Method Article

에서 결정 셀룰로오스 축적의 높은 해상도 정량 애기 장대 뿌리 조직 특이 세포 벽 수정을 모니터링하는

DOI:

10.3791/53707

⸱

May 10th, 2016

 ,  ,  , 
1Faculty of Biology, Technion-Israel Institute of Technology, 2Smith Institute of Plant Sciences and Genetics in Agriculture, Hebrew University of Jerusalem

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

결정질 셀룰로오스는 식물 세포벽의 중요한 구성 성분입니다. 그러나 세포 분해능에서 정량화하는 것은 기술적으로 어렵습니다. 여기에서는 시공간 해상도에서 세포벽 구성에 대한 정보를 얻기 위해 편광 기술과 뿌리 단면을 사용하는 방법을 보고합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

식물 세포는 세포벽으로 둘러싸여 있으며, 세포벽의 구성에 따라 최종 크기와 모양이 결정됩니다. 세포벽은 결정 구조와 비정질 조직의 셀룰로오스 사슬을 모두 형성하는 셀룰로오스 미세섬유를 포함하는 다당류를 포함하는 복잡한 매트릭스로 구성됩니다. 셀룰로오스 섬유의 방향과 농도는 세포의 기계적 특성을 결정합니다. 결정질 셀룰로오스의 수준을 결정하기 위해 여러 가지 방법이 사용되며, 각 방법은 장점과 한계를 모두 가지고 있습니다. 일부는 전체 셀룰로오스 내에서 결정 영역의 비율을 구별 할 수 있습니다. 그러나 시공간 정보가 부족한 전체 장기 분석에 국한됩니다. 라이브 이미징에 의존하는 다른 사람들은 부정확한 염료를 사용하여 제한됩니다. 여기에서는 Arabidopsis thaliana 뿌리의 단면에서 결정질 셀룰로오스 축적을 나타내는 상대 광 지연의 특정 정량화를 위한 민감한 편광 기반 시스템을 보고합니다. 이 방법에서는 세포 해상도와 해부학적 데이터가 유지되어 성장하는 뿌리를 구성하는 서로 다른 조직을 직접 비교할 수 있습니다. 이 접근 방식은 새로운 분석 차원을 열어 세포벽 구성, 세포 행동 및 전체 장기 성장 사이의 연관성을 밝힙니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

식물 세포벽 동적 구조이다. 성장하는 세포는 세포를 확장 할 수있는 조직의 주요 세포벽에 의해 둘러싸여있다. 예금에게 공장의 기계적인 지원을 강화하는 더 엄격한 보조 벽 성장을 중지 세포. 두 셀 벽은 다양한 발달 단계에 걸쳐 다양하며 1,2 어떤 조직이 다른 구조 (예를 들면, 펙틴 및 헤미셀룰로오스)의 다당류 매트릭스에 포함 된 마이크로 피 브릴 셀룰로오스로 구성된다. 셀룰로오스 단단히 결정 구조의 마이크로 피 브릴을 형성하도록 정렬된다 (1,4) -β-D 글루칸 체인을 합성한다. 비정질 셀룰로오스는 글루칸 체인이 덜 정렬 영역을 의미한다. 결정질과 비결정질 영역 사이의 비율은, 기계적 강도 및 점탄성 특성은 각각 3을 제공함으로써 세포벽의 기계적 특성에 영향을 미치는 것으로 생각 하나의 파라미터이다. 여러 가지 방법이 있었다X 선 회절 및 교차 편광 / 고체 NMR 4 매직 회전 각도를 검출하고 그 중에서도 셀룰로오스 장치의 두 가지 형태를 정량화하기 위해 개발. X 선 회절 시료 5 비정질 셀룰로오스 도메인 대 결정의 비율을 결정하기 위해 사용될 수있다. 다른 방법은 각각 결정형 및 비정질 셀룰로스 또는 다른 중합체를 구별 할 수 불용성 산 및 산 - 가용성 물질로 세포벽 콘텐츠 분류를 사용한다. 이 접근법에서, 표지 된 글루코스 ([14 C] 포도당)의 혼입 셀룰로오스 -6,7-를 정량화하는데 사용된다. 이러한 방법은 기껏 전체 장기 분석 용 식물 물질 대량 필요하며, 따라서, 세포벽 구조의 조직 - 특이 적 변화에 민감 부적절하다. 셀룰러 해상도의 셀룰로오스 마이크로 피 브릴의 가시화의 변화를 식별 할 수있는, 형광 염료 8,9 결합 라이브 영상 연구에서 달성 될 수있다셀룰로오스 마이크로 피 브릴의 방향. 그러나, 이들 염료는 정량을 위해 사용되지 않으며, 이들은 셀룰로오스 결정질 특정되지 않고 칸막이 벽 (8)의 일반적인 구조를 방해 할 수있다. Polscope은 광속 분할 광 (10)의 일부를 지연하는 결정질 셀룰로오스의 능력에 의존하여 이미징 기술이다. 빛 지연은 빛의 전파 방향에 수직으로 놓여 미세 섬유에 대한 강한입니다. 유사한 방향으로 미세 섬유의 경우, 광 지연도 11 클수록 결정 성 (결정도)이 높아진다. 따라서, polscope는 상대적 수준과 셀룰로오스 미세 섬유의 방향 모두를 연구하는 데 사용됩니다.

