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방법 논문

관리 및 분산 연구를위한 절지 동물에 단백질 마크를 검출

7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53693

⸱

2016년 1월 28일

 , 
1USDA-ARS, Arid-Land Agricultural Research Center

이 논문에서

요약

단백질은 분산 연구를 위해 절지동물을 표시하는 데 자주 사용됩니다. 절지동물에 내부 및 외부 단백질 표시를 관리하는 방법이 입증됩니다. 간접 또는 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 통한 단백질 마크 검출 기술도 설명되어 있습니다.

초록

모니터링 절지 동물의 움직임은 종종 더 나은 관련된 인구 역학, 분산 패턴, 기주 식물의 환경 설정 및 기타 생태 학적 상호 작용을 이해하는 것이 필요합니다. 절지 동물은 일반적으로 고유의 마크를 태그에 의해 자연에서 추적 한 다음 다시 수집 그들의 분산 기능을 결정하기 위해 시간과 공간을 통해들을 수 있습니다. 이러한 착색 도료 또는 먼지 등의 실제 물리적 태그 외에, 단백질의 다양한 유형에 대한 생태 학적 연구 절지 마킹하는 데 매우 효과적인 것으로 입증되었다. 단백질은 내부 및 / 또는 외부로 투여 할 수있다. 단백질이어서 특이 단백질 효소 면역 분석법 (ELISA)과 수복 절지 검출 될 수있다. 여기에서 우리는 외부와 내부에 단백질과 절지 동물에 태그를위한 프로토콜을 설명합니다. 간단한 두 실험 예는 증명되어 국소 적으로 단백질이 풍부한 규정 식 및 (2)의 외부 단백질 마크를 제공하여 곤충에게 소개 (1) 내부 단백질 마크의료용 분무기를 사용하여 곤충 pplied. 우리는 다음과 샌드위치 곤충 단백질 마크를 검출하는데 사용될 간접 ELISA 방법을 단계별로 설명 관한 것이다. 이 데모에서는, 마크 릴리스 탈환, 마크 캡처, 연구의 자기 마크 캡처 유형의 절지 동물의 수집 및 단백질 마커 검출의 다양한 측면은 immunomarking 절차가되었습니다 다양한 방법과 함께 설명되어 있습니다 연구 목적의 다양한 적합하도록.

서론

자연에서 절지 동물 해충, 천적 (기생 포식자), 및 수분 매개자의 움직임을 추적하는 것은 생태계 서비스를 개선하는 방법에 대한 이해에 필수적이다. 분산 연구의 대부분의 유형에 대한 핵심 요소는 관심의 절지 동물 (들) 태그를 신뢰할 수있는 방법을 가지고있다. 다양한 재료 (예를 들면, 도료, 염료, 착색 먼지, 태그, 희귀 원소, 단백질) 동작, 및 다른 생태 상호 1,2- 먹이, 그 집단의 동력학, 분산 능력을 평가하는 절지 동물을 표시하는 데 사용되어왔다.

주어진 분산 연구에 사용 마커의 적절성의 연구가 진행되고 유형에 의존 할 것이다. (1) 마크 릴리스 탈환 (MRR), (2) 마크 캡처, (3) 자기 마크 캡처 : 절지 동물을 표시하기위한 세 가지 범주화가 있습니다. 마크 릴리스 탈환 조사의 경우, 조사는 일반적으로 laborato에 집합 절지 동물을 표시RY 및 필드 중앙 지점에서 릴리스 그들을. 절지 동물은 다음 다른 수집 장치 (예를 들어, 스위프 그물, 진공, 접착 트랩) 3,4,5를 사용하여 다양한 공간과 시간 간격에서 다시 캡처됩니다. 특정 마크가 기본 개인 해제 구별 할 탈환 표본은 다음 검사합니다. 마크 캡처 연구, 연구자는 일반적으로 필드 사용하는 스프레이 장비 (예를 들어, 배낭 분무기, 붐과 노즐 스프레이)에서 직접 표를 적용한다. 마크 캡처 연구를위한 최적의 마커는 저렴하고 쉽게 절지 동물의 서식지에 적용됩니다. 자기 마크 캡처 연구, 연구자는 보통 절지 동물 미끼 6,7 또는 둥지 입구 8 마크를 적용합니다. 차례로, 절지 동물은 둥지를 빠져 나갈 때까지 마크에 대해 "칫솔질"에 의해 외부에 표시된 미끼 또는 삼키려에 의해 내부적으로 자체를 표시합니다.

