이 프로토콜은 단일 동물 해상도에서 Drosophila melanogaster의 산란 선호도를 테스트하기 위한 고처리량 분석을 설명합니다. 이 분석은 간단한 의사 결정 과정을 제어하는 유전자 및 회로 구성 요소를 식별할 수 있는 간단하고 효율적이며 확장 가능한 플랫폼을 제공합니다.
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방법 논문
높은 처리량 분석은 개인의 알을 낳는 환경 설정을 검사합니다
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이 논문에서
요약
초록
최근 초파리의 알을 낳는 환경 설정은 간단한 의사 결정 과정의 신경 기초를 공부하는 유전자 다루기 쉬운 모델로 떠오르고있다. 알을 증착하는 사이트를 선택하면, 여성의 파리는 옵션의 상대적 매력도 순위와 선택 할 수있다 "큰 두 가지 상품을." 하나는 그들이 인구 기반 및 설정하기 힘든만큼,이 간단한 의사 결정 과정의 기초가되는 회로의 기초를 검색 할 체계적인 유전자 검사 방법을 원하는 경우, 대부분의 알을 낳는 환경 분석은 실용적이지 않다. 한 여성의 알을 낳는 환경의 공부의 처리량을 증가시키기 위해, 우리는 최대 30 개인의 각 수를 동시에 분석 알을 낳는 환경 설정은 각 여성은 높은 알을 낳는 속도가 보장하는 프로토콜뿐만 아니라 파리 정의 챔버를 개발 (그래서 선호 쉽게 식별 할 더 설득력 있음). 우리의 접근 방식은 실행이 간단매우 일관된 결과를 얻을 수 있습니다. 또한 이러한 챔버는 비디오가 알을 낳는 동물을 기록하고 optogenetics의 연구에 빛을 제공 할 수 있도록 다른 첨부 파일을 장착 할 수 있습니다. 이 문서에서는 이러한 챔버에서 분석 할 수있는 파리를 준비 이러한 챔버 및 절차를 제조하기위한 청사진을 제공합니다.
서론
Drosophila melanogaster는 행동의 신경 기초를 연구하는 강력한 유전 모델 유기체입니다. 뉴런을 표적화된 방식으로 조작하는 유전 도구의 급속한 발전과 정교한 행동 분석 도구의 출현은 여러 선천적 및 학습적 행동의 감각-운동 변환 과정의 기초가 되는 회로 메커니즘을 해부하는 능력을 크게 향상시켰습니다1-3.
Drosophila 알을 낳는 것은 간단한 의사 결정 과정의 신경 기초를 연구하기에 적합한 모델입니다. 특히, 초파리 암컷은 주어진 옵션4-8에 난자를 낳는 데 "전념"하기 전에 옵션을 비교하고 순위를 매길 수 있는 능력을 가지고 있는 것으로 나타났습니다. 예를 들어, 일반(자당이 없는) 기질만 주어지거나 자당을 함유한 기질만 주어지면 암컷은 알을 낳기 위한 두 가지 옵션 중 하나를 쉽게 받아들입니다. 그러나 두 가지 옵션이 모두 제시되면 암컷은 일부 상황에서 자당 기질을 강력하게 거부합니다7,9,10. 그러나 암컷이 "두 가지 상품 중 더 큰 것을 선택"할 수 있도록 하는 신경 메커니즘에 대해서는 상대적으로 알려진 바가 거의 없습니다. 가장 큰 장애물은 이 문제를 연구하기 위해 체계적인 유전자 스크리닝 접근법을 사용할 수 있도록 난자 산란 선호도를 분석하는 효율적인 방법이 없다는 것입니다.
이 보고서에서는 암컷의 알을 낳는 선호도를 단일 동물 해상도에서 분석하고 이전 방법보다 훨씬 향상된 처리량과 일관성을 유지할 수 있도록 개발한 프로토콜에 대해 설명합니다. 구체적으로 말하자면, 우리가 설계한 챔버를 건설하기 위한 청사진, 암컷이 많은 알을 낳을 준비가 되도록 준비하기 위한 프로토콜, 챔버를 사용하기 위한 프로토콜을 제공합니다.
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프로토콜
파리 준비 1.있는 분석한다
- 문화 표준 당밀에 파리 / 25 ° C 및 65 % 습도에서 설정 인큐베이터에서 옥수수 가루 미디어. 유리 병을 혼잡하게하지 않도록주의하십시오. 예를 들어, 좁은 식품 유리 병에 8 명의 여성과 6 명의 남성을 넣어.
