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방법 논문

조직 공학 알긴산 미세 입자와 Thermogelling 폴리 (N- 이소 프로필) -graft - 콘드로이틴 황산 복합 재료의 합성

11.7K 조회수

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DOI:

10.3791/53704

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2016년 10월 26일

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1Department of Chemical Engineering, Rowan University, 2Department of Biological Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Engineering, Drexel University

이 논문에서

요약

폴리 (N- 이소 프로필 아크릴 아미드) - -graft 콘드로이틴 설페이트 이루어지는 주사 조직 공학적 지지체는 (PNIPAAm-g-CS) 함유 알긴산 미립자를 제조 하였다. 속성 및 생체 적합성 시험 관내에서 팽윤 접착력은 본 연구에서 분석된다. 여기서 개발 된 특성화 기술 thermogelling 다른 시스템들에 적용 할 수있다.

초록

주사 생체 물질은 액체로 몸에 도입하고 현장에서 응고 될 수 이식 물질로 정의된다. 이러한 물질은 최소 침습적으로 쉽게 불규칙 모양의 결함에 공간을 채우는 고체를 형성 이식되는 임상 적 이점을 제공합니다. 주사 생체 재료 널리 조직 공학을위한 발판으로 조사되었다. 그러나 본문에 특정로드 베어링 영역의 수리를 들면, 추간판로, 비계는 접착 성을 소유해야합니다. 이 힘의 적절한 전송을 제공하는 운동 중에 전위의 위험을 최소화하고 주변 조직에 밀착되도록한다. 여기, 우리는 열에 민감한 폴리 (N- 이소 프로필)로 이루어진 지지체의 제조 및 특성 -graft - 콘드로이틴 황산 (PNIPAAM-g-CS) 및 알지네이트 미세 입자를 설명합니다. PNIPAAm-g-CS 공중 합체 alginat로 RT 중의 점성 용액을 형성즉 입자의 밀착성을 향상시키기 위해 정지된다. 30 ° C의 주위 하부 임계 용액 온도 (LCST) 위의 공중 합체 미립자 주위에 단단한 겔을 형성한다. 우리는 계정에 PNIPAAm-g-CS의 가역적 상전이을 표준 생체 재료 특성화 절차를 적용했다. 결과는 5 %로 50 또는 75 ㎎ / ㎖ 알긴산 입자의 혼입 (/ w를 V) PNIPAAm-g-CS 용액 단독 PNIPAAm-GCS의 접착 인장 강도 (p <0.05) 네 배로 것을 나타낸다. 알지네이트 미세 입자의 결합도 크게 조직 결함 내에서 공간을 채우는 젤을 유지하는 데 도움 PNIPAAm-g-CS의 붓기 용량 (P <0.05) 증가한다. 마지막으로, 2,3- 비스 관내 독성 분석 키트의 결과 (2- 메 톡시 -4- 니트로 -5- 술포 페닐) -2H- 테트라 졸륨 -5- carboxanilide (XTT) 및 라이브 / 죽은 생존력 분석법는 것을 나타 접착제 생존 캡슐화 인간 배아 신장 증식을 지원할 수있다 (HEK) 293 C오일 이상 ELL 학생.

서론

주사 가능한 생체 물질 편리 액체로 체내에 전달 반응계에서 고화 될 수들이다. 이러한 물질은이 셀 (5)을위한 3 차원 임시 외 기질로서 해당 사이트 1-4 행위 캡슐화 세포 전달하기 위해 사용되는 재생 의료에 광범위하게 적용되고있다. 주입 수술 절차와 최소 침습있는 고상 불규칙 정의 크기 임플란트에 대한 필요성을 제거, 조직 결손 형 채울 수 있기 때문에 환자의 경우, 주사 가능한 생체 물질이 유리하다.

입성는 다양한 메커니즘을 통해 달성 될 수있다. 외부 요인은 pH를 원한다면, 세포 및 생체 활성 분자를 캡슐화 6-8 겔의 형성을위한 트리거로 조사되었다. 그러나, pH는 모든 생리적 환경에서 사용하기 가장 편리한 트리거하지 않을 수 있습니다. 또 다른 전통 알터입성을 달성적인 시츄 화학 중합 또는 가교 결합에 사용된다. 그룹은 암모늄 및 N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine 이루어지는 수용성 산화 환원 시스템을 개발하여 폴리에틸렌 글리콜과 폴리 (프로필렌) 9,10 글리콜 이루어지는 거대 단량체의 반응을 위해 사용했다. ZAN 외. 11 개발 주사 키토산 폴리 비닐 네트워크는 글루 타르 알데히드와 가교 결합. 이러한 시스템에서, 반응성 성분의 세포 독성은 세포, 특히 밀봉에 관련된 애플리케이션에 고려되어야한다. 또한, 발열 중합은 고분자 뼈 (12, 13)를 시멘트에 대해보고 된 주변 조직을 손상 충분히 높은 온도를 생성 할 수 있습니다.

또 다른 주사 가능한 중합체 시스템은 트리거로 온도를 고체 상태로부터 액체의 변화를 나타내는 개발되었다. thermogelling 시스템으로 알려진 이들은 aqueo 있습니다우리 현장 형성 (14)에 달성하기 위해 화학적 자극, 단량체 또는 가교제를 필요로하지 않는 폴리머 솔루션을 제공합니다. 오히려 보통 생리 온도 근처에서 발생하는 위상 변화는 물리적으로 가교 된 3 차원 네트워크의 형성을 유도한다. 이러한 플루로 닉 F127과 같은 폴록 사머은 약물 전달 15-17 세포 캡슐화 (18, 19)를 thermogelling에 가장 널리 연구 폴리머 중입니다. 그러나, 물론 이러한 겔이 생리적 조건에서 안정성이 부족한 것이 허용된다. 연구 사슬 연장 제 (20) 또는 화학적 가교제 (21, 22)를 사용하여 향상된 안정성을 증명하고있다. 그럼에도 불구하고,이 시약의 사용은 전지 밀봉 용 재료의 가능성을 제한 할 수있다.

폴리 (N- 이소 프로필)은 조직 공학 및 약물 전달 (14)에 상당한 관심을 받았다 합성 thermogelling의 중합체이다. 폴리의 수용액 (N-isoprop아크릴 아미드) (PNIPAAm)는 낮은 임계 용액 온도 (LCST)를 나타내는 일반적으로 약 32 발생 - 34 ° C (23, 24)를. LCST 아래, 물 PNIPAAm 체인 수분을. 전이 온도 이상의 중합체 독성 모노머 또는 가교 결합제를 사용하지 않고 극적인 상분리 25-27 고체 겔의 형성을 초래 소수성된다. 그러나 PNIPAAm 단독 중합체는 가난한 탄성 특성을 나타낸다 의한 소수성 (28)에 생리적 온도에서 약간의 물을 개최합니다. 본 연구에서는 효소 분해성 29 항 염증 활성 (30, 31), 및 증가 된 물 및 영양소 흡수 (32)에 대한 가능성을 제공 PNIPAAm 네트워크에 공유 콘드로이틴 설페이트를 포함하도록 선택. CS와 PNIPAAm 공중 합체는 그래프트 공중 합체 (PNIPAAm-g-CS)를 형성하는 메타 크릴 레이트 - 기능화 CS의 존재하에 단량체를 중합하여 NIPAAm 우리 실험실에서 제조 하였다. 벡공중 합체의 낮은 가교 밀도의 ause는 PNIPAAm-g-CS 인해 LCST 29 RT 중의 점성 용액 및 생리 온도에서 탄성 겔을 형성한다. 중합체 용액 인해 전환 가역성 다시 LCST보다 냉각시 유동성이된다.