위에서 언급 한 바와 같이, 마커의 많은 유형이 우리를왔다ED는 절지 동물 종의 다양한 태그를. 그러나 거의 이러한 분산 연구 범주의 세 가지 유용하다. 단백질 immunomarking 절차의 개발은 곤충 마킹 돌파구이었다. Immunomarking은 절지 동물에 단백질 라벨을두고 내부적 또는 외부 적으로, 이는 차례로, 항 - 단백질 특정 효소 면역 분석법 (ELISA)에 의해 검출된다. 사용 된 최초의 단백질 마커는 토끼 면역 글로불린 (IgG를) 닭의 IgG / IGY 9,10했다. 그들은 MRR과 자기 마크 캡처 연구 (설명 참조)에 매우 효과적 마크 입증했다. 불행하게도, IgG의 / IGY 단백질은 비용이 많이 드는 때문에 마크 캡처 연구 및 자체 마크 캡처 연구의 대부분의 유형에 대한 실질적인 없습니다. 그 후, 2 세대 단백질 검출 ELISA를 닭 달걀 흰자 (알부민), 우유 (카제인)과 두유 (트립신 억제제 단백질)에 포함 된 단백질을 위해 개발되었다. 각각의 분석은, 매우 민감한 특정, 가장중요한 것은, 훨씬 적은 비용의 IgG / IGY 단백질 (11)보다 단백질을 사용합니다. 이 단백질은 MRR, 마크 캡처, 자기 마크 캡처 연구 (토론 참조)에 대한 효과가 입증하고있다.

이 글에서, 우리는 기술과 단백질 마크 실험실 보존 연구를 수행하는 방법을 보여줍니다. 이러한 연구는 전계 분산 연구의 모든 유형에 필요한 조사의 첫 단계이다. 연구자가 표시 전에 필드 분산 연구에 착수을 대상 절지 동물 종에 유지됩니다 얼마나 알고 구체적으로는 중요하다. 여기, 우리가 설명하고 내부 및 외부 MRR 곤충, 마크 캡처, 자기 마크 캡처 형 현장 연구를 표시하는 방법을 보여줍니다. 우리는 간접적 샌드위치 ELISA를 함께 표시의 존재를 검출하는 방법을 보여줍니다.

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프로토콜

1. 내부 마크, 보존 및 검색 절차

  1. 내부 마킹 절차
    1. 인공 다이어트 또는 필드에서 사육 실험실 식민지에서 (n은 100 개인 ≈) 관심의 곤충을 수집하고 두 깨끗한 사육 용기로 나눕니다.
    2. 컨테이너 중 하나에 정규 20 ㎖ 다이어트 패킷 (표시되지 않은 음성 대조군 처리)를 놓습니다. , 1.0 ㎎ / ㎖ 닭의 IgG / IGY 용액 1.0 mL를 제 20 ㎖ 인공 다이어트 패킷을 보완 철저하게 혼합, 다른 용기에 넣습니다.
      주 : 관심 곤충 인공식이가 없으면 마크 또는 이들이 보통 (예를 들어, 녹색 콩 나방 달걀, 물, 설탕, 꿀)에 유지되어 어떠한 다이어트에 배치 될 수있다.
    3. 곤충은 24 시간 동안 그들의 먹이 활동을 재개하도록 허용합니다.
  2. 내부 마크 보존 절차
    1. 각 컨테이너에서 다이어트 패킷을 제거하고 승 곤충을 공급다른 음식 소스 i 번째 실험 (예를 들어, 녹색 콩)의 기간 동안을 유지합니다.
    2. 하루 (또는 임의의 시간 간격으로) 각각의 처리에서 곤충의 코호트 (N = 20)를 수집하고 -20 ℃에서 즉시 동결.
  3. 샌드위치 ELISA 절차
    1. 1 희석 토끼 방지 닭 ​​IGY 차 항체의 50 μl를 추가 트리스 500 깨끗한 ELISA 마이크로 플레이트의 각 웰에 식염수 (TBS)을 버퍼 및 RT (주에서 1 시간의 최소 품어 : 마이크로도 배양 할 수 O / N) 4 ° C에서.
    2. 판에서 항체를 취소하고 30 분 동안 1.0 % 무 지방 분유 용액 300 μL 잘 각을 차단합니다.
    3. 이전 배양 단계 기다리는 동안, TBS의 1.0 ㎖로 개별적으로 1.6 ml의 마이크로 원심 튜브에 냉동 곤충을 배치합니다.
    4. 완전히 균질화 될 때까지 깨끗한 유봉 각 곤충을 갈기 및 ELISA의 개별 아니라 각 샘플의 100 μl를 추가플레이트. 샘플을 1 시간 동안 실온에서 품어하도록 허용합니다.
    5. 각 ELISA 플레이트의 첫 번째 열에 우물 100 (TBS 계란 흰자) 음 (TBS 만 해당)과 긍정적 인 ㎕의 컨트롤을 추가합니다. 또한, 각 플레이트 (그림 1)의 마지막 열에서 8 우물에 부정적인 곤충 컨트롤 (표시되지 않은 곤충)의 100 μl를 추가합니다. 제어 샘플을 1 시간 동안 실온에서 품어하도록 허용합니다. 그림 1에서 제공하는 템플릿은 우리가 우리의 표준화 된 분석에 사용하는 템플릿입니다 있습니다. 웰에서 샘플의 위치는 연구자의 판단에 달려있다.
    6. 각 웰을 인산염 완충 식염수 (PBS) -tween로 3 회 세척 한 후 토끼 방지 닭의 IgG / IGY 고추 냉이 퍼 옥시 다제 1 희석과 결합의 50 μl를 추가 : 10,000 1 % 우유 솔루션을하고 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
    7. PBS-트윈 (tween)와 각 웰을 세 번 세척하고 각 웰에 테트라 메틸 벤지딘 (TMB) 기판의 50 μl를 추가합니다.
    8. 10 분 후, 웰을 읽어650 nm의 파장에서 설정된 마이크로 플레이트 분광 광도계.

