3. 일 -3 문화 매체를 iMOP 사용에 6cm 접시에 플레이트 1 × 10 6 세포. 일 0에서 전송 문화는 15 ML 원뿔에 10 ml의 피펫을 사용하여. OTO를 수집중력 침강에 의해 구체로 단계 1.6에서 말했다. 대기음 밖으로 피펫을 흡입 2 ㎖의를 사용하여 미디어를 소비하고, 원뿔 밑면의 otospheres 둡니다.
  4. 부드럽게 감각 상피 분화 미디어 2 ㎖에 추가 할 수 있습니다. 전송은 큰 구멍 10ml를 피펫을 사용하여 6cm 접시에 otospheres.
    참고 : 거친 피펫 팅에서 기계 전단은 otospheres에서 세포를 떼어 놓다 수 있습니다.
  5. 매일 문화에 신선한 감각 상피 분화 매체의 2 ML을 추가합니다. 필요한 경우, 세포 대체 중력 침강 및 매체에 의해 회수 할 수있다.
  6. 15 ML 원뿔로 전송하고 otospheres 단계에서 언급 한 바와 같이 보냈다 미디어 피펫을 흡입 2 ml에 사용 1.6.Aspirate 침전물과 방해받지 otospheres을 떠날 수 있도록하여 10 일에 otospheres를 수집합니다.
  7. 실온에서 15 분 동안 1X PBS에 4 % 포름 알데히드에서 배양하여 otospheres을 수정합니다. 포름 알데히드 용액을 제거 세척 완충액 (PBS 1X, 0.1 % 트리톤-10을 함유하는 세척 otospheres0)를 차단 완충액에서 배양 하였다 (1X PBS 10 % 정상 염소 혈청에서 1 시간 동안 0.1 % 트리톤 X-100)을 함유.
    1. 버퍼를 교체하고 희석 항체와 버퍼를 차단에서 샘플을 품어. 4 ° C에서 품어. 1X PBS 27 면역 염색에 0.1 % 트리톤 X-100 대상에게 otosphere를 포함 씻을 샘플. P1000 피펫을 사용하여 유리 슬라이드에 미디어를 장착에 1X PBS로 전송 otospheres 및 장소 otospheres. 샘플을 통해 coverslip에 넣고 설치 미디어가 4 ℃에서 건조 할 수 있습니다.
  8. 16 비트 CCD 카메라와 20 배 0.75 공기 중 또는 40X 1.3 NA 오일 침지 목적이 장착 거꾸로 현미경 설정을 사용하여 표면 형광 이미지를 획득. 블루 (377 ± 25 나노 / 447 ± 30 ㎚), 녹색 (475 ± 25 나노 / 540 ± 25 ㎚), 빨간색 (562 ± 20 나노 / 625 : 상기 (여기 및 방출) 파장을 사용하여 다른 색상 채널에서 형광을 수집 ± 20 나노) 및 적외선 (628 ± 20 나노 / 및 692 ± 20㎚).

4. 시금 에듀 설립

  1. 일 -3에서 6cm 접시에 1 × 10 6 iMOP 세포를 접시. 삼일 후에 일 0에, 수확, 해리, 재현 탁하고 단계 1.4-1.9를 반복하여 세포를 계산합니다.
  2. 플레이트 iMOP 배양 배지에 2.5 × 10 5 세포와 6 잘 접시의 다른 우물의 감각 상피 분화 미디어 5 X10 5 세포.
  3. 에듀 통합 분석을 사용하여 3 일에 듀 설립하여 S 단계에서 세포의 비율을 결정
    1. 배양 배지에서 1 μM 듀의 최종 농도를 얻기 위해 iMOP 배양 직접 듀 콘텐츠를 추가한다.
    2. 2 시간 동안 iMOP 문화에 EDU을 품어 5 % CO 2와 37 ° C에서 품어. 수확, 해리와 수집 세포 단계 1.4-1.9를 반복합니다. 15 분 동안 1X PBS에 4 % 포름 알데히드에 추가합니다. 실온에서 세포를 해결하려면. 실온에서 5 분 200 XG에서 원심 분리하여 수확 세포. 포름 알데히드 용액과 properl 제거Y는 폐기하십시오.
    3. 라벨 훽스트 (Hoechst)와 세포의 핵 및 제조 업체의 프로토콜에 따라 녹색 형광 염료 아 지드와 에듀를 통합.
      참고 : 모든 세척이 1X PBS, 두 번 1X PBS로 3 % BSA, 0.1 % 트윈 20 세척 세포로 이루어집니다.
    4. 및 antifade 시약을 사용하여 슬라이드에 마운트 세포 샘플을 통해 1.5 커버 유리를 놓습니다. 표면 형광 현미경을 사용하여 표지 된 세포의 형광 이미지를 획득.

