그라데이션 변형 칩 셀 라덴 히드로에 자극 세포 행동에 대 한

요약

이 문서는 조직 공학에 대 한 셀 정렬을 조절 하는 동심 셀-라덴 히드로에 연속 되지 않은 그라데이션 정적 긴장을 제공 하는 간단한 방법을 소개 합니다.

초록

세포 정렬에 대 한 인공 지침 조직 공학의 분야에서 뜨거운 주제입니다. 이전 연구의 대부분 복잡 한 실험 프로세스 및 대량 시스템 제어는 일반적으로 관련 된 오염 문제를 사용 하 여 셀 라덴 히드로에 단일 스트레인 유발 세포 맞춤을 조사 했다. 따라서,이 문서에서 3 차원 하이드로 겔에 세포 행동의 자극에 대 한 플라스틱 PDMS 커버와 UV 투명 유리 기판 유체 칩을 사용 하 여 그라데이션 정적 스트레인을 구축 하는 간단한 방법 제안 한다. 유체 챔버에 오버 로딩 사진 patternable 셀 prepolymer 표지에 볼록한 곡선된 PDMS 멤브레인을 생성할 수 있습니다. 자외선 가교 후 곡선된 PDMS 막 및 버퍼, 조사 셀 microenvironment 동심 원형 micropattern를 통해 다양 한 그라데이션 긴장 아래 행동은 외부 기기 없이 단일 유체 칩에 자체 설립. NIH3T3 세포 형상 지도 아래, 협력 hydrogels 15-65%에서 다양 한 긴장 자극 세포 맞춤 트렌드의 변화를 관찰 한 후 증명 했다. 3 일 배양 후 히드로 형상 낮은 압축 변형, 셀 정렬 셀 높은 압축 변형 히드로 신장 방향을 따라 정렬 지배. 이들, 사이 셀 하이드로 겔 신장 패턴화 된 하이드로 겔의 형상 지도의 급진적인 지침의 소산 인 임의의 맞춤을 보였다.

서론

네이티브 microenvironment을 블록 자료로 제공, 세포 외 기질 (ECM)를 포함 하는 하이드로 겔 세포 성장을 지원 하기 위해 생체 모방 조직 건설 기계를 다시 구축할 수 있습니다. 조직 기능을 소유 하기 위하여 조직 된 셀 정렬 필수 요건 이다. 다양 한 2D (즉, 세포 표면에 경작) 및 차원 (즉, 셀에는 히드로) 셀 정렬 배양 하거나 캡슐화 셀 또는 마이크로 유연한 기판에 의해 달성 되었습니다-또는 나노 패턴¹. 3 차원 셀 맞춤 마이크로아키텍처에는 microenvironment는 기본 조직 구조^2,,34에 가까운 더 매력적 이다. 1 개의 일반적인 방법은 3D 셀 맞춤 히드로 모양^2,3의 기하학적 큐입니다. 짧은 축 방향으로 셀 확산에 대 한 제한 된 공간 때문에 셀 마이크로 패턴 히드로에서 긴 축 방향을 따라 정렬 하고자 합니다. 또 다른 방법은 셀 맞춤 스트레칭 방향^4,5에 평행을 달성 하기 위해 hydrogels 인장 스트레치를 적용할 것입니다.

압축 변형 등 ECM hydrogels에 생물 자극 또는 전기 필드를 적절 한 조직 통합, 확산 및 감 별 법^1,2,3에 대 한 셀 함수를 조절할 수 있습니다. 많은 연구가 여러 기계적 제어 단위^4,6,7,,89를 사용 하 여 한 번에 하나의 긴장 상태를 적용 하 여 세포 행동을 조사 하는 일 하고있다. 예를 들어 기계적 단계 모터를 사용 하 여 압착 또는 공통 접근^7,10되었습니다 3D 셀 캡슐화 콜라겐 하이드로 겔에 뻗어. 그러나, 이러한 제어 장비 추가 공간이 필요 하 고 인큐베이터^7,9,,1112에 오염 문제를 직면. 또한, 큰 악기는 정밀 하 게 제어 환경을 제공 하는 높은 재현성¹³을 드릴 수 없습니다.