figure-protocol-1
도 1의 전형적인 96에 사용 표준화 웰 명칭을 나타내는 개략도 웰 ELISA 마이크로. 각 판은 양의 단백질 제어 (POS Ctrl 키)에게 잘 전용 트리스 완충 염수 음성 대조군 전용 7 웰 (TBS)를 포함하고, 표시되지 않은 (음) 곤충 컨트롤 전용 탈환 곤충 (샘플 1 ... 80), 8 우물에 전념 80 개인 우물 (NEG Ctrl 키 1 ... 8). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 외부 표시, 보존 및 검색 절차

  1. 외부 마킹 절차
    1. 관심의 곤충 수집 (N 100 ≈2.5 cm 직경 구멍 실험실 콜로니로부터 두 1.0 L를 플라스틱 용기로 필드와 장소에서 개인) 각 용기의 측에서 펀칭.
    2. 의료 분무기를 사용하여 DH 2 O (음성 대조군 처리)의 1.0 ml의 첫 번째 컨테이너에 곤충 스프레이. 의료 분무기를 사용하여 닭고기 달걀 흰자의 5.0 % 용액 1.0 mL로 두 번째 용기에 곤충 스프레이.
    3. 표준 실험실 공기 콘센트에 분무기의 호스를 연결 한 다음 컨테이너의 2.5 cm의 구멍에 분무기의 입에 삽입합니다. 분무기가 증기를 생성 할 때까지, 점차적으로 공기 배출구를 켭니다.
    4. 달걀 흰자위 용액 (약. 2-5 분) 분배 될 때까지 (마킹) 살포를 계속합니다.
    5. 분무기를 제거하고, 플라스틱 용기의 구멍에 코르크 장소. 솔루션이 완전히 건조 될 때까지 곤충은 실온에서 방치한다.
  2. 외부 마크 보존 절차
    1. 마크에 더 이상 노출을 방지하기 위해 별도의 깨끗한 사육 용기에 건조 곤충의 각 처리를 놓습니다.
    2. 연구 기간 동안 곤충을 유지하기 위해 깨끗한 용기에 음식과 물을 추가합니다.
    3. 매일 각각의 치료에서 곤충의 코호트를 (N = 20) 수집 및 -20 ° C에서 즉시 동결.
  3. 간접 ELISA 절차
    1. 개별적으로 1.6 ml의 마이크로 원심 튜브에 얼어 붙은 곤충을 놓고 TBS의 1.0 ml를 추가합니다.
    2. 120 rpm으로 궤도 흔드는 세트에 1 시간 동안 샘플을 만끽 해보세요.
    3. 단계 1.3.5에 설명 된대로 부정과 긍정적 인 컨트롤을 추가합니다.
    4. 도 1에 도시 된 바와 같이, 침지 한 후, 새로운 96 웰 ELISA 플레이트에 80 지정된 샘플 웰 중 하나에 각 시료로부터 100 ㎕의 분취 액을 피펫 샘플을 실온에서 1 시간 동안 배양 허용 (주 :. 마이크로도 될 수있다 배양 O / N 4 ° C에서).
    5. 와 우물 세 번 씻어PBS-Tween 및 다음도 1 %를 각각 소 혈청 알부민 (BSA-PBS)을 함유하는 인산염 완충 식염수 300 μl를 추가한다.
    6. 실온에서 30 분 후 PBS-트윈 (tween)로 두 번 씻는다.
    7. 물론 각 PBS-BSA-실 웨트 (0.05 %)에서 8,000 실온에서 1 시간 동안 품어 : 1 희석 토끼 반 달걀 알부민 차 항체의 50 μl를 추가합니다.
    8. PBS-트윈 (tween)와 각 웰을 세 번 세척 한 후 1 희석 고추 냉이 과산화 효소와 결합 염소 항 - 토끼 IgG를 50 μL 추가 : 실온에서 1 시간 동안 PBS-BSA-실 웨트 (0.05 %)에서 2,000.
    9. PBS-트윈 (tween)와 각 웰을 세 번 세척하고 각 웰에 TMB 기판의 50 μl를 추가합니다.
    10. 10 분 후, 650 nm 파장으로 설정 마이크로 플레이트 분광 광도계로 웰을 판독.