우리는 PNIPAAm-g-CS 인해 기계 맞출 수있는 특성, 분해성, 인간 배아 신장 (HEK)와 cytocompatibility 293 세포 (29), 조직 공학 발판 역할을 할 수있는 잠재력을 가지고 있음을 증명하고있다. 그러나, 추간판 등의 특정 부하지지 영역에서, 조직 공학 골격은 탈구 (33)의 위험을 제거하기 위해 디스크 주변 조직과 상당한 계면을 형성 할 수있는 능력을 가져야한다. 이 인터페이스는 임플란트와 조직 (33) 사이의 인터페이스를 통해 힘의 적절한 전송을 위해 필요하다. 우리의 작업에서 우리는 중단 가지고lginate PNIPAAm-g-CS의 수용액에서의 미세 입자 및 겔화 조직 (34) 주변에 접착 성을 제공하는 미세 입자를 지역화 것을 발견했다. 본 논문에서는 thermogelling, 접착제 폴리머의 준비 단계를 설명합니다. 생존율의 표준 생체 재료 특성 세포 이미징을위한 기술 및 분석은 고려 중합체의 온도 감도와 위상 천이의 가역성을 취하도록 하였다. 이 문서에 설명 된 주사 중합체는이 문서에서 설명 된 이외의 약물 전달 및 조직 공학 응용 프로그램에 대한 다양한 가능성이있다. 또한, 여기에 설명 된 특성화 방법 thermogelling 다른 시스템들에 적용 할 수있다.

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프로토콜

1. 폴리 (N- 이소 프로필) -g-콘드로이틴 황산 합성

  1. 바이오 부착 하이드로 겔의 합성하기에 앞서, N- 이소 프로필 아크릴 아미드 (NIPAAm) 단량체 및 메타 크릴 레이트 콘드로이틴 설페이트 (CS) 정제.
    1. NIPAAm 적어도 10g을 칭량하고, 60 ℃에서 n- 헥산 400 ㎖ 중의 단량체를 용해. 완전히 용해 될 때까지 정기적으로 컨테이너를 저어. 24 시간에 대해 -20 ° C에 냉동 용액을 재결정.
    2. 용기 및 진공 필터로부터 흐너 깔때기를 사용하여, n- 헥산을 결정 성 단량체를 제거한다. 나머지 n- 헥산을 제거하기 위해 24 시간 동안 실온에서 진공 오븐에서 단량체를 놓는다. 나중에 사용하기 위해 -20 ° C 냉장고에있는 단량체를 저장 (단계 1.2 참조).
    3. 칭량하고 탈 이온수 8.0 ㎖에 콘드로이틴 설페이트 2.0 g을 용해. 조심스럽게 60 ℃로 용액을 가열한다.
    4. (w / w)의 50 %의 약 10 내지 40 μL를 사용하여 (10) 용액의 pH를 NaOH를 조절.
    5. 메타 크릴 산 무수물 (MA)의 0.298 ML을 추가합니다. 24 시간 동안 환류하에 60 ℃에서 교반하면서.
    6. -20 ℃로 냉장고에 항아리 냉각 O / N에 아세톤 용액 400ml를 붓는다.
    7. 24 시간 경과 후, 자기 교반 막대로 교반하면서 천천히 차가운 아세톤 400 mL를 메타 크릴 레이트로 전체 CS (MCS) 용액을 붓는다.
    8. 아세톤에서 MCS를 제거하고 진공 오븐에 침전물을 배치합니다. MCS에 대한 손상 및 응집 상태를 유지하기 위해 신속하게이 단계를 수행합니다. 잔류 아세톤은 최소 24 시간 동안 진공 상태에서 증발하도록 허용합니다.
  2. 정제 NIPAAm 10 g 및 탈 이온수 232 ㎖ 중의 2.209 g의 MCS 동시 - 녹인다.
  3. 불활성 질소 가스를 이용하여 산소를 제거 용액. 15 분에 걸쳐 버블 링에서 용액을 방지하기위한 활발한 아직 낮은 가스 유량을 유지한다.
  4. 질소 가스로 퍼징 용액을 계속 tetramethylet의 0.976를 가하여hylenediamine (TEMED).
  5. 이어서,과 황산 암모늄 (APS)의 97.6 mg을 혼합하여, 중합 반응을 개시.
  6. 약 20 초 동안 용액을 혼합하고 신속하게 용기에 유입하는 공기를 예방하기 용액을 밀봉. 이 솔루션은 24 시간 동안 형광등 아래에서 중합 할 수 있습니다.
  7. 24 시간 후, 37 ° C 오븐에 반응 용기를 놓습니다. 하이드로 겔은 겔 상태로, 액체에서 전환 할 수있다. 하이드로 겔 중에서 미 반응 모노머의 확산을 허용 7 일의 총 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)에서 중합 된 하이드로 겔을 담근다.
  8. 가위를 사용하여, 직경 5 ㎝보다 크지 않은 여러 개의 작은 조각으로 하이드로 겔을 절단. 액체에 겔 상태로부터 천이에서 하이드로 겔을 방지하기 위해, 37 ° C PBS 용액 내의 중합체 주사위. 50 ML 원뿔 튜브에 부분을 전송합니다.
  9. 의 상단을 포장하여 동결 건조에 대한 샘플을 준비매직 잉크를 킴 와이프와 고무 밴드와 튜브. 1 내지 2 시간 동안 -70 ℃에서 튜브를 고정.
  10. 하이드로 겔에서 물을 모두 제거하는 동결 건조기에 원뿔 튜브를 놓습니다. 사용하기 전에 동결 건조기는 각각 대략의 온도 및 압력 -40 C 0.04 밀리바 °에 도달 할 필요가있다. 칠일의 최소 완전 건조가 필요합니다.
  11. 나중에 사용 (단계 3.1 참조) 4 ° C 냉장고에 미세 분말 및 저장에 폴리머를 건조 동결을 갈기.