셀-라덴 hydrogels 생물 의학 응용 프로그램에 대 한 마이크로 스케일에 일반적으로 고용 되어 고려 하 고, 동시에 3D biomimetic 구문을 생체 외에서^{2,14,15,,1617,18}에 셀 행동을 조사 하기 위해 스트레인/스트레칭 자극의 범위를 생성 하는 MEMS 기술을 결합 하 여 유리 하다. 예를 들어 다른 계보^9,16에 세포 분화를 유도 하는 다양 한 긴장을 증가 줄 수 있습니다 가스 압력을 사용 하 여 미세 칩에서 PDMS 막 변형. 그러나, 복잡 한 칩 제조 프로세스 클린 룸 및 모터, 펌프, 밸브, 압축된 가스의 소프트웨어 제어 통합 등 많은 기술적인 도전이 있다.

이 작품에서 동심 원형 히드로 패턴 그리고 유연한 PDMS 멤브레인을 채용 하 여 자립 그라데이션 정적 스트레인 미세 칩을 얻기 위해 간단한 방법을 보여 줍니다. 기존 접근법의 대부분과 달리 우리의 플랫폼은 휴대용 및 처분할 수 있는 소형 장치 그 자체는 인큐베이션 기간 동안 외부 기계 장비 없이 동심의 세포 캡슐화 hydrogels에 그라데이션 긴장 생성 보유 하 고 있는 노란 방 밖에 서 날조 될 수 있다. 3T3 fibroblast 세포 행동 히드로 모양의 조합에 의해 영향을 하 고 인장 스트레칭 지도 신호의 다양 한 일 동안 그라데이션 변형 칩에서 3D ECM 모방 환경에서 셀 정렬의 관찰 동안 시연 했다.

프로토콜

1. GelMA 합성

1. 젤라틴 가루 10g의 무게를 달아 둘베코의 인산염 완충 식염수(DPBS) 100mL와 함께 유리 플라스크에 넣습니다. 마그네틱 교반 막대를 플라스크에 넣고 플라스크를 교반 핫 플레이트에 놓습니다.
2. 물의 증발을 방지하기 위해 플라스크를 알루미늄 호일로 덮으십시오. 가열판 온도를 50-60°C로 설정하고 교반기를 100rpm으로 1시간 동안 설정하여 젤라틴 분말을 잘 녹입니다.
3. 젤라틴이 용해된 후 피펫을 사용하여 메타크릴 무수물 8mL를 매우 천천히(초당 1방울) 첨가합니다. 60°C에서 3시간 동안 반응시킵니다.
4. 예열된 DPBS(40°C)를 플라스크에 최종 부피 500mL로 추가하고 15분 동안 잘 혼합하여 반응을 중지합니다.
5. 한편, 투석막(14kDa 절단 분자량)을 25cm 길이의 튜브 여러 개로 자릅니다. 탈이온수(DI)에 15분 동안 담그고 매듭을 만들어 투석관의 한쪽 끝을 닫습니다.
6. 적당량(30 - 60 mL)의 폴리머 용액을 투석 튜브에 넣고 다른 쪽 끝을 닫습니다. DI 물과 함께 5L 플라스틱 비커에 일주일 동안 놓습니다. 하루에 두 번 DI 물을 갱신하고 투석 과정 동안 용액을 40 - 50 °C로 유지하십시오.
7. 튜브에서 용액을 500mL 유리병에 모읍니다. 500mL 필터 컵(기공 크기 0.22μm)에 ~450 - 500mL의 용액을 붓고 필터 컵에 진공을 적용하여 용액이 멸균을 위해 필터 멤브레인을 통과하도록 합니다.
8. 멸균된 폴리머를 여러 개의 50mL 멸균 튜브에 옮기고 -80°C 냉동고에 3 - 5일 동안 보관합니다.
9. 동결 건조기를 사용하여 -80°C 폴리머를 1주일 동안 동결 건조하여 GelMA를 형성합니다. GelMA는 -80°C 냉동고에 보관하십시오.