들이 빠르게 (12)을 확장하기 전에 뿌리는 세포 분열의 시리즈를 거쳐 세포 루트의 끝에서, 줄기 세포의 틈새에서 발생하는 동안의 선형 증가를 나타낸다. 루트를 포함하는 세포는 방향성 (이방성)에 확대같이, 칸막이 벽 (13)의 특성에 영향 소분자 시그널링 호르몬에 의해 지시있다. 호르몬 차동 응답 시간과 공간의 균형 장기 성장 14을 보장하는 수단을 제공한다. 따라서, 세포벽 구조의 고해상도 분석 나은 전체 장기 성장 세포 유형 특이 반응 사이의 연결을 이해하는데 필요한 중요 정보를 제공 할 수있다. 여기서는 높은 품질의 해부학 적 부분에서 관찰 된 바와 같이, 애기 뿌리 결정 셀룰로오스의 조직 - 특이 적 축적을 연구 polscope의 구현을보고한다. 이 방법은 최근에 호르몬 활성 공간 (15)의 섭동에 응답하여 결정 셀룰로오스 세포 유형 특이 적 축적을 발견.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 식물 성장

  1. 표면 씨앗을 소독.
    1. 습식 또는 건식 방법으로 (30 밀리그램까지) 종자를 소독. 예를 들어, 건조 멸균 방법에 대해, 적어도 4 시간 동안 밤새까지 폐쇄 데시 케이 터 내에서 유리 비이커에서 50 ml의 표백제에 1 ml의 빙 염산 37 %를 추가한다. 화학 후드에서이 단계를 수행합니다.
  2. 0.5 배 무라 시게 및 스쿡 (MS) 배지에서 0.8 % 공장 한천와 접시에 멸균 씨앗을 확산. 파라 필름 또는 다공성 테이프로 번호판을 랩과 알루미늄 호일로 커버.
  3. 균일 한 발아를 촉진하기 위해 4 일 - 1 4 ° C에서 접시를 저장합니다.
  4. 애기 모종 재배에 적합한 성장 챔버에 접시를 전송합니다. 한천 배지 위에 뿌리 성장을 유지하고 침투를 방지하기 위해 수직으로 판을 놓습니다.
  5. 전송 모종은 발아 (DAG) 후 7 일 정착액합니다.

2. 고정

  1. 50 ㎖ 리처드슨 Solutio 준비이중 증류수에 1 %의 붕사 (완충제), 1 % 메틸렌 블루와 1 % 하늘빛 (조직 학적 염료)의 동일한 볼륨을 결합하여 N. 사용하기 전에 0.22 μm의 PVDF 필터 장치를 구동 주사기를 통해 필터링합니다.
  2. 0.05 M 나트륨 Cacodylate (완충제)에 1.25 %의 글루 타르 알데히드 : 정착액의 50 ㎖를 준비합니다.
    참고 :이 물질은 독성 및 화학 후드에서 처리해야합니다.
  3. 최종 정착 용액을 얻었다 정착 용액 리차드슨 용액 100 ㎕을 (2.1 참조) (2.2 참조)를 추가한다.
  4. 마크 해당 샘플 이름으로 6 웰 플레이트의 각 웰.
  5. 묘목, 한 번 전송이 완전히 액체로 덮여 될 수 있도록, 우물에 (2.3 참조) 3 ㎖ 최종 고정 솔루션을 - 2를 넣습니다.
  6. 조심스럽게 각 웰에 10 모종까지, 집게를 사용하여 전송합니다. 파라 필름을 사용하여 번호판을 밀봉합니다. 적어도 하나의 밤, 최대 일주에 어둠 속에서 4 ° C에서 보관,.