2. 칼슘 알지네이트 가교 미세 입자 합성

  1. 2 % 준비 (/ w를 V)를 탈 이온수 20 ㎖에 400 mg의 용해 알지네이트 용액. 용해를 용이하게하기 위해 약 60 ℃로 용액을 가열한다.
  2. 탈 이온수 20 ㎖에 400 mg을 첨가하여 (w / v)의 염화칼슘 용액을 2 %를 준비한다.
  3. 카놀라유 100 ㎖, 트윈 20의 1.0 ㎖, 20 ㎖의 물을 조합하여 혼합물을 오일 만들기2 % (w / v)의 알긴산. 15,000 rpm에서 균질화기로 10 분간 혼합 유화. 또한, 각각 크고 작은 미립자를 생성하기 위해 200 rpm으로 2,000 rpm으로 자기 교반 막대로 혼합한다.
  4. 2 %를 대기음 18 G 바늘 팁 주사기를 사용하여 염화칼슘 용액 (/ V w). 천천히 적가 에멀젼에 염화칼슘을 추가합니다.
  5. 염화칼슘의 20 ㎖이 소진 된 후에 에멀젼 내의 미립자가 10 분 동안 가교 결합 할 수있다.
  6. 균등 카놀라유의 초기 층을 제거하기 위해 2 분 동안 1,400 XG의 힘으로 덮인 50 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기로 미세 입자의 배치를 배포 할 수 있습니다.
  7. 연속적으로 세척, 소용돌이, 그리고 원심 분리기 이소프로판올로 미세 입자는 2 분 동안 1,400g 3 회 총 잔류 카놀라 기름을 제거합니다. 각 원심 분리 단계 후 이소프로판올 뜨는을 취소하고 신선한 이소프로판올로 세척한다.
  8. Oi의 일단리터가 제거 된, 잔류 이소프로판올을 제거하는 탈 이온수로 세척 절차에 세 추가 번 반복합니다. 각 원심 분리 단계 후 탈 이온수 뜨는을 취소하고 신선한 탈 이온수로 세척한다. 유리 병에 젖은 미립자 및 저장의 약 100 밀리그램을 제거합니다. 습식 미립자를 광학 현미경에 의해 배치의 평균 직경을 측정하는 데 사용된다.
    1. 광학 현미경을 사용하여 현미경 슬라이드를 탈 이온수에 젖은 미립자의 작은 샘플을 분산. 미립자의 크기에 따라 10 배 또는 20 배 대물 렌즈를 사용하고, 입자가 초점이 될 때까지의 개구를 조정한다. 현미경 올바른 목적을 위해 조정되어 있는지 확인하고 필요에 따라 광원의 밝기를 조정합니다. 50 임의 알지네이트 미세 입자의 가장 긴 직경을 측정하고 일괄 처리의 평균 크기를 얻기 위해 줄 도구를 사용합니다.
  9. 동결 건조 (B)의 미세 입자를 준비Y는 매직 잉크를 킴 와이프로 포장 및 고무 밴드로 고정. 1 시간 동안 -70 ℃에서 동결 미립자.
  10. 동결 건조기의 미립자를 놓고 샘플이 최소 24 시간 동안 건조 할 수 있습니다. 나중에 사용하기 위해 4 ° C 냉장고에 동결에게 박격포와 유 봉 저장소를 사용하여 미세 분말로 건조 된 미세 입자를 갈기 (단계 3.3 참조).

접착제 3. 준비

  1. 동결 건조 중합체 분말을 사용하여, 1X PBS 1 ㎖에 겔 분말을 50mg 용해시켜 PNIPAAm-g-CS 용액 (V / w) 5 %를 생성한다.
  2. 24 시간 동안 4 ℃의 냉장고에 와류와 냉기를 이용하여 용액을 혼합한다.
  3. 점성 용액을 형성하면, 하이드로 겔 용액 와류 동결 건조 알지네이트 미립자의 25 또는 50 mg을 첨가하여 균질 한 복합체를 만든다. 나중에 사용하기 위해 (단계 4.3 및 4.8 참조) 4 ° C에서 냉장고에 복합을 저장합니다.

4. 생체 접착 메크anical 인장 시험

  1. 이전 인장 시험을 수행하기 위해, 돼지 귀에서 연골 기질의 압축을 풉니 다.
    1. 따뜻한 0.9 %에서 돼지 귀 제상 (w / v)의 염화나트륨 수용액; 이 조직을 완화하는 데 도움이 될 것입니다.
    2. 메스를 사용하여, 표피층, 피하 조직 및 연골 비록 수직 절단 평평한 직사각형 영역 떨어져 분리하고 부. 돼지의 귀 곡선 능선을 절단하지 마십시오.
    3. 피하 조직을 평행 절단함으로써 연골에서 피부의 표피 층을 분리한다. 연골은 돼지의 피부 아래에 볼 수있는 하드, 흰색 조직이다.
    4. 조심스럽게 메스의 측면 연골에 부착 된 피하 조직을 긁어. 메스 블레이드와 연골 조직으로 절단하지 마십시오.
    5. 연골의 한쪽 만이 노출되고, 인장 시험 중 평탄한 것을 확인. 필요한 경우, 하부에 요철 피부를 절단함으로써 연골 평탄화.
    6. 1cm X 1cm의 크기와 여러 조각으로 연골 조직을 잘라. C 냉동고 °에서 -20 0.9 % (w / v)의 염화나트륨 용액으로 채워진 원뿔 튜브의 연골 조직을 저장합니다.
  2. 0.9 % (w / v)의 염화나트륨 용액 2.0 L를 준비합니다. 37 ° C로 식염수를 예열. 이 용액의 온도를 테스트 동안 유지 될 필요가있다.
  3. 얼어 붙은 연골을 해동. 돼지의 연골과 얼음 팩과 스티로폼 용기의 하이드로 겔 샘플을 모두 유지합니다.
  4. 테스트 스탠드의 팔에 힘 게이지를 부착합니다. 힘 스탠드 상단에 핫 플레이트를 놓고 50 ° C까지 온도를 설정합니다.
  5. 시아 노 아크릴 레이트 접착제와 스테인레스 스틸 블록과 핀셋에 연골의 1cm X 1cm 조각을 붙입니다. 델린 실린더에 연골의 추가 조각을 접착제와 힘 게이지에 실린더를 연결합니다. 모두 연골 표면이 서로 마주하고 하이드로 겔에 문의하는 것이 매우 중요합니다.
  6. 장소핫 플레이트의 상단에있는 플렉시 유리 물을 욕조 및 목욕 내부의 연골 기판과 스테인리스 스틸 블록을 삽입합니다.
  7. 테스트 스탠드의 팔을 내리고 서로 모두 연골 기판을 맞 춥니 다. 팔을 올리고 하이드로 겔을 적용 할 충분한 공간을 확보합니다.
  8. 용적 피펫 연골의 바닥 부분에 생체 접착 성 하이드로 겔을 200 μL 분주.
  9. 1mm의 힘 스탠드의 아암 상 / 분 하이드로 겔 콘택트 연골 상부 조각까지 0.001 N.의 프리로드 힘을가
  10. 볼륨이 지정 수위에 도달 할 때까지 수조에 37 ℃의 생리 식염수를 부어. 열전대를 가진 용액의 온도를 확인한다.
  11. 하이드로 겔 5 분 총 설정할 수 있습니다. 겔이 고체화되면, 2mm / 분의 속도로 암을 올린다. 바이오 부착이 연골 기질에서 분리 후 또는 강제의 상당한 저하가 발생하면 테스트가 완료고장 신호.
  12. 기록 된 데이터를 수집하고 테스트 스탠드의 팔을 올립니다. 힘 게이지에서 델린 실린더를 제거합니다. 이전 용기에 식염수를 붓고 37 ° C로 재가열.
  13. 동일한 속도로 승온없는 연골 또는 접착제와 함께 "빈"을 델린 부착 부력의 중합체에 의해 가해지는 힘을 감산하고, 접착 면적으로 나누어 응력을 계산한다.