2. 3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트(TMSPMA) 변형

1. 상업용 유리 슬라이드를 두 개의 작은 조각(25mm x 37.5mm)으로 자르고 0.5M NaOH 용액에 4시간 동안 담그십시오. 많은 양의 DI 물로 슬라이드를 세척하십시오.
2. 95% 에탄올이 함유된 유리 용기 안의 랙에 슬라이드를 놓고 43kHz에서 초음파를 사용하여 15분 동안 청소합니다. 유리 슬라이드를 자연 건조시킵니다.
3. 유리 슬라이드를 99.5% 에탄올에 5% TMSPMA에 1시간 동안 담그십시오.
4. 슬라이드를 95% 에탄올로 세척하고 슬라이드를 자연 건조한 다음 TMSPMA 코팅을 80°C의 오븐에서 2시간 동안 어닐링합니다.

3. 칩 제조

1. 2mm 두께의 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 플레이트 1개와 0.3mm 두께의 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 플레이트 1개를 가져다가 PMMA 표면의 한쪽 면에 양면 테이프를 붙이고 한쪽 면의 라이너를 분리합니다. 양면 테이프는 사용하지 않고 2mm 두께의 PMMA 플레이트 2개와 1mm 두께의 플레이트 1개는 남겨 둡니다.
2. 양면 테이프가 없는 2mm 두께의 PMMA 플레이트를 42mm x 30mm로 레이저 절단하여 바닥 플레이트를 만듭니다. 양면 테이프로 2mm 두께의 PMMA 플레이트를 절단하여 외부 치수가 42mm x 30mm이고 내부 치수가 37.5mm x 25mm인 경계 프레임을 만듭니다.
3. 양면 테이프를 사용하여 0.3mm 두께의 PMMA 플레이트를 원의 반대쪽에 2mm 너비와 8mm 길이의 흐름 채널 2개가 있는 12mm 중앙 원으로 레이저 절단합니다(그림 1a).
4. PDMS 커버를 주조하기 위해 PMMA 금형을 준비하려면 양면 테이프를 사용하여 3.2-3.3단계(그림 1b)의 PMMA 구성 요소 세 조각을 조립합니다.
5. 양면 테이프가 있는 2mm 두께의 PMMA 플레이트를 8.5mm x 8.5mm 중공 직사각형의 3 x 3 어레이가 있는 5cm x 5cm 조각으로 레이저 절단합니다. 4mm 속이 빈 원의 3 x 3 배열로 5cm x 5cm 조각을 더 자릅니다. 양면 테이프가 없는 1mm 두께의 PMMA 플레이트를 5cm x 5cm PMMA 바닥 플레이트에 레이저 절단합니다.
6. 양면 테이프를 사용하여 3.5단계(그림 1c)의 PMMA 구성 요소 3개를 조립하여 PDMS 플러그 주조를 위한 PMMA 금형을 준비합니다.
7. PDMS 엘라스토머 30g과 PDMS 경화제 3g을 적절히 혼합하여 PDMS 커버와 PDMS 플러그를 준비합니다. 진공 챔버에서 1시간 동안 혼합물의 가스를 제거합니다.
8. 혼합물 1.8-2.0g을 PDMS 커버용 PMMA 몰드에 주조하고 적절한 양을 사용하여 PDMS 플러그용 PMMA 몰드의 각 캐비티를 채웁니다. 경화되지 않은 PDMS 혼합물 10g을 빈 10cm 플라스틱 플레이트에 주조합니다. 이 금형을 진공 챔버에 넣어 30분 동안 가스를 제거합니다.
9. 80°C에서 2시간 동안 PDMS를 경화시킵니다. 금형에서 경화된 PDMS를 냉각시킨 후 PMMA 금형에서 PDMS 커버와 PDMS 플러그를 분리합니다.
10. PDMS 커버의 유동 채널 끝에 직경 약 3mm의 구멍 두 개를 펀칭합니다.
11. 10cm 플라스틱 플레이트에서 성형된 PDMS 시트를 1cm x 1cm 큐브로 자르고 각 PDMS 큐브에 3mm 구멍을 뚫습니다. PDMS 커버의 개구부에 경화되지 않은 1cm x 1cm PDMS 큐브 2개를 붙이고(매체 저장소 역할을 하고 그래디언트 원형 하이드로겔 패턴의 경화 과정을 돕기 위해) 80°C에서 1시간 동안 경화합니다.
12. 산소 플라즈마 기계(30W RF 출력(하이 모드) 및 600mTorr 압축 공기) 또는 고주파 전자 코로나 발생기(115V, 50/60Hz, 0.35A) 아래에서 PDMS 커버의 본딩 면과 TMSPMA 코팅 슬라이드를 사전 처리하여 두 개의 PDMS 저장소와 함께 PDMS 덮개를 TMSPMA 코팅 슬라이드에 접착합니다.
13. PDMS 커버의 플라즈마 처리된 표면과 TMSPMA 슬라이드를 접촉하고 밀착하여 Si-O-Si 결합 형성을 통한 영구적인 결합을 위해 밀착시킵니다.
    알림: 칩을 80°C의 오븐에 1시간 동안 넣으면 접착 강도를 더욱 향상시킬 수 있습니다.
14. 냉각 후 칩을 95% 에탄올에 15분 동안 담그고 자연 건조합니다. 그런 다음 칩을 자외선 조사로 1 시간 동안 살균하고 알루미늄 호일로 싸인 상자에 층류 후드에 보관합니다.