5. IMOP 유래 신경 세포를 차별화

  1. 로 Neurobasal 미디어, 1X B27 보충제, 2 mM의 L 글루타민 : 신경 세포 분화 매체의 50 mL로한다. 5 분 37 ° C의 물을 욕조에 50 배 B27 200 mM의 L 글루타민의 해동 병. 로 Neurobasal 미디어의 48.5 ml의 1ml를 50X B27 0.5 ml의 200 mM의 L 글루타민을 추가합니다.
  2. 멸균 10cm 플레이트 라운드 12mm 1.5 커버 글라스를 배치하고 멸균 된 커버를 청소 판에 70 %의 EtOH를 추가로 코트 커브 글라스.
  3. 부드럽게 코브를 교반rslips은 에탄올에 포함되어 있는지 확인합니다. 실온에서 10 분 동안 접시를 남겨주세요. 나머지 에탄올을 씻어 살균 1X PBS로 된 커버 3 회 씻어. 1X PBS 나머지 씻어 살균 H 2 0 번 커버 슬립을 씻어.
  4. 피펫을 흡입 2 ㎖의를 사용하여 H 2 0 대기음 된 커버가 건조 할 수 있습니다. 15 분 동안 조직 배양 후드에서 UV 광에 노출 된 커버. 즉시 사용하지 않을 경우 저장소는 무균 환경에서 커버 슬립.
  5. 24 잘 접시의 각 웰에 한 12mm 라운드 커버 슬립을 놓습니다. 커버 슬립이 잘 바닥에 평평하게 놓여 있는지 확인 부드럽게 판을 흔들어.
  6. 해동 2 밀리그램 / 1X PBS에서 10 μg의 / ㎖ 폴리 D 라이신 농도 실온에서 폴리 -D- 라이신 원액 mL 및 희석. 10 UG / ㎖ 폴리 D 라이신 0.25 ml의 우물에 추가합니다. 1 시간 동안 37 ° C를 인큐베이터에서 접시를 남겨주세요.
  7. 멸균 1X PBS로 우물 3 회 반복한다. 실온에서 10 ㎎ / ㎖ 라미닌 원액 및 해동 10 μg의 / M로 희석1X PBS에서 L. 추가 10 μg의 24 멀티 잘 접시의 단일 잘으로 솔루션을 작동 / ㎖ 라미닌 0.25 ml의. 37 ° C 배양기에서 접시를 품어. 2ml의 흡인 피펫을 사용하여 용액을 라미닌 대기음.
  8. P1000 피펫 1X PBS 1 ml의 추가 및 피펫을 흡입 2 ㎖로 흡입하여 1X PBS를 제거하여 커버 슬립을 1X PBS로 3 회 반복한다. 세포가 도금 될 준비가 될 때까지 잘 마지막 세척에서 1X PBS를 남겨주세요. 해리와 일 -3에서 6cm 접시에 단계 1.4-1.9.Plate 1 × 10 6 세포를 세포를 계산, 수확에 의해 신경 세포의 분화를 시작합니다.
  9. 일 0, 수확, 해리와 1.4-1.9를 반복하여 세포를 계산합니다. 씨 1 × 10 5 - 잘 24 멀티 잘 접시 당 예열 신경 세포 분화 미디어 0.5 ml의에 × 10 5 iMOP 세포 1.5. 기음과 매일 문화에 미리 예열 신경 세포의 분화 미디어를 추가 할 수 있습니다.
  10. 15 분 동안 4 % 포름 알데히드에 iMOP 유래 신경 세포를 고정합니다. 에이t RT 7 일째 제거 포름 알데히드 용액에 세척 완충액으로 iMOP 유래의 신경 세포를 세척 버퍼를 차단에 배양 하였다 (1X PBS 0.1 % 트리톤-100을 포함하는) (1X PBS 10 % 정상 염소 혈청과 0.1 %를 함유 트리톤 X-100) 1 시간 동안.
    1. 버퍼를 교체하고 희석 항체와 버퍼를 차단에서 샘플을 품어. 4 ° C에서 품어. 1X PBS 0.1 % 트리톤 X-100 주제 세포를 포함 씻을 샘플은 27 면역 염색합니다. 설치 미디어에 배치하기 전에 1X PBS로 커브 글라스를 씻으십시오. 설치 미디어가 단계 3.8에 나와있는 표면 형광 이미지를 획득하기 전에 4 ℃에서 건조하도록 허용합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