알긴산 미세 입자와 PNIPAAm-g-CS 5. 붓기 연구

  1. 깨끗한 유리 병을 준비하고 시점, 샘플 타입, 샘플 번호를 적절하게 레이블을 붙입니다. 전술 한 바와 같이, 접착제는 또한 생성 될 수있다. 시점에 따라 각각의 샘플 유형에 대해 5 개의 샘플 (N = 5)의 총을 준비합니다.
  2. 모든 유리 병을 미리 무게 RT에서 초기 질량을 기록한다.
  3. 주사기를 사용하여 다섯 개의 튜브 각각에 준비된 접착제 샘플의 약 0.4 mL로 분배.모든 테스트 시점에서 각각의 샘플 유형에 대해이 단계를 반복합니다.
  4. 체중 및 RT에서 접착제 샘플 타입 바이알의 질량을 기록한다.
  5. 궤도 인큐베이터와 37 ° C에 1X PBS 용액 1 L를 미리 따뜻하게.
  6. 랙에 유리 병을 모두 정리하고 인큐베이터에 랙을 삽입합니다. 접착제는 약 5 ~ 10 분 동안 겔에 액체에서 전환 할 수 있습니다.
  7. 각 바이알에 1X PBS의 5.0 ML을 추가합니다. 신중하게 떨어져 파손 하이드로 겔 디스크를 방지하기 위해 유리 병의 측면을 따라 PBS 솔루션을 추가해야합니다.
  8. PBS를 용액의 증발을 방지하고, 37 ° C의 배양기의 내부 온도를 유지하기 위해 각각의 바이알을 캡핑. 하이드로 겔 디스크의 각 세트는 시간의 지정된 기간 동안 PBS에 잠긴 상태로 유지해야한다.
  9. 7 일간의 시점에 도달 한 후, 바이알의 뚜껑을 벗기다 세트를 각 바이알로부터의 PBS 용액을 제거한다. RT에서 다시 접착 샘플 각 유리 병의 무게를.

6. 라이브 / 죽은 분석을 사용하여 정성 세포 생존

  1. PNIPAAm-g-CS와 라이브 / 죽은 분석을 수행하기 전에, 인간 배아 신장 80 %의 합류에 293 세포 (HEK-293)을 성장.
    1. 이어서 15ml의 원뿔형 튜브에 5 분 동안 39 ° C에서 400 XG에서 세포를 원심 분리하여, 37 ° C의 물을 용기에 cryovial 배치하여 고정 된 HEK-293 세포 현탁액을 급속 해동.
    2. 제 1 통로 세포 성장 배지하려면 (4.5 g / L) 둘 베코 변형 20 %의 최종 농도 및 100X 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액에 열 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS)과 이글 배지 (DMEM) (높은 포도당 결합 펜 연쇄상 100 IU / ml의 페니실린 및 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신을 최종 농도). 다른 모든 통로를 들어, 10 % FBS 및 1X 펜 연쇄상 구균과 DMEM로 전환합니다.
    3. 성장 배지 10 ㎖에서 세포 펠렛을 재현 탁 한 100mm 직경의 배양 접시에, 현탁액을 전송. 균등 D부드럽게 백업하는 요리 앞을 기울여 세포를 istribute과 몇 번 각 방향을 왼쪽에서 오른쪽.
    4. 배양 5 % CO 2, 37 ℃에서 가습 배양기에서 세포. 필요한 경우, 매 2 일 매체를 변경합니다.
    5. 세포가 80 % 포화 상태에 도달하면, 여러 요리에 문화를 복제합니다. 플레이트에서 매체를 제거합니다.
    6. 접시에 0.5 % 트립신 1 ML을 추가합니다. 플레이트는 10 분 동안 37 ℃에서 배양 할 수 있습니다. 세포가 부드럽게 플레이트 소용돌이에 의해 표면에서 분리 있는지 확인합니다.
    7. 문화 1:10, 분할의 경우 트립신 세포에 정규 성장 배지 (DMEM 10 % FBS)의 9를 가하여 부드럽게 접시를 기울여 섞는다.
    8. 각각의 새 접시에 희석 세포 현탁액 1 ㎖를 분배 및 성장 매체의 9를 가하여. 조심스럽게 접시를 기울여 섞는다.
    9. 배양 5 % CO 2, 37 ℃에서 가습 배양기에서 세포. 필요한 경우, 어느 매체를 변경y를 셀 때까지 이틀 80 %의 합류에 도달합니다.
  2. 80 %의 합류로 성장이 배양 접시에서 용지를 제거합니다.
  3. 각각의 판에 0.5 % 트립신 1 ML을 추가합니다. 플레이트는 10 분 동안 37 ℃에서 배양 할 수 있습니다. 세포가 부드럽게 플레이트 소용돌이에 의해 표면에서 분리 있는지 확인합니다.
  4. 배 성장 매체 3 ㎖와 함께 접시에 HEK-293 세포를 씻으과 같은 15 ML 원뿔 튜브에 모두 현탁액을 추가합니다.
  5. 4 ° C에서 400 XG에서 10 분 동안 15 ML 원뿔 튜브를 원심 분리기.
  6. 상층 액을 제거하고로 pipetting 아래로 매체의 3 ㎖의 세포 펠렛을 resuspend.