4. 셀이 함유된 하이드로겔의 정적 구배 변형

1. 레이아웃을 그림 2b로 투명 필름에 인쇄하여 25mm x 37.5mm 크기의 포토마스크 조각을 인쇄하고 자릅니다. 그림 2b의 인쇄 크기를 그림 2a.
2. 세포 배양 배지로 사용할 37°C 수조에서 10% FBS, 1% Pen-Strep 및 250mL DPBS가 포함된 DMEM 배지 100mL를 준비합니다.
3. 1.5mL 검은색 마이크로 원심분리기 튜브에서 0.3mL의 예열된(37°C) 세포 배양 배지에 25mg의 동결 건조 GelMA를 칭량합니다. GelMA가 배지에 용해될 때까지 마이크로 원심분리기 튜브를 실험실 교반기/핫 플레이트에 놓습니다.
4. 마이크로 원심분리 튜브에 DPBS 1ml에 50mg의 광개시제를 넣고 80°C 오븐에 15분 동안 또는 광개시제가 용해될 때까지 가열합니다.
5. 4.4단계에서 10% 광개시제 25μL를 취하여 4.3단계에서 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다. 잘 섞기 위해 여러 번 피펫을 사용하십시오.
6. 자동화된 세포 계수기를 사용하여 3 x 10⁶ NIH 3T3 세포를 계수합니다. 현탁액을 200 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 버리고, 175μL의 세포 배양 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다.
7. 4.6단계의 세포 용액을 4.5단계의 마이크로 원심분리 튜브에 추가하여 5% GelMA, 0.5% 광개시액 및 ~6 x 10⁶ 3T3 cells/mL의 프리폴리머 세포 용액을 얻습니다. 혼합 후 100μL 마이크로 주사기에 100μL의 세포 프리폴리머를 로드합니다.
8. 포토마스크 조각을 멸균된 그라디언트 스트레인 칩의 하단 슬라이드에 수동으로 정렬하고(그림 3a 참조) 그 사이에 작은 DI 물 한 방울을 사용하여 위치를 고정하기만 하면 됩니다. 프리폴리머 셀 용액이 로드된 100μL 마이크로 주사기를 칩의 주입구에 연결합니다.
9. 마이크로 주사기를 사용하여 50μL의 프리폴리머 셀 용액을 유동 채널에 배치(그림 3b 참조)한 다음 PDMS 플러그를 사용하여 콘센트를 꽂습니다. 용액을 40μL씩 추가로 주입하여 원형 PDMS 멤브레인에 볼록한 돌출부를 만듭니다.
10. 4.9단계에서 포토마스크(하단), 마이크로 주사기(입구) 및 PDMS 플러그(콘센트)가 있는 칩을 UV 램프(365nm, 9mW/cm²) 아래로 이동하고 30 - 45초 동안 노출시켜 유체 챔버에서 동심원 원형 하이드로겔을 가교합니다.
11. PDMS 플러그와 마이크로 주사기를 제거하여 액체 압력을 해제합니다(그림 3c 참조). 예열된 DPBS가 주입된 1mL 주사기를 사용하여 주입구에서 배출구로 세척하여 가교되지 않은 수지를 3회 세척합니다.
12. 약 100μL의 세포 배양 배지로 유동 채널을 채웁니다.
13. 멸균된 배양 접시에 칩을 넣고 5% CO₂ 분위기에서 37°C에서 일주일 동안 배양합니다. 매일 매체를 새로 고칩니다.
14. 20X 대물렌즈가 있는 현미경을 사용하여 배양 4시간 후 대조군으로 0일째에 3개의 칩을 촬영하고 실험 세트로 3일째에 3개의 칩을 촬영합니다. 압축 변형률을 계산하기 위해 소프트웨어(예: ImageJ)를 사용하여 라인 1에서 라인 12까지 각 하이드로겔의 라인 너비를 측정합니다( 그림 4).
    참고: 연신율은 40μL와 0μL 사이의 선폭 차이 값을 40μL에서의 선폭으로 나누어 계산합니다.