3. 데이터 분석

  1. 아프로 풀링 음성 대조군에 기초한 표준 편차를 각각 ELISA 플레이트 상에 8 대조군 곤충의 평균 흡광도 값을 계산하고 계산M 주어진 연구 (12)의 ELISA 플레이트의 모든.
  2. ELISA 양성 임계 값을 획득하기 위해 각 ELISA 플레이트에 대해 얻어진 평균 여섯 배 풀링 표준 편차를 추가한다. 이 값 이상 흡광도 값을 산출 상관 곤충 시료 단백질 마크의 존재에 대한 긍정적 인 것으로 간주된다.

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결과

내부 표시 :

내부 마크 보존 시험의 결과는도 2a에 도시되어있다. 계산 된 ELISA 위험 임계 값은 0.054이었다. 전체 (전 4 샘플 날짜가 결합), 단백질없이 처리 된 곤충은 지속적으로 낮은 ELISA 값 (X = 0.038 ± 0.002, N = 80)을 수득 하였다. 반대로, 모든 곤충 단백질 농축 다이어트 일관 강한 ELISA 값 (X = 0.475 ± 0.221, N = 80)을 수득 공급.

외부 표시 :

...

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토론

절지 동물 단백질 immunomarking 절차는 먼저 세기 전 (9)의 4 분의 1 정도를 설명했다. 이후 절차는 내부 및 외부 투여의 IgG / IgYs를 사용 절지 동물의 다양한 분산 패턴을 연구하기 위해 적용되어왔다. 이 단백질은 지금까지 테스트 곤충 종의 다양한에 대한 확고한 마커를 입증했다. 그러나, 전술 한 바와 같이, IgG의 / IgYs를 사용하는 주요 한계는 이들이 매우 비싸다는 것이다. 따라서, IgG의 / IgYs는 MRR 및 곤충의 큰 배치는 작은 공간에 표시 할 수 있습니다 또는 마크가 다이어트 또는 미끼에 통합 될 수 자기 표시 유형 연구에만 유용하다. 여기, 우리는 내부 마크가 닭의 IgG / IGY 풍부 인공 다이어트 곤충의 슈팅이 골대를 공급하여 관리 할 수​​있는 방법의 간단한 데모를 제공했다. 차례대로, IgG에 / IGY는 샌드위치 ELISA를 이용하여 검출 하였다. 이 시스템은 이미 사용을 연구자들에게 특히 유리할 수있다자연스럽게 계란에서 발견 된 IgG의 / IGY를...

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공개 사항

이 책에서 상표명 또는 상업적 제품에 대한 언급은 특정 정보를 제공하는 목적으로 만이며, 미국 농무부에 의해 추천이나 보증을 의미하지는 않습니다. USDA는 평등 한 기회를 제공하는 고용 기관입니다.