  7. 피펫으로 혈구 세포 현탁액 10 μL 및 세포 밀도를 결정하는 세포 수를 수행한다. 농도가 너무 낮 으면, 목표 승낙을 보존하기 위해, 볼륨 감소 반대로 초기 세포 농도가 너무 높으면 중간의 서스펜션 부피를 증가시키고,1 × 106 세포 / ml의 배급. 원심 분리기는 HEK-293 400 XG에 세포 따라 미디어 보정 부피 세포 펠렛을 재현 탁.
  8. 부드럽게 세포 현탁액 와동 균등 다음 시험 조건에 대해 네 개의 개별 15ml의 원뿔형 튜브에 세포 혼합물을 분산 : PNIPAAm-g-CS에서 양성 대조군 단층 마이너스 살해 제어 (V / V) 메탄올 70 %를 사용하여 HEK-293 알지네이트 미세 입자로 PNIPAAm-g-CS에 캡슐화 PNIPAAm-g-CS에 캡슐화 된 세포 및 HEK-293 세포.
  9. 4-6 복제 샘플을 생성하기 위해 24 웰 플레이트 세포 믹스 여러 300 μL 부피 피펫 팅하여 양성 대조군 단일 층을 생성한다.
  10. 알지네이트 미세 입자로 사망 제어, PNIPAAm-g-CS 및 PNIPAAm-g-CS에 관한 원뿔 튜브에서 용지를 제거합니다.
    1. 400 XG에 5 분 동안 원뿔 튜브를 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다.
    2. ㄴ을 재현 탁하여 동일한 세포 농도를 유지제거 된 미디어로 PNIPAAm-g-CS의 같은 볼륨에서 ELL 학생. 최대 및 균질 때까지 혈청 학적 피펫을 사용하여 아래로 폴리머 전지 믹스를 피펫.
      1. 알긴산 미립자로 시딩되면 35 mm dish에 (6.10.2에 기술 된 바와 같이 수득)을 PNIPAAm-g-CS 세포 현탁액을 전달하고 혼합으로 입자를 소개한다. 최대 및 균질 때까지 혈청 학적 피펫을 사용하여 아래로 셀 믹스를 피펫.
    3. 6 복제 샘플 - 혈청 학적 피펫을 사용하여, 사망 제어를위한 각 웰에 폴리머 전지 믹스의 여러 300 μl를 분배, PNIPAAm-g-CS 및 알지네이트 미세 입자와 PNIPAAm-g-CS 4를 생성합니다.
  11. (중합체가 불투명 한 흰색 디스크를 형성) 10 ~ 15 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어과 PNIPAAm-g-CS는 겔 액체에서 전환 할 수 있습니다.
  12. 후드에서 슬라이드 따뜻한 놓고 37 ° C까지 온도를 설정합니다. 웰 플레이트를 유지하기 위해 따뜻한 슬라이드를 사용하여온도와 피펫 각 웰에 미리 예열 미디어 600 μL. 또한 액체 상태의 중합체의 전이를 방지하기 위해, 위의 공기를 따뜻하게 접시 위에 형광 전구 램프를 배치합니다.
  13. 5 % CO 2와 37 ° C에서 5 일 동안 세포를 품어.
  14. 오일이 경과 한 후, 에티 디움 호모 다이머 (EthD-1)과 칼 세인의 AM을 사용하여 라이브 / 죽은 색소 믹스를 준비합니다. 두 물질은 빛에 민감하고 사용 당일에 준비가되어 있습니다.
    1. RT에서 키트에서 칼 세인의 AM과 EthD-1을 해동.
    2. 원뿔 관에 멸균 1X PBS의 5 ML을 추가하고 알루미늄 호일에 포장.
    3. 원뿔 튜브에 2 mM의 EthD-1의 6.67 μl를 추가합니다. 완전히 혼합 용액을 소용돌이.
    4. 다음으로, 원뿔 튜브에 4 MM의 칼 세인의 AM 2.5 μl를 추가합니다. 철저하게 혼합물을 소용돌이.
  15. 단일 층 (양성 대조군), PNIPAAm-g-CS 및 PNIPAAm-g-CS 지혜의 우물에서 용지를 제거H 알긴산 미립자. PBS로, 철저하게, 조심스럽게 우물을 모두 세척하고 PBS를 제거합니다.
  16. 알긴산 미립자를 함유하는 하이드로 겔 디스크 RT에서 액화하고, 각 웰에 50 mM의 시트르산 나트륨 2 ㎖를 추가 할 수있다.
  17. 살해 세포 우물에서 미디어 (음성 대조군)를 제거합니다. 하이드로 겔 디스크는 실온에서 액화 및 각 웰에 70 % (v / v)의 메탄올 300 μl를 추가 할 수 있습니다.
  18. 37 ° C에서 45 분 동안 접시를 품어.
  19. 웰에서 시트르산 나트륨 메탄올 용액을 제거하고 개별적인 마이크로 원심 튜브에 하이드로 겔 현탁액 각각의 피펫. 하이드로 겔 현탁액으로부터 세포를 분리하기 위해 10 분 동안 2,000 XG에서 튜브를 원심 분리기.
  20. 조심스럽게 원뿔 튜브에서 솔루션을 피펫 팅하여 세포 펠렛 뒤에 남겨 정지를 제거합니다. PBS 300 μL에 펠렛을 재현 탁하고 원래 잘 판에 전송할 수 있습니다.
  21. t의 300 μl를 추가그 / 웰의 각각에 죽은 염료 혼합 라이브. 알루미늄 호일에 잘 판을 싸서 실온에서 로커에 45 분 동안 품어.
  22. 이미지 10X 목적으로 반전 형광 현미경 모든 샘플. 살아있는 세포 살해 세포는 각각 녹색과 빨간색 형광 표시됩니다.