5. 정렬 분석을 위한 세포 염색

1. 주사기를 사용하여 RT에서 DPBS의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 15분 동안 플로우 칩에 주입하여 세포가 포함된 하이드로겔을 고정합니다.
   알림: 주의. PFA는 독성이 있으므로 주의해서 다루어야 합니다.
2. RT에서 세포막을 투과시키기 위해 10분 동안 DPBS에서 용액을 0.5% 세포막 투과 용액으로 교체합니다.
3. PBS는 세척 사이에 5-10분 간격으로 샘플을 3회 세척합니다(5.1단계와 같이 장전된 주사기 사용).
4. RT에서 45-60분 동안 1% BSA 용액을 유체 채널에 로드합니다(주입구 포트를 통해 로드된 주사기 사용).
5. Alexa Fluor 488 팔로이딘이 포함된 바이알에 메탄올 1.5mL를 첨가하여 최종 농도 6.6μM 원액을 산출합니다.
6. 5.5단계에서 Alexa Fluor 488 팔로이딘 5μL를 취하여 0.1% BSA와 함께 200μL의 DPBS에 희석하여 0.165μM Alexa Fluor 488 팔로이딘의 최종 농도를 형성합니다.
7. 마이크로피펫을 사용하여 200 μL의 혼합물 용액을 유체 채널에 추가하고 액틴 염색을 위해 37 °C에서 45 - 60분 동안 칩을 배양합니다. PBS는 샘플을 3 번 씻습니다 (위와 같이).
8. PBS에서 1μg/mL DAPI를 준비하고 칩을 통해 흐르게 한 다음 37°C에서 5분 동안 세포핵을 염색합니다.
9. 피펫 DPBS를 유체 채널로 주입하여 염색 용액을 씻어내고 유체 챔버를 PBS 용액으로 다시 채워 형광 현미경으로 이미지를 촬영합니다.
10. Alexa Fluor 488 phalloidin(액틴) 및 DAPI(핵)에 대해 각각 488/520nm 및 358/461nm에서 CCD 검출기 및 ex/em 필터 세트를 사용하여 40X 배율로 도립 형광 현미경을 사용하여 하이드로겔 내 3T3 세포의 형광 이미지를 캡처합니다.