감사의 글

자금은 농업 및 식품 연구 이니셔티브 경쟁 그랜트 아니에 의해, 부분적으로, USDA CRIS 5347-22620-021-00D에 의해 제공되었다. 식량 농업의 USDA 국립 연구소에서 2011-67009-30141. 우리는 요한나 Nassif의 기술 지원을 감사하고 있습니다. 우리는 또한 그림 3에서 사용 된 사진의 일부를 제공하기 위해 폴 베이커, 데이비드 호튼, 디에고 니에 토와 프랜시스 Sivakoff 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
식품 저장 용기 (곤충 사육 용)Rubbermaid / Tupperware다양한 크기다양한 제조업체 및 공급 업체. 메쉬 패브릭이 창에 접착되어 있습니다
소량 분무기(마이크로 미스트)Teleflex-Hudson RCI1881온라인 및 의료 용품점에서 구입할 수 있습니다. 다른 브랜드도 작동합니다.
마이크로 원심분리기 튜브, 1.6ml w/capContinental Lab Products4445.X유사한 유형이 모두 작동합니다. 우리는 뚜껑을 쉽게 열 수 있는 브랜드를 선호합니다.
마이크로 원심분리기 튜브용 스티로폼 보관 상자(5x20 그리드)RPI Corp.145746이 디자인은 튜브를 붐비지 않기 때문에 좋습니다.
디스펜서, 리피터Eppendorf4982000322이와 유사한 모든 것이 디스펜싱 속도를 높이는 데 도움이 됩니다.
유봉, 플라스틱 일회용 티슈 그라인더, 1.5mlKimble Chase749521-1500다양한 공급업체에서 사용할 수 있습니다. 유봉은 재사용을 위해 세척하고 오토클레이브할 수 있습니다.
BD Falcon ELISA 플레이트, 96-웰(평평한 바닥)BD351172
Ovation 피펫, 수동(20-200 &마이크로; l)VistaLab1057-0200 또는 1070-0200유사한 유형이 작동합니다. 이 모델은 인체공학적입니다.
저장소, 멸균 시약VistaLab4054-1000비슷한 것이 작동합니다.
전동 피펫, 8채널(50-1,200 & 마이크로; l) (Biohit eLine)Sartorius730391하나의 전자 모델을 선택해야 한다면 이 크기가 가장 유용합니다.
전동 피펫, 8채널(10-300 &마이크로; l) (Biohit eLine)Sartorius730361비슷한 것이 작동합니다.
매니폴드, 멀티웰 플레이트 와셔(8-위치, 직선)Sigma-AldrichZ369802 이와 유사한 모든 것이 수동 플레이트 세척에 적용됩니다.
흡광도 감지 기능이 있는 마이크로플레이트 리더Molecular DevicesSpectraMax 250이와 유사한 모든 것이 작동합니다.
닭 IgG/IgY미국 생물학I1903-15R다른 출처에서도 구할 수
달걀 흰자식료품점" 올 화이트", " 에그 비터", etc.와 95ml dH2O를 5% 용액에 혼합
Tris(Trizma Base)Sigma-AldrichT15032.42g/L로
TBS 염화나트륨(NaCl)Sigma-AldrichS988829.22g/L로 TBS 및 8.0  g⁠/⁠ L PBS
인산나트륨 이염기성(Na2HPO4))Sigma-AldrichS0876PBS
인산칼륨 일염기성(KH<>sub2PO4)의경우 Sigma-AldrichP56550.2g/L PBS
염화칼륨(KCl)Sigma-AldrichP9541의 경우 0.2g/L
, EIA 등급Sigma-AldrichP1379염이 용해된 후 PBS에 L당 0.5ml를 첨가합니다.
1% BSA가 함유된 PBSSigma-AldrichP3688Mix 1 패킷, 토끼에서 생산된 1 L dH2O
Anti-Chicken IgY(IgG) (전체 분자) 항체 (1:500)Sigma-AldrichC6409Mix 100 µ 50 ml TBS
분유, 분유 또는 신선한 우유 (1 %)식료품 점% 용액 용 1 L dH2< / sub >O
토끼 (1 : 10,000)시그마 - 알드리치A9046믹스 100 µ
l 토끼 (1 : 8,000)시그마 - 알드리치C6534묽게 125 µ에서 생성 된 1 % 우유 안티 닭 계란 알부민 항체의 1 L; l 1 L PBS-BSA
염소 안티 토끼 IgG 과산화 효소 접합체 (1 : 2,000)Sigma-AldrichA61541 L PBS-BSA에 0.5 ml를 희석한 다음 1.3  ml Silwet
Vac-In-Stuff (Silwet L-77) 실리콘-폴리에테르 공중합체Lehle SeedsVIS-01마지막 성분으로 추가
TMB Microwell One Component Peroxidase SubstrateSurModicsTMBW-1000-01
있습니다: 5ml PBS Tween 20 믹스 10 g 10 g 1 % 용액 안티 닭 IgY (IgG) (전체 분자) -과산화 효소 항체 1 에서

참고문헌

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