XTT의 분석을 사용하여 7 양적 세포 생존

  1. 80 %의 합류에 HEK-293 세포를 성장. 두 개의 배양 접시에서 성장 용지를 제거합니다.
  2. 각각의 판에 0.5 % 트립신 1 ML을 추가합니다. 플레이트는 10 분 동안 37 ℃에서 배양 할 수 있습니다. 세포가 부드럽게 플레이트 소용돌이에 의해 표면에서 분리 있는지 확인합니다.
  3. 두 미디어의 3 ㎖와 함께 접시에 HEK-293 세포를 씻으과 같은 15 ML 원뿔 튜브에 모두 현탁액을 추가합니다.
  4. 4 ° C에서 400 XG에서 10 분 동안 15 ML 원뿔 튜브를 원심 분리기.
  5. 상등액을 제거하고 용지 (3)를 가하여 세포 펠렛을 재현 탁로 pipetting 아래로.
  6. 피펫으로 혈구 세포 현탁액 10 μL 및 세포 밀도를 결정하는 세포 수를 수행한다. 전술 한 바와 같이, 1 × 106 세포 / ml의 목표 농도를 유지. 원심 분리기는 HEK-293 400 XG에 세포 따라 미디어 보정 부피 세포 펠렛을 재현 탁.
  7. 부드럽게 세포 현탁액 와동 균등 다음 시험 조건에 대해 네 개의 개별 15ml의 원뿔형 튜브에 세포 혼합물을 분산 : PNIPAAm-g-CS에서 양성 대조군 단층 마이너스 살해 제어 (V / V) 메탄올 70 %를 사용하여 HEK-293 알지네이트 미세 입자로 PNIPAAm-g-CS에 캡슐화 PNIPAAm-g-CS에 캡슐화 된 세포 및 HEK-293 세포.
  8. 6 복제 샘플 - (4)를 생성하기 위해 24 웰 플레이트에 세포 믹스 300 μl를 피펫 팅에 의해 긍정적 인 제어 단일 층을 만듭니다.
  9. 살해 제어에 관한 원뿔 튜브에서 용지를 제거, PNIPAAm-g-CS 및 PNIPAAm-G-알지네이트 미세 입자와 CS.
    1. 400 XG에 5 분 동안 원뿔 튜브를 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다.
    2. 제거 매체와 같은 PNIPAAm-g-CS와 동일한 부피의 세포를 재현 탁하여 동일한 세포 농도를 유지한다. 최대 및 균질 때까지 혈청 학적 피펫을 사용하여 아래로 셀 믹스를 피펫.
      1. 알지네이트 미세 입자로 시드 경우 35mm 배양 접시에 PNIPAAm-g-CS-세포 현탁액을 전송하고 혼합으로 입자를 소개합니다. 최대 및 균질 때까지 혈청 학적 피펫을 사용하여 아래로 셀 믹스를 피펫.
    3. 6 복제 샘플 - 혈청 학적 피펫을 사용하여, 사망 제어를위한 각 웰에 폴리머 전지 믹스 300 μl를 분배, PNIPAAm-g-CS 및 알지네이트 미세 입자와 PNIPAAm-g-CS 4를 생성합니다.
  10. 일단 세포 함유 시료 모두 24 웰 플레이트에 첨가되고, PNIPAAm-g-CS 및 PNIPA 여러 300 μL 부피를 분배6 복제 샘플 - AM-g-CS 인접 우물에서 세포없이 알지네이트 미세 입자와 4를 생성합니다.
  11. (중합체 불투명 백색 디스크를 형성하는) 10 내지 15 분 동안 37 ° C에서 24 웰 플레이트를 인큐베이션하고 PNIPAAm-g-CS는 겔에 액체에서 전환 할 수있다.
  12. 후드에서 슬라이드 따뜻한 놓고 37 ° C까지 온도를 설정합니다. 각 웰에 미리 예열 분명 DMEM의 웰 플레이트 온도와 피펫 600 μl를 유지하기 위해 슬라이드 따뜻한을 사용합니다. 또한 액체 상태의 중합체의 전이를 방지하기 위해, 위의 공기를 따뜻하게 접시 위에 형광 전구 램프를 배치합니다.
  13. 5 % CO 2에서 37 ° C에서 5 일 동안 세포를 인큐베이션.
  14. 오일이 경과 한 후, 제조에서 2,3- 비스 - (2- 메 톡시 -4- 니트로 -5- 술포 페닐) -2H- 테트라 졸륨 -5- carboxanilide (XTT) 시약을 준비한다. XTT 시약은 사용 당일 빛에 민감하고 준비가되어 있습니다.
    1. 황색 병이 포함 제거냉장고에서 XTT 분말을 보내고. 멸균 주사기와 주사 바늘을 사용하여, 황갈색 병에 고무 격막을 통해 분명 DMEM (페놀 레드 없음) 5 ㎖를 주입.
    2. 10 분 동안 또는 용해 될 때까지 수조에서 56 ℃까지 반응물을 가열 하였다.
    3. 또한 알루미늄 호일에 싸서 15 ML 원뿔 튜브에 20 % (v / v)의에 XTT 시약을 희석. 마이크로 원심 튜브에 과잉 XTT 시약을 나누어지는 및 장기 저장을 위해 -20 ° C 냉장고에 넣습니다.
  15. 살해 세포 우물에서 미디어 (음성 대조군)을 제거하고 각 웰에 70 % (v / v)의 메탄올 300 μl를 추가합니다. 37 ° C에서 45 분 동안 품어 우물에서 메탄올을 제거합니다.
  16. 단일 층 (양성 대조군), PNIPAAm-g-CS 및 PNIPAAm-g-CS 알지네이트 미세 입자와의 나머지 우물에서 용지를 제거합니다. PBS로, 철저하게, 조심스럽게 우물을 모두 세척 한 후 PBS를 제거합니다.
  17. 2 300 μl를 추가웰 각각 0 % XTT 시약. 알루미늄 호일에 24 웰 플레이트를 싸서 실온에서 로커에 24 시간 동안 배양한다.
  18. 24 시간 후, 모든 웰을 50 mM의 시트르산 나트륨 200 μL를 추가 한 추가 시간 동안 로커에서 배양한다.
  19. RT에서 10 분 동안 2,000 XG에서 마이크로 원심 분리기 튜브에 중합체 현탁액 모두 옮긴다.
  20. 96 웰 플레이트에 각 microcentrifuge 관에서 상등액 200 μL를 옮긴다. 미세 적정 플레이트 판독기를 사용하여 690 nm에서 450 nm의 비특이적 흡광도 판독 값에 특정의 흡광도 판독 값을 얻었다.

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결과

열적 반응 그래프트 공중 합체를 성공적으로 합성 및 생체 접착 강도를 특징으로, 속성을 팽창하고, 생체 외 cytocompatibility에 있었다. 우리는 인해 잘 설립 점막 부착 특성에 알긴산을 조사하기로 결정했습니다. 14.9 ± 59.7 μm의 평균 직경을 갖는 미립자는 알긴산, 5 % 배합 (W / V) 25, 50, 75 ㎎ / ㎖의 농도에서 PNIPAAm-g-CS. 이러한 농도는 동일 반, 및 수용액 PNIPAAm-g-CS의 두 배에 해당 건조 중량을 기준으로 하였다. 75 mg의 상기 미립자 농도 / ㎖ 과도한 점도를 나타내과 조사되지 않았다. 5 %의 최대 인장 접착 강도 (W / V) PNIPAAm-g-CS 알지네이트 미립자의 농도 변화 형 하이드로 겔과 비교되었다. (/ V W) PNIPAAm-g-CS가 4 배 INC 결과 (50) 75 mg을 첨가는 / 알긴산 미립자 ml의 5 %에 ​​현탁인장 강도 (p에 rease

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토론

하이드로 겔 미세 입자 복합체를 합성하고 접착 강도를 평가, 능력 및 세포 생체 적합성을 붓기 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. PNIPAAm-g-CS의 자유 라디칼 중합은 콘드로이틴 설페이트 성공적 메타 크릴 단량체 성분을 완전히 용해 및 무산소 반응 조건을 필요로한다. 이 네이티브 추간 원판 조직 (29)과 유사한 기계적 특성을 갖는 공중 합체를 생성하기 위해, 우리의 이전 연구에서 입증 되었기 때문에, 반응 혼합물 중 메타 크릴 레이트 콘드로이틴 설페이트 NIPAAm 단량체의 비율은 선택되었다. 하이드로 겔 콘드로이틴 설페이트의 양을 늘리면 겔화 중에 수분 손실을 감소시키고, 따라서 겔의 압축 강성이 감소한다. 수용액에 용해 될 때 메타 크릴 화의 선택도는도 18 G 바늘을 통하여 입성 유리한 처리 특성을 갖는 하이드로 겔을 제조하는 것으로 입증 된 29. LCST 아래 증가 용액 점도를 일으키고 기능을 팽윤 겔을 감소 고분자 네트워크의 가교 밀도를 증가 할 CS의 크릴 교체 증가...

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공개 사항

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

저자는 감사 접착 인장 시험 프로토콜의 개발에 박사 제니퍼 Kadlowec의 도움을 인정하고 싶습니다.