결과

완성 된 그라데이션 변형 자극 칩에서 각 원형 히드로 사이 기계적인 유사 비교를 우리가 주입 양의 0 µ L (그림 4a)와 40 µ L (그림 4b), 같은 칩의 두 각 원형 하이드로 겔의 선 폭 각각 측정. 각 원형에 백분율 elongations 0 µ L 주입 칩 (그림 4c)에서 해당 hydrogels의 선 폭 40 µ L 주입 칩에서 elongations 나누어 계산 했다. 히드로 비압축 소재 이므로 수직 계약 부담 측면 신장 긴장에 해당 될 것입니다. 따라서, 40 µ L 주입 량과 칩에 백분율 elongations 15-65% 신장, 압축 변형으로 변환 될 수 있는 표시 ( 보충 파일 1참조).

토론

이 논문에서 우리 히드로 모양 지도 인장 스트레치 후 셀 정렬 동작을 비교 하는 간단한 방법에 보고 합니다. 유연한 PDMS 막 동심 원형 hydrogels의 다른 고도 생성 하기 위한 돔 모양의 곡률을 만듭니다. 압력을 해제 한 후 PDMS 막 자동으로 그라데이션 변형/신장, 센터에서 최대와 최소 바깥 경계에 형성에 마이크로 패턴 hydrogels에 강제 적용 됩니다. 에 참석 해야 합니다 몇 가지 중요 한 매개 변수는 그라데이션 긴장의 형성 유연한 PDMS 막과 유체 칩의 처리에 의해 설계: (i)는 PDMS의 두께의 정확한 제어 막이 그라데이션 변형 값을 조정 하는 중요 한. 막 너무 두꺼운 경우 셀 prepolymer의 최대 사출 볼륨도 가교 셀 라덴 hydrogels의 그라데이션 높이 대 한 PDMS 막에서 적절 한 볼록한 곡선을 생성할 수 없습니다. 반면, 너무 얇은 PDMS 막은 hydrogels에 충분 한 힘을 적용할 수 없습니다. PDMS 커버 금형에서 uncured PDMS의 무게는 칩 당 약 1.6-2.0 g...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 mL 검은색 마이크로 원심분리기 튜브	Argos Technologies	03-391-161	이것은 1.5 mL 튜브의 중립색으로 교체할 수 있으며, 이는 알루미늄 호일로 덮여
10x DPBS	Sigma-Aldrich	56064C
Alexa Fluor 488 phalloidin	인비트로젠	A12379
BSA	시그마	A1595
Calcein	분자 프로브	C1430	생존 가능한 세포
CCD	PCO 라벨링용. 이미징	Pixelfly qe
세포막 투과 용액	Sigma-Aldrich	X100	0.5% Triton X-100 투과 세포막
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417	세포핵 염색
투석막	Sigma-Aldrich	D9527	분자량 컷오프 = 14,000
DMEM	Gibco	11995-065
양면 테이프	3M	8003
FBS	Hyclone	SH30071.03
젤라틴	시그마-알드리치	G2500	겔 강도 300, A형, 돼지 껍질
고주파 전자 코로나 발생기	전기 기술 제품	모델 BD-20
메타크릴 무수물	시그마-알드리치	276685
마이크로 주사기	해밀턴	80501	50 μ 엘
현미경	올림푸스	IX71	두 개의 필터 세트 포함 : Semrock 산소 플라즈마 기계의 LF405 / LP-B-000 및 LF488 / LP-C-000
	Harrick 플라즈마	PDC-001
파라 포름 알데히드	시그마 - 알드리치	P6148
		PDMS 칩 캐스트 성형 제작 용	Sylgard 184
Pen-Strep	Gibco	10378-016	페니실린 / 스트렙토 마이신
광개시	CIBA	Irgacure 2959
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4170	죽은 세포 라벨링 용
멸균 여과 컵	Millipore	SCGPT05RE
TMSPMA	Sigma-Aldrich	440159	하이드로 겔 고정 용
초음파 발생기	델타	D150H	150W, 43kHz
자외선	DAIHAN	WUV-L10
동결 건조기	FIRSTEK	150311025
NIH3T3(섬유아세포)	식품 산업 연구 개발 연구소(FIRDI)	08C0011
MOXI Z 미니 자동 세포 카운터	ORFLO	MXZ001