주 : 여기에서 사용 된 "식품 좁은 병"은 2.3 cm의 내경을 갖는다. 우리는 일반적으로 각각의 유리 병에 플라이 음식의 약 10 ml의 분배. 우리가 사용하는 플라이 음식의 조리법은 여기에 설명되어 있습니다 http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html. - 2 - 그림 1E에 도시 된 바와 같이, 삼일 여성의 우화 후, 신선한 효모 붙여 넣기와 유리 병을 준비합니다. 0.5 % proprionic 산 10 ml의 활성 효모 6g을 혼합하여 신선한 효모 붙여 넣기를합니다. 식품 유리 병의 측벽에 효모 페이스트를 적용 할 주걱을 사용합니다. 유리 병에 25 명의 남성 - 20 35 eclosed 여성 함께 - 30 수집합니다.
- 일반적으로, 여성은 수집 동일한 튜브에서 수집 수컷(수 있도록 시간과 노력을 절약하기 위해). 수컷의 생식 능력에 대한 우려가있는 경우에는, WT 대신 수컷을 사용한다. 또한, 효모 붙여 넣기 신선한 매일을 준비 따라서 달걀 생산을 자극하는 것이 중요합니다.
- 파리 온도 민감하지 않는 한, 25 ° C, 65 % 습도에서 수집 된 여성 / 남성을 유지한다.
- 4 ~ 후 - 오일, 암컷이 알을 낳는 실험 준비가되어 있는지 확인하기 위해 튜브를 확인합니다. 식품 매체 표면 적극적 음식내는 유충 젖은 때 준비 (- F도 1E 참조).
참고 : 식품 표면이 젖어 유충으로 크롤링하게되면 암컷은 일반적으로 누워 계란을 보류. 이 단계는 암컷이 그들이 원하는 텍스처와 기판가 발생할 때 많은 알을 낳기 할 준비가되어있을 것이라는 점을 보장한다 (예., ~ 1 % 아가로 오스).
2. 상공 회의소 건설, 조립, 분석 설정
- (컴퓨터 가게 아크릴 알을 낳는 챔버를 구축 Fi 인터넷이gure의 1A - D). 다른 조각의 엔지니어링 도면을 보충 그림 1에 나타낸다 -. 3 고해상도 사진은 여기에서 찾을 수 있습니다 (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- 도 1c에 도시 된 바와 같이 챔버의 로딩 (위) 부재에 플라스틱 시트를 삽입한다. 로드 개별 알을 낳는 경기장에 날아 동안이 바닥면 역할을합니다.
- 공동 2 패드에 여성을 마취하고 각 알을 낳는 경기장에 개별적으로로드합니다. 파리는 CO 2를 복구하고 새로운 환경에 적응 될하기위한 ~ 30 분을 허용합니다.
- 아가로 오스 기판을 준비합니다.
- 편의를 위해 55 ° C의 물을 욕조에 녹아 1 % 아가로 오스의 미리 만들어진 병을 유지합니다.
- 50 ML 원뿔 튜브에 재고 자당 용액 (2 M)의 원하는 금액을 추가하고 아가로 오스의 적절한 양을 혼합. 예를 들어, 150 mM의 수크로오스 기판 PLA를 제조CE는 750 튜브에 2 M 자당 솔루션의 μL 후 10 ml의 표시로 아가로 오스와 튜브를 입력합니다.
- 동일하게 일반 기판을 준비하는 대신 자당 용액에 증류수를 추가한다.
참고 :이 프로토콜의 아가로 오스의 최종 농도가 약간 1 % 미만이다. 1.1 % 및 두 기판이 같은 아가로 오스 농도의 것을 - ~ 0.9 이내로 제어 우리의 경험에 의하면, 아가로 오스의 정확한 농도는 너무 오래 중요하지 않습니다.
- 그림 1D에서 볼 수 있듯이 각각의 통에 챔버와 피펫 아가로 오스 기판의 1,000 μl를의 기판 (아래) 조각을 가져 가라.
- 아가 ~ 30 분 동안 응고하도록 허용합니다.
- 아가로 오스 기판과 파리 준비가되면 알을 낳는 챔버의 세 조각을 조립 한 후 플라스틱 시트를 꺼내.
- 플라이 인큐베이터에있는 챔버를 놓습니다.
참고 : 알을 낳는 실험의 길이 expe의에 따라 달라질 수 있습니다rimental 필요. (- 16 시간 14) 우리는 일반적으로 실험 O / N을 실행합니다. 또한, 알을 낳는 환경에 주기성 타이밍의 유의 한 효과는 관찰되지 않았다. - 챔버 내에 이산화탄소를 주입하여 마취 여성. 챔버를 분해 플라이 시체 공시 소에 마취 파리를 폐기 (예. 빈 커피는 일부 옥수수 기름 가득 수 있습니다.) 기록 관리에 대한 결과의 사진을 촬영합니다 (그림 2 참조).
- 수동으로 계란의 수를 계산 및 분석을위한 기본 인덱스를 계산합니다. 같은 환경 지표를 계산 (N A - B N) / (A + N의 N b) N N A 및 B는 각각의 사이트에 대 사이트 B를 알의 수를 나타내며.