3. 탈수

    <리> 모종을 탈수. 여기에 열거 된 에탄올의 농도를 증가 함유 신규 6- 웰 플레이트의 웰간에 전송 : 10 %의 에탄올을 15 분 동안; 15 분 동안 30 %의 에탄올; 15 분 동안 50 %의 에탄올; 15 분 동안 70 % 에탄올; 15 분 동안 85 %의 에탄올; 15 분 동안 95 %의 에탄올; 하룻밤, 최소 4 ° C, 95 % 에탄올. 조심스럽게 플라스틱 집게로 바람직 자신의 자엽에 의해 그들을 잡고 모종을 처리합니다.

4. 침투

  1. 침투 매체를 준비합니다. 작은 유리 병에 50ml의 기본 수지 액 키트와 historesin 키트 활성제 한 백의 내용물을 혼합한다. 20 분 동안 자석 교반한다. 침투 매체는 몇 주 동안 4 ℃에서 유지 될 수있다.
  2. 마크 각 해당 샘플 이름으로 새 6 웰 플레이트의 잘 2 채우기 - 침투 매체의 3 ㎖.
  3. 집게를 사용하여 침투 배지에 95 % 에탄올 용액에서 묘를 옮긴다. 묘목은 쿵푸 있는지 확인에서야 베드로 매체에 의해 덮여.
  4. 식물 조직으로 최대 침투를 위해 적어도 4 일 동안 4 ℃에서 보관.

5. 블록 준비

  1. 작은 라벨, 금형을 삽입의 각 웰 내부에 샘플 이름을 연필로 표시를 놓습니다.
  2. 15 ml의 침투 매체 (4.1 참조)에 1 ml의 경화제를 추가하여 매체를 삽입 준비합니다. 중합 문제를 방지하기 위해 볼륨을보다 작은 15 ml를 준비하지 마십시오.
  3. 도 200 μL 매립 매체 몰드의 각 절반을 채워 몰드 형상으로 절단 탑정 필름 조각을 포함하지만, 양쪽 1mm 더 큰 크기이다. 중합 가능하도록 적어도 2 시간 동안 실온에서 인큐베이션. 5 시간을 초과하지 마십시오.
  4. 매립 매체의 추가 배치를 준비한다 (5.2 참조) 뿌리 끝 몰드 내에 배치되는 동안 중합을 방지하기 위해 얼음에 보관.
  5. 메스를 사용하여 해부 범위에서 각 루트의 끝 부분을 잘라 매우 신중하게 나는 위치t : 수직 횡단면 또는 가로 세로 섹션, 약 2에서 - 금형 주변에서 3mm. 오버 헤드 필름 솔루션 및 덮개를 차단 완전히 금형을 입력합니다. 이 중합되면 차단 솔루션은 약간 축소 않습니다.
  6. 최소한 2 시간 동안 실온에서 유지한다.
  7. 블록을 건조, 건조 실리카 젤 상자에 배치하고 최소한 실온에서 하룻밤 둡니다.

6. 단면

  1. 칼 메이커 유리 봉에서 유리 칼을 준비합니다. 조직 절편의 유리 칼을 사용합니다. 정사각형으로 유리로드를 절단하고 채점 다이아몬드 공구를 사용하여 두 개의 나이프를 제조 대각선 사각형을 잘라.
  2. 절편 기계를 사용하여 3 μm의 폭 조각 - 2로 섹션 블록. 물이 증발 할 때까지 - (60 ° C 50), 장소 증류수 방울의 상단에 유리 슬라이드에 조각, 낮은 열 설정 열 블록에 슬라이드를 배치합니다.

7. 편광 현미경에 대한 준비를 밀어

  1. 원래 솔루션의 0.2 %에 리처드슨 솔루션 (2.1 참조) 희석과 조각을 포함 할 1 ㎖를 사용합니다. 5 초 동안 열 블록에 위치하게 한 후, 증류수로 세척한다.
  2. 핫 플레이트에 슬라이드를 건조시킵니다. 관심있는 조각의 위치를​​ 나타내는 현미경 그 이후 식별을 용이하게하기 위해 해부 범위에 관찰 마커 슬라이드의 뒷면을 표시한다.
  3. 커버 슬립에 장착 매체와 커버의 100 μl를 추가합니다.

8. 이미지 인식

  1. 난연성 정보 편광자 / 광학 간섭 필터 (도 1 AD)를 얻었다 Polscope 적합한 장치를 구비 한 광학 현미경 루트 부 함유 커버 슬라이드를 놓는다.
  2. 전체 샘플의 명확한 시각화 할 수 있습니다 선택 배율 (예를 들어,이 연구에서 40X)와 현미경을 집중블록 섹션 있지만 루트 섹션을 포함하는 빈 필드에 전자. 아무 결점과 깨끗한 지역을 찾아보십시오. 배경을 설정하려면이 영역을 사용합니다.
  3. 이미징 시스템 및 소프트웨어 매개 변수를 설정 : 설정 범위를 17 nm의. (8.2 참조) "자동 노출"을 적용하고 빈 필드에서 배경 이미지를 얻을 수 있습니다. 하나의 배경 이미지는 실험에 따라 사용됩니다.