이 책에서보고 된 연구는 관절염 및 근골격계 및 피부 질환의 국립 연구소와 보너스 번호 1R15의 AR 063920-01에서 바이오 메디컬 이미징 및 국립 보건원의 생물의 국립 연구소에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
N-이소프로필아크릴아미드, 99%, 순수, 안정화된AcrosOrganics 2210-25-5헥산
콘드로이틴 설페이트로 냉장 및 제거 A 나트륨 염(소 기관에서)Sigma-Aldrich39455-18-0냉장
헥산Fisher ScientificH302-4가연성 캐비닛에 보관
수산화나트륨 50%(w/w) 수산화나트륨Fisher ScientificSS254-1자연 가성
메트크릴 무수물Sigma-Aldrich276685 강한 연기; 흄 후드에 사용
AcetoneFisher ScientificA18-4사용 전에 냉장고에서 식히십시오
질소 가스Praxair7727-37-9부품 번호: NI 4.8, 실린더 스타일 T, 99.998% 순수 질소 (아르곤은 대체 불활성 가스로 사용될 수 있음)
테트라메틸에틸렌디아민, 99% 엑스트라 퓨어Acros Organics110-18-9
과황산암모늄Sigma AldrichA3678물이 있는 곳에서 흡습성 및 분해
인산염 완충 식염수 정제Fisher ScientificBP2944건조 유지
알긴산, 나트륨 염AcrosOrganics 177775000열을 사용하여 용해
를 돕습니다.염화칼슘 이수화물Fisher ScientificC79
카놀라유현지 상점 지역 상점에서구입
Tween 20Sigma-Aldrich93773
70% (v/v) 이소프로포아놀Fisher ScientificA416-4
돼지 귀Haine's Pork Shop지역 정육점에서 구입
염화나트륨Fisher ScientificS271-3
인간 배아 신장 293 세포ATCCATCC CRL-1573장기 사용을 위해 액체 질소에 보관
DMEM: 1x, 고포도당, 피루브산 없음Life Technologies11965126냉장
태아 소 혈청Life Technologies10082-147냉장
Penn Strep: 10,000 U/mlLife Technologies15140-122냉장
트립신-EDTA: 0.5%, 10xLife Technologies15400-054냉장
메탄올VWRAAA44571-K7
생세포 생존율 키트Life TechnologiesL3224감광성, 냉동
XTT 세포 생존율 키트Sigma AldrichTOX2-1KT감광성, 냉동 유지
투명 DMEM: 1x, 고포도당, 페놀 없음Life Technologies21063-029냉장
Dulbecco's PBS: 1xLife Technologies14190136냉장
구연산나트륨EMDSX0445-1
용적식 피펫BrandTech Scientific, INC2702904디스펜싱 100 - 500 &마이크로; l는 붙일 수 있는 끝
아니오 3로 옵니다. 스테인레스 스틸 메스 핸들Sigma AldrichS2896
Miltex 멸균 수술 블레이드Fisher Scientific12-460-440크기 10
파워 젬 균질화 기Fisher Scientific08-451-660모델 # 125
도자기 모르타르 및 유봉Sigma AldrichZ24746450ml
FreeZone 1L 벤치탑 동결 건조 시스템Labconco7740020사용 전 샘플 동결
오일 밀봉 로터리 베인 펌프EdwardsA65301906모델 # RV5
인큐베이팅 오비탈 쉐이커VWR12620-946모델 # 980153
벤치탑 냉장 원심분리기Forma Scientific, INC모델 # 5682
가열 오븐VWR모델 # 1235PC
2 N 힘 게이지ShimpoFGV-0.5XY모델 # FGV-0.5XY
E-force 테스트 스탠드ShimpoFGS-200PV모델 # FGS-200PV
조직 배양 스윙 버킷 원심 분리기Beckman Coulter366830모델 #6S-6KR
조직 배양 마이크로 원심 분리기Eppendorf모델 #5415C
혈구계 세트Hausser Scientific3720교체 용 커버 유리 필요
슬립 슬라이드 워머랩 사이언티픽XH-2022모델 # XH-2002
휴대용 난방 램프언더라이터 연구소폴리머 온도를 37°C로 유지하는 데 도움을 줍니다; C
도립 형광 현미경Zeiss모델 Axiovert 25 CFL
온수 수조VWR모델 # 1235PC
흔들 플랫폼VWR시리즈 100
Multiskan FC 마이크로 타이터 플레이트 리더Thermo ScientificType 357
세포 배양 인큐베이터VWR모델 # 2350T
정수기 클래스 II 생물 안전 캐비닛LabconcoDelta 시리즈