IMOP 세포에서 bFGF의 탈퇴 감소 확산

iMOP 세포의 증식능을 감소시키고 iMOP 세포의 분화를 개시하기 위해,는 bFGF를 배양으로부터 회수 하였다. 성장 인자 철수 증식을 감소 함을 확인하려면, 에듀 통합은 증식 분석으로 사용 하였다. (bFGF를하지 않고) iMOP 문화 미디어 (bFGF를 함유) 및 감각 상피 미디어에서 배양 otospheres 배양 otospheres에서 에듀를 통합 세포의 비율을 비교 하​​였다. Otosphere 문화 수확 및 고정 염기 아날로그 에듀와 펄스했다. 통합 에듀 뉴클레오티드는 형광 Alexafluor 488 지드는 클릭 - 화학을 이용하여 표시 하였다. 의 bFGF의 부재 하에서 성장 otospheres에서 세포의 bFGF (도 1A-F)와 함께 배양 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

IMOP 문화 모니터링

신규 iMOP 세포주의 분화를 자기 갱신을 유지 및 촉진시키기위한 프로토콜을 설명하는 추가 도금 포맷 (표 1)을 포함한다. 일상적인 확장과 iMOP 세포의 분화에 도움이되는 몇 가지 중요한 단계가 설명되어 있습니다. 다 능성 줄기 세포 배양과 마찬가지로, iMOP 세포는 이론적으로 불명확 수명을 갖는다. 세포주가 제대로 유지되도록하려면, iMOP 문화가 일상적으로 세포 생존,자가 재생과 분화 가능성에 대해 모니터링된다. 분리 한 후 세포 생존을 확인하려면, 우리는 트리 판 블루 염색을 사용합니다. 일반적으로, 세포의 70 % 이상이 분해 후에 실용적이다. 수행 C-Myc와 및 Sox2이 항체와 면역 염색, iMOP 세포의자가 재생을 모니터링 할 수 있습니다. 증식 배양 조건에서 iMOP 세포는 18 시간 ~의 두 배의 시간이 있습니다. 수행 또는 자체 갱신 마커의 발현의 변화시간을 ublin...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 Duncan and Nancy MacMillan Faculty Development Chair Endowment Fund(K.Y.K.), Busch Biomedical Research Grant(K.Y.K.) 및 Rutgers Faculty Development Grant(K.Y.K.)의 지원을 받았습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
CoolCell LX 무알코올 세포 동결 용기BioCisionBCS-405
극저온 바이알 (2 ml) Corning430654
1.5 두께 유리 커버 슬립 (원형 12mm)전자 현미경 과학72230-01
DMEM / F12Life Technologies11320-082
Neurobasal MediumLife Technologies21103
인산염 완충 식염수 (PBS) pH 7.4Life Technologies10010-023
Hank's 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)Life Technologies14025-092
B27 보충제 (50X) Serum FreeLife Technologies17504-0441 ml 분취액
L-Glutamine(200 mM)으로 저장 Life Technologies25030-0815 ml 분취수로 저장
Natural Mouse LamininLife Technologies23017-0151 mg/ml 분주액으로 저장
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Life TechnologiesC10337
Synth-A-Freeze 냉동 보존 미디어Life TechnologiesA12542-01
Prolong Gold Antifade MountantLife Technologies47743-73610 mg/ml 100 µ로 저장; l 부분 표본
Moxi Z Mini 자동 세포 카운터Orflo MXZ001
Moxi Z 카세트 타입 SOrflo MXC002
재조합 쥐 섬유아세포 성장 인자, 염기성(bFGF)Peprotech450-33H20에서 0.1% BSA에 재현탁하고 20mg/ml 분취량으로 저장
Poly-D-LysineSigmaP78861X PBS에 재현탁하고 10mg/ml 100 µ로 저장; l 분취량
카르베니실린, 디소듐 솔Thermo Fisher ScientificBP2648-110 mM Hepes pH 7.4에 재현탁 및 100 mg/ml로 분취
ml 피펫 개별 포장 페이퍼백 (200/케이스)Thermo Fisher Scientific1367811D
10 ml 피펫 개별 포장 페이퍼백 (200/케이스)Thermo Fisher Scientific1367811E
조직 배양 처리된 Biolite 24-웰 플레이트Thermo Fisher Scientific130188
조직 배양 처리된 Biolite 6-웰 플레이트Thermo Fisher Scientific130184 
조직 배양 처리된 6cm 접시Thermo Fisher Scientific130181 
EMD Millipore Millex 멸균 주사기 PVDF 필터 기공 크기: 0.22 & mThermo Fisher ScientificSLGV033RS
TipOne 필터 피펫 팁 0.1 - 10 μ l 길쭉한 필터 팁USA Scientific1120-3810
TipOne 필터 피펫 팁 1 - 20 μ l 필터 팁USA Scientific1120-1810
TipOne 필터 피펫 팁 1 - 200 μ 엘  필터 팁USA Scientific1120-8810
TipOne 필터 피펫 팁 101 - 1000 μ l 필터 팁USA Scientific1126-7810
15ml 원뿔형 튜브 멸균 25개 튜브 20봉지(500개 튜브)USA Scientific1475-0511
50ml 원뿔형 튜브 멸균 25개 튜브(500개 튜브) 20봉지USAScientific1500-1211
5