셀룰로오스 마이크로 피 브릴 방향의 9 Polscope 분석

  1. 세로 섹션의 분석.
    1. 현미경 종단면을 포함하는 슬라이드를 배치하고 난연성의 이미지를 얻었다. 관심의 루트 섹션에 현미경 초점을 맞 춥니 다. 새 파일 이름을 입력합니다.
    2. "라이브 Abrio"창을 통해 abrio 이미지 (지연 정보와 이미지)를 캡처합니다. 도 2c에 도시 된 바와 같이, 상기 셀의 주변을 따라 실행 염색 셀룰로오스에 의해 식별 될 수있는 셀 벽들을 포함하는 부분을 캡쳐하여주십시오.
  2. 이미지 분석.
    1. 이미지 스택에서 관련 이미지를 더블 클릭합니다. "디스플레이 설정"탭에서 "방향 의사 컬러"를 선택합니다.
    2. 셀룰로오스 마이크로 피 브릴의 각도를 추정하기 위해, 컬러 휠에서와 칸막이 벽의 대응 그늘 일치.
      참고 :도 2c의 컬러 휠을 미세 섬유의 장축을 따르는 방향을 나타내는 마이크로 피 브릴을 따라 누워 광의 저속 축 반영한다. 셀룰로오스 마이크로 피 브릴의 각 색 셀의 장축에 의해 지시 된 각도이다. 예를 들어, 삽입의 연신 셀은 셀의 장축에 대해 90 ° 기울어 시안 색을 나타낸다.
    3. 셀 벽의 평균 마이크로 피 브릴 각도를 정량화하기 위해, 소프트웨어의 도구 모음에서 "난연성 및 방위각 스탬프"도구를 사용합니다. 도구, 포인트를 선택하면서 얻어진 이미지의 관심 영역을 클릭합니다.
      참고 :이 줘야 해도에서 각도 (방위각) (그림 2C)의 디스플레이 리터 결과.
    4. 플러그인 메뉴에서 다른 오픈 액세스 편광 이미지 분석 소프트웨어에서, 점심, "폴 - 분석기"플러그인. 새로운 열린 창에서 "복굴절"탭 열기를 선택하고 배경 파일과 이미지 파일을 저장합니다.
    5. 이미지 창에서 "사양"을 선택합니다. (이 연구에 사용 5 픽셀)를 '투자 수익 (ROI)의 픽셀 크기를'조정합니다. 은 "사양."에서 창 선택 "결과 테이블의 값을 표시합니다."
    6. 이미지 창에 대한 관심의 영역을 표시하는 다각형 도구를 사용합니다. 셀룰로오스 마이크로 피 브릴의 방향을 얻기 위해 "방향 라인"을 선택합니다.
      참고 :이 정도의 각도 (방위각)의 표시가 발생합니다.
      주 :이 두 방법 중 하나에 의해 계산 된 평균 각도는 다음 슬라이드를 따라 루트 부의 위치로 정규화한다. 에서 편차를 해결하려면슬라이드 따라 전체 루트 부의 수평 위치에서 (즉, 단면에 수직 루트 성장축도 2C를 따라있다)의 장축을 따라 상기 셀의 측면에 칸막이 벽의 평균 마이크로 피 브릴 각도를 수치화. 루트 부 정확하게 슬라이드를 따라 위치 될 때의 각도는 180 °이다. 마이크로 피 브릴 각 계산의 경우, 180에서 측면 칸막이 벽의 마​​이크로 피 브릴의 평균을 측정 각도를 뺀다. 슬라이드에 평평 셀 벽의 평균 측정 마이크로 피 브릴 각도로 결과의 차이를 추가합니다.