참고문헌

  1. Bidarra, S. J., Barrias, C. C., Granja, P. L. Injectable alginate hydrogels for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomater. 10, 1646-1662 (2014).
  2. Choi, J., et al. Human extracellular matrix (ECM) powders for injectable cell delivery and adipose tissue engineering. J. Control. Release. 139, 2-7 (2009).
  3. Selvam, S., Pithapuram, M. V., Victor, S. P., Muthu, J. Injectable in situ. forming xylitol-PEG-based hydrogels for cell encapsulation and delivery. Colloid Surface B. 126, 35-43 (2015).
  4. Park, K. M., Lee, S. Y., Joung, Y. K., Na, J. S., Lee, M. C., Park, K. D. Thermosensitive chitosan-pluronic hydrogel as an injectable cell delivery carrier for cartilage regeneration. Acta Biomater. 5, 1956-1965 (2009).
  5. Ren, K., He, C., Xiao, C., Li, G., Chen, X. Injectable glycopolypeptide hydrogels as biomimetic scaffolds for cartilage tissue engineering. Biomaterials. 51, 238-249 (2015).
  6. Chiu, Y. L., et al. pH-triggered injectable hydrogels prepared from aqueous N-palmitoyl chitosan: In vitro characteristics and in vivo biocompatibility. Biomaterials. 30, 4877-4888 (2009).
  7. Shim, W. S., et al. pH- and temperature-sensitive, injectable, biodegradable block copolymer hydrogels as carriers for paclitaxel. Int. J. Pharm. 331, 11-18 (2007).
  8. Singh, N. K., Insitu Lee, D. S. gelling pH- and temperature-sensitive biodegradable block copolymer hydrogels for drug delivery. J. Control. Release. 193, 214-227 (2014).
  9. Wang, B., Zhu, W., Zhang, Y., Yang, Z., Ding, J. Synthesis of a chemically-crosslinked thermo-sensitive hydrogel film and in situ of model protein drugs. React. Funct. Polym. 66, 509-518 (2006).
  10. Zhu, W., Ding, J. Synthesis and characterization of a redox-initiated, injectable, biodegradable hydrogel. J. Appl. Polym. Sci. 99, 2375-2383 (2006).
  11. Zan, J., Chen, H., Jiang, G., Lin, Y., Ding, F. Preparation and properties of crosslinked chitosan thermosensitive hydrogel for injectable drug delivery systems. J. Appl. Polym. Sci. 101, 1892-1898 (2006).
  12. Togawa, D., Bauer, T. W., Lieberman, I. H., Takikawa, S. Histologic evaluation of human vertebral bodies after vertebral augmentation with polymethyl methacrylate. Spine. 28, 1521-1527 (2003).
  13. Berman, A. T., Reid, J. S., Yanicko, D. R., Sih, G. C., Zimmerman, M. R. Thermally induced bone necrosis in rabbits: relation to implant failure in humans. Clin. Orthop. Relat. R. 186, 284-292 (1984).
  14. Kretlow, J. D., Klouda, L., Mikos, A. G. Injectable matrices and scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Adv Drug. Deliver. Rev. 59, 263-273 (2007).
  15. Ye, F., Yaghmur, A., Jensen, H., Larsen, S. W., Larsen, C., Ostergaard, J. Real-time UV imaging of drug diffusion and release from Pluronic F127 hydrogels. Eur. J. Pharm. Sci. 43, 236-243 (2011).
  16. Akash, M. S., Rehman, K. Recent progress in biomedical applications of pluronic (PF127): Pharmaceutical perspectives. J. Control Release. 209, 120-138 (2015).
  17. Sellers, D. L., Kim, T. H., Mount, C. W., Pun, S. H., Horner, P. J. Poly(lactic-co-glycolic) acid microspheres encapsulated in Pluronic F-127 prolong hirudin delivery and improve functional recovery from a demyelination lesion. Biomaterials. 35, 8895-8902 (2014).
  18. Jung, H., Park, K., Han, D. K. Preparation of TGF-β1-conjugated biodegradable pluronic F127 hydrogel and its application with adipose-derived stem cells. J. Control. Release. 147, 84-91 (2010).
  19. Lee, S. Y., Tae, G. Formulation and in vitro of an in situ photo-polymerizable pluronic hydrogel suitable for injection. J. Control. Release. 119, 313-319 (2007).
  20. Chen, Y. Y., Wu, H. C., Sun, J. S., Dong, G. C., Wang, T. W. Injectable and thermoresponsive self-assembled nanocomposite hydrogel for long-term anticancer drug delivery. Langmuir. 19, 3721-3729 (2013).
  21. Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Materials for cell encapsulation via a new tandem approach combining reverse thermal gelation and covalent crosslinking. Macromol. Chem. Physic. 203, 1466-1472 (2002).
  22. Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Towards a fully-synthetic substitute of alginate: development of a new process using thermal gelation and chemical cross-linking. Biomaterials. 25, 5115-5124 (2004).
  23. Hirokawa, Y., Tanaka, T. Volume phase transition in a nonionic gel. J. Chem. Phys. 81, 6379-6380 (1984).
  24. Freitas, R., Cussler, E. L. Temperature sensitive gels as extraction solvents. Chem. Eng. Sci. 42, 97-103 (1987).
  25. Schild, H., Tirrel, D. A. Microcalorimetric detection of lower critical solution temperatures in aqueous polymer solutions. J. Chem. Phys. 94, 4352-4356 (1990).
  26. Yagi, Y., Inomata, H., Saito, S. Solubility parameter of an N-isopropylacrylamide gel. Macromol. 25, 2997-2998 (1992).
  27. Illmain, F., Tanaka, T., Kokufuta, E. Volume transition in a gel driven by hydrogen bonding. Nature. 349, 400-401 (1990).
  28. Vernengo, J., Fussell, G. W., Smith, N. G., Lowman, A. M. Evaluation of novel injectable hydrogels for nucleus pulposus replacement. J. Biomed. Mater. Res. B. 84, 64-69 (2008).
  29. Wiltsey, C., et al. Characterization of injectable hydrogels based on poly(N-isopropylacrylamide)-g-chondroitin sulfate with adhesive properties for nucleus pulposus tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 24, 837-847 (2013).
  30. Ronca, F., Palmieri, L., Panicucci, P., Ronca, G. Anti-inflammatory activity of chondroitin sulfate. Osteoarthr. Cart. 6, 14-21 (1998).
  31. Pipitone, V. Chondroprotection with chondroitin sulfate. Drug. Exp. Clin. Res. 17, 3-7 (1991).
  32. Moss, M., Kruger, G. O., Reynolds, D. C. The effect of chondroitin sulfate on bone healing. Oral Surg. Oral Med. O. 20, 795-801 (1965).
  33. Nerurkar, N., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria fo intervertebral disc tissue engineering. J. Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
  34. Wiltsey, C., et al. Thermogelling bioadhesive scaffolds for intervertebral disk tissue engineering: Preliminary in vitro of aldehyde-based versus alginate microparticle-mediated adhesion. Acta Biomater. 16, 71-80 (2015).
  35. Xia, Y., Yin, X., Burke, N., Stover, H. Thermal response of narrow-disperse poly(N-isopropylacrylamide) prepared by atom transfer radical polymerization. Macromol. 38, 5937-5943 (2005).
  36. Liu, Q., Zhang, P., Qing, A., Lan, Y., Lu, M. Poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels with improved shrinking kinetics by RAFT polymerization. Polymer. 47, 2330-2336 (2006).
  37. Lemoine, D., Wauters, F., Bouchend'homme, S., Preat, V. Preparation and characterization of alginate microspheres containing a model antigen. Int. J. Pharm. 176, 9-19 (1998).
  38. Dang, T. D., Joo, S. W. Preparation of tadpole-shaped calcium alginate microparticles with sphericity control. Colloid. Surface. B. 102, 766-771 (2013).
  39. Moebus, K., Siepmann, J., Bodmeier, R. Novel preparation techniques for alginate-polaxamer microparticles controlling protein release on mucosal surfaces. Eur. J. Pharm. Sci. 45, 358-366 (2012).
  40. Lih, E., Lee, J. S., Park, K. M., Park,, D, K. Rapidly curable chitosan-PEG hydrogels as tissue adhesives for hemostasis and wound healing. Acta Biomater. 8, 3261-3269 (2012).
  41. Urban, J., Maroudas, A. Swelling of the intervertebral disc in vitro. Connect. Tissue Res. 9, 1-10 (1981).
  42. Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64, 273-281 (2003).
  43. Leslie, S. K., et al. Controlled release of rat adipose-derived stem cells from alginate microbeads. Biomaterials. 34, 8172-8184 (2013).
  44. Peroglio, M., Eglin, D., Benneker, L. M., Alini, M., Grad, S. Thermoreversible hyaluronan-based hydrogel supports in vitro. and ex vivo. disc-like differentiation of human mesenchymal stem cells. Spine J. 13, 1627-1639 (2013).
  45. Chen, J. P., Cheng, T. H. Thermo-responsive chitosan-graft-poly(N-isopropylacrylamide) injectable hydrogel for cultivation of chondrocytes and meniscus cells. Macromol. Biosci. 6, 1026-1039 (2006).
  46. Schoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: an in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol. Bioeng. 50, 374-381 (1996).
  47. Dai, J., Wang, H., Liu, G., Xu, Z., Li, F., Fang, H. Dynamic compression and co-culture with nucleus pulposus cells promotes proliferation and differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells. J. Biomech. 47, 966-972 (2014).
  48. Feng, G., et al. Effects of hypoxias and scaffold architecture on rabbit mesenchymal stem cell differentiation towards a nucleus pulposus-like phenotype. Biomaterials. 32, 8182-8189 (2011).
  49. Feng, G., et al. Hypoxia differentially regulates human nucleus pulposus and annulus fibrosus cell extracellular matrix production in 3D scaffolds. Osteoarth. Cartilage. 21, 582-588 (2013).

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