참고문헌

  1. Petit, C., Richardson, G. P. Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function. Nat Neurosci. 12 (6), 703-710 (2009).
  2. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary' noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
  4. Huth, M. E., Ricci, A. J., Cheng, A. G. Mechanisms of aminoglycoside ototoxicity and targets of hair cell protection. Int J Otolaryngol. 2011, 937861-93 (2011).
  5. Brigande, J. V., Heller, S. Quo vadis, hair cell regeneration? Nat Neurosci. 12 (6), 679-685 (2009).
  6. Groves, A. K. The challenge of hair cell regeneration. Exp Biol Med (Maywood). 235 (4), 434-446 (2010).
  7. Okano, T., Kelley, M. W. Stem cell therapy for the inner ear: recent advances and future directions. Trends Amplif. 16 (1), 4-18 (2012).
  8. Ronaghi, M., Nasr, M., Heller, S. Concise review: Inner ear stem cells--an oxymoron, but why? Stem Cells. 30 (1), 69-74 (2012).
  9. Chen, W., et al. Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors. Nature. 490 (7419), 278-282 (2012).
  10. Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. , (2013).
  11. Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141 (4), 704-716 (2010).
  12. Diensthuber, M., Oshima, K., Heller, S. Stem/progenitor cells derived from the cochlear sensory epithelium give rise to spheres with distinct morphologies and features. J Assoc Res Otolaryngol. 10 (2), 173-190 (2009).
  13. Doetzlhofer, A., White, P., Lee, Y. S., Groves, A., Segil, N. Prospective identification and purification of hair cell and supporting cell progenitors from the embryonic cochlea. Brain Res. 1091 (1), 282-288 (2006).
  14. Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
  15. Martinez-Monedero, R., Yi, E., Oshima, K., Glowatzki, E., Edge, A. S. Differentiation of inner ear stem cells to functional sensory neurons. Dev Neurobiol. 68 (5), 669-684 (2008).
  16. Oshima, K., Senn, P., Heller, S. Isolation of sphere-forming stem cells from the mouse inner ear. Methods Mol Biol. 493, 141-162 (2009).
  17. Nishimura, K., Nakagawa, T., Sakamoto, T., Ito, J. Fates of murine pluripotent stem cell-derived neural progenitors following transplantation into mouse cochleae. Cell Transplant. 21 (4), 763-771 (2012).
  18. Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409(2012).
  19. Jiang, H., et al. Lineage analysis of the late otocyst stage mouse inner ear by transuterine microinjection of a retroviral vector encoding alkaline phosphatase and an oligonucleotide library. PLoS One. 8 (7), e69314(2013).
  20. Sapede, D., Dyballa, S., Pujades, C. Cell lineage analysis reveals three different progenitor pools for neurosensory elements in the otic vesicle. J Neurosci. 32 (46), 16424-16434 (2012).
  21. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132 (7), 1687-1697 (2005).
  22. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134 (24), 4405-4415 (2007).
  23. Neves, J., Parada, C., Chamizo, M., Giraldez, F. Jagged 1 regulates the restriction of Sox2 expression in the developing chicken inner ear: a mechanism for sensory organ specification. Development. 138 (4), 735-744 (2011).
  24. Mak, A. C., Szeto, I. Y., Fritzsch, B., Cheah, K. S. Differential and overlapping expression pattern of SOX2 and SOX9 in inner ear development. Gene Expr Patterns. 9 (6), 444-453 (2009).