결정 셀룰로오스 축적의 10 Polscope 분석

  1. 가로 (크로스) 섹션을 사용합니다. 자신의 셀룰로오스 마이크로 피 브릴이 비슷한 각도로 정렬 될 때 (9 결정) 그 결정 셀룰로오스 축적은 세포 사이에 비교 될 수 있습니다.
  2. 이미지 스택에서 관련 이미지를 더블 클릭합니다. 선택 "P디스플레이 설정 "탭"에서 "색을 seudo.
  3. 지연도를 측정합니다. 확대 된 이미지. "지역"을 선택하고 관심있는 모든 지역을 표시합니다. 모든 값을 "클립 보드에 복사"를 "측정"탭으로 이동합니다.
    1. Excel로 데이터를 전송하고 필요한 정보를 (난연성의 영역을 의미한다) 압축을 풉니 다. 데이터를 정규화한다.
      주 : 조각 사이의 두께 차이를 설명 슬라이드의 특정 셀 벽의 가장자리를 기준으로 한 값을 표현한다. 정상화, 동일한 이미지의 다른 셀 벽의 평균 지연도가 관심 칸막이 벽에 대응하는 평균 지연도를 나눈다. 예를 들어, 외부 표피 세포벽이 연구에서 내부 피질 세포벽로 정규화 하였다.
  4. 샘플 당 3 뿌리의 최소, 루트 당 적어도 3 섹션에 대한 측정을 반복합니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리 모델 기관 15-17로 애기 루트를 사용 brassinosteroids (BR들)을 세포 형 특정 반응의 효과를 연구한다. BR 수용체 BRI1 타겟팅되는 경우, 비 모세포라고 표피 세포의 서브 세트 (도 2A, B)는 단방향 인접 셀들의 셀 확장, 전체 루트 성장 (15)을 억제하는 bri1 돌연변이의 배경이다. Polscope 분석은이 억제를 기본 메커니즘을 공개 하였다. 야생형과 비 머리 셀 BRI1 발현 라인들로부터 얻어진 루트 종단면는, 결정의 상대적인 축적의 비교를 가능하게, 셀룰로오스 마이크로 피 브릴 (도 2C, D, 그리고 9.2.3에 설명 됨)의 유사한 방향을 보였다 이러한 영역 (그림 2E, F)에서 가져온 단면을 사용하여 분열과 신장 세포에서 셀룰로오스. 이 분석은 correlat ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

해부학 적 정보를 유지하면서, 여기에, 우리는 애기 장대의 뿌리를 구성하는 여러 조직에서의 결정 성 셀룰로오스의 축적을 결정하는 방법을 제시한다. 이와 같이, 셀룰러 해상도 식물 성장 과정을 이해 향해 추가 단계를 제공한다. 이 방법은 추가의 식물 종 및 기관의 연구에 적용 할 수있다.

상기 방법을 적용 할 때 포인트의 수는 고려되어야한다. 소정의 루트 부에서 먼저 결정 셀룰로오스 축적은 셀룰로오스 마이크로 피 브릴의 방향 유사한 경​​우 다른 유전자형에서 섹션들 사이에서 그리고 치료제 중에서 조직간에 비교 될 수있다. 셀룰로오스 마이크로 피 브릴 방향이 칸막이 벽 (18)의 한면을 포함하는 종단면에서 결정된다. 따라서, 대부분의 사람에게 내부 외주에서 뿌리의 독특한 조직을 덮는 길이 섹션들의 시리즈는, 분석가 있도록특정 발달 단계에서 다른 조직에서의 셀룰로오스 마이크로 피 브릴의 방향이다. 표피의 신장 세포가 더 조직 구조를 가지고있는 동...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자에게는 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

해부학적 절편에 대한 조언과 도움을 주신 M. Rosenberg 박사님께 감사드립니다. 또한 기술적 지원을 해주신 D. Eisler에게도 감사드립니다. 이 연구는 FP7-PEOPLE-IRG-2008, Binational Agriculture research and Development(BARD; IS-4246-09), 이스라엘 과학 재단(ISF; 592/13)과

같은 연구를 통해 연구할 수 있다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
무라시게 & Skoog (MS)DuchefaM0221
붕사LOBA CHEMIE 6038
메틸렌 블루시그마M-9140
Azure시그마861065
주사기 구동 0.22mm PVDF 필터 MILLEX-GV
글루타르알데히드EMS16220
나트륨 카코딜레이트시그마C-0250
라이카 키트 히스토레신 Leica7022 18 500
임베딩 금형Agar ScientificAGG3530
필름 100 &마이크로; P.P.C. 오버헤드 필름
KnivemakerLKB7800
Ultratome IIILKB8800Ultratome
Shandon 면역마운트 열9990402장착 중
광 현미경NikonEclipse 80i
Abrio 이미징 시스템CRIAbrio 이미징 시스템
Abrio V2.2 소프트웨어CRIAbrio V2.2 소프트웨어
오픈 액세스 편광 이미지 분석 소프트웨어  OPSOpenPolScopehttp://www.openpolscope.org/
www.Jolybar.com

References

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