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결과
산란 챔버는 기질(바닥) 조각, 구분자(중간) 조각, 로딩(상단) 조각, 그리고 2개의 슬라이딩 도어로 구성됩니다(그림 1A - D). 이 조각들은 산란 실험 전 초파리와 기질을 독립적으로 설정하는 데 사용됩니다. 그림 1F는 암컷 초파리가 산란 준비가 되었을 때 바이알의 모습을 보여줍니다. 초파리에게 일반 기질과 자당(sucrose)이 포함된 기질 중 선택권을 주었을 때, 그림 2에서 보는 바와 같이 암컷은 산란을 위해 일반 기질을 강력하게 선호했습니다.
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토론
여기에 설명된 챔버 및 프로토콜은 이전의 알을 낳는 분석에 비해 몇 가지 개선 사항이 있습니다. 첫째, 단일 동물의 선호도 분석 처리량을 크게 증가시킵니다. 각 챔버는 30마리의 단일 암컷을 분석할 수 있으며 설정하는 데 한 시간도 채 걸리지 않습니다. 둘째, 이전 방법에 비해 알을 낳는 선호도의 일관성을 높입니다. 경기장의 치수, 산란 기질의 크기, 기질 사이의 거리를 표준화하면 서로 다른 실험일 간의 결과와 서로 다른 연구 그룹의 결과를 더 쉽게 비교할 수 있습니다. 셋째, 챔버에는 추구하려는 추가 분석을 수용하기 위해 부착물을 장착할 수 있습니다(보충 그림 4). 예를 들어, 행동 분석을 위해 비디오 카메라를 챔버 상단에 부착하여 파리7,11-13을 기록할 수 있습니다. 가장 중요한 것은 이 접근 방식이 확장 가능하다는 것입니다. 이 챔버는 기계 공장의 도움으로 생산하는 데 상대적으로 저렴합니다. 또한 일반적으로 숙련된 작업자가 5개의 챔버(150마리의 단일 암컷)에 해당하...
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
행동 장치와 부착물을 만들고 그림을 그리는 데 도움을 준 Duke Physics Shop, 특히 Phil Lewis에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 자금 지원을 받아 수상 번호 R01GM100027로 진행되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 울트라퓨어 아가로스 | Invitrogen | 16500-500 | |
| 설탕 | 시그마 | S0389 | |
| 수조 | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam 시네마 웹캠 | Microsoft | H5D-00013 | |
| Red LEDs | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| 알을 낳는 챔버 | 맞춤형 내장 | ||
| 카메라 홀더 | 맞춤형 | ||
| LED 홀더 | 맞춤형 | ||
| 플라이 바이알(좁은) | 제네시 | 32-116BC |
참고문헌
- Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory. Curr. Biol. 23 (17), 752-763 (2013).
- Yamamoto, N. C., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat. Rev. Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
- Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly. 6 (1), 35-48 (2012).
- Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (27), 11352-11357 (2009).
- Miller, P. M., Saltz, J. B., Cochrane, V. A., Marcinkowski, C. M., Mobin, R., Turner, T. L. Natural variation in decision-making behavior in Drosophila melanogaster. PLoS One. 6 (1), 16436(2011).
- Schwartz, N. U., Zhong, L., Bellemer, A., Tracey, W. D. Egg-laying decisions in Drosophila are consistent with foraging costs of larval progeny. PloS One. 7 (5), 37910(2012).
- Yang, C. H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Drosophila egg-laying site selection a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
- Kacsoh, B. Z., Lynch, Z. R., Mortimer, N. T., Schlenke, T. A. Fruit flies medicate offspring after seeing parasites. Science. 339 (6122), 947-950 (2013).
- Wu, C. -L., Fu, T. -F., Chou, Y. -Y., Yeh, S. -R. A Single Pair of Neurons Modulates Egg-Laying Decisions in Drosophila. PloS one. 10 (3), e0121335(2015).
- Yang, C. H., He, R., Stern, U. Behavioral and circuit basis of sucrose rejection by Drosophila females in a simple decision-making task. J. Neurosci. 35 (4), 1396-1410 (2015).
- Gou, B., Liu, Y., Guntur, A. R., Stern, U., Yang, C. H. Mechanosensitive neurons on the internal reproductive tract contribute to egg-laying induced acetic acid attraction in Drosophila. Cell Rep. 9 (2), 522-530 (2014).
- Stern, U., Zhu, E. Y., He, R., Yang, C. H. Long-duration animal tracking in difficult lighting conditions. Sci. Rep. 5, 10432(2015).
- Zhu, E. Y., Guntur, A. R., He, R., Stern, U., Yang, C. H. Egg-laying demand induces aversion of UV light in Drosophila females. Curr. Biol. 24 (23), (2014).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat. Methods. 6, 451-457 (2009).
- Klatpoetke, N. C., et al. Independent Optical Excitation of Distinct Neural Populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
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