  25. Kiernan, A. E., et al. Sox2 is required for sensory organ development in the mammalian inner ear. Nature. 434 (7036), 1031-1035 (2005).
  26. Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. Sox2 induces neuronal formation in the developing mammalian cochlea. J Neurosci. 30 (2), 714-722 (2010).
  27. Kwan, K. Y., Shen, J., Corey, D. P. C-MYC transcriptionally amplifies SOX2 target genes to regulate self-renewal in multipotent otic progenitor cells. Stem Cell Reports. 4 (1), 47-60 (2015).
  28. Dittami, G. M., Sethi, M., Rabbitt, R. D., Ayliffe, H. E. Determination of mammalian cell counts, cell size and cell health using the Moxi Z mini automated cell counter. J Vis Exp. (64), (2012).
  29. Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
  30. Furue, M. K., et al. Heparin promotes the growth of human embryonic stem cells in a defined serum-free medium. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (36), 13409-13414 (2008).
  31. Lotz, S., et al. Sustained levels of FGF2 maintain undifferentiated stem cell cultures with biweekly feeding. PLoS One. 8 (2), e56289(2013).
  32. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
  33. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  34. Ruben, R. J. Development of the inner ear of the mouse: a radioautographic study of terminal mitoses. Acta Otolaryngol. , Suppl 220. 1-44 (1967).
  35. Matei, V., et al. Smaller inner ear sensory epithelia in Neurog 1 null mice are related to earlier hair cell cycle exit. Dev Dyn. 234 (3), 633-650 (2005).
  36. Lee, Y. S., Liu, F., Segil, N. A morphogenetic wave of p27Kip1 transcription directs cell cycle exit during organ of Corti development. Development. 133 (15), 2817-2826 (2006).
  37. Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. 126 (8), 1581-1590 (1999).
  38. Hasson, T., et al. Unconventional myosins in inner-ear sensory epithelia. J Cell Biol. 137 (6), 1287-1307 (1997).
  39. Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, 33(2011).
  40. Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
  41. Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 11 (3), 271-276 (2005).
  42. Kim, W. Y., et al. NeuroD-null mice are deaf due to a severe loss of the inner ear sensory neurons during development. Development. 128 (3), 417-426 (2001).
  43. Liu, M., et al. Essential role of BETA2/NeuroD1 in development of the vestibular and auditory systems. Genes Dev. 14 (22), 2839-2854 (2000).
  44. Ma, Q., Anderson, D. J., Fritzsch, B. Neurogenin 1 null mutant ears develop fewer, morphologically normal hair cells in smaller sensory epithelia devoid of innervation. J Assoc Res Otolaryngol. 1 (2), 129-143 (2000).
  45. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  46. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  47. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  48. Blanchard, J. W., et al. Selective conversion of fibroblasts into peripheral sensory neurons. Nat Neurosci. 18 (1), 25-35 (2015).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

정오


Formal Correction: Erratum: Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to the Authors section in: Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells.

One of the authors' names was corrected from:

Jadali Azadeh

to:

Azadeh Jadali

태그

iMOPbFGFEdUCdkn1b Cdh1Cdkn1b Tubb3
불멸화 된 다 능성 귀의 전구 세포의 분화를 초기화
문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.