Method Article

키메라를 구축의 HSV-중재 형질 전환 유전자의 발현은 마우스의 GPCR Heteromers의 행동 기능을 연구하는

DOI:

10.3791/53717

⸱

July 9th, 2016

 ,  , 
1Department of Psychiatry, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Neurology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Friedman Brain Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Department of Physiology and Biophysics, Virginia Commonwealth University Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 문서는 GPCR 이종 형성을 요구하는 행동 분석을 테스트 할 마우스 정면 피질로 바이러스 벡터를 주입하는 방법을 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

5-HT2A와 mGlu2 사이의 이질체 수용체 복합체는 정신병1,2의 마우스 모델에서 일부 행동 표현형과 관련이 있습니다. 결과적으로, 조현병 관련 행동에 영향을 미치는 5-HT2A와 mGlu2 사이의 상호 작용에 대한 구조적 세부 사항을 조사하는 것은 강력한 번역 도구입니다. 앞서 살펴본 바와 같이, 마우스의 머리 경련 반응(HTR)은 환각제에 의해 유발되며 이러한 행동 반응은 5-HT2A 녹아웃(KO) 마우스에는 없습니다3,4. 또한, 5-HT2A 수용체를 피질에서만 조건부로 발현시킴으로써, 피질 피라미드 뉴런의 5-HT2A 수용체 의존성 신호전달 경로가 환각제에 대한 반응으로 머리 경련 행동을 유도하기에 충분하다는 것이 입증되었다3. 마지막으로, 환각제인 DOI와 리세르그산 디에틸아미드(lysergic acid diethylamide, LSD)에 의해 유발된 머리 경련 행동 반응이 mGlu2-KO 마우스에서 현저히 감소하는 것으로 나타났습니다5. 이러한 발견은 mGlu2가 LSD 유사 약물에 의해 유발되는 5-HT2A 수용체 의존성 정신병과 같은 행동 효과에 적어도 부분적으로 필요하다는 것을 시사합니다. 그러나 이것은 5-HT 2A-mGlu2 수용체 복합체가 이러한 행동 표현형에 필요한지 여부에 대한 증거를 제공하지 않습니다. 이 질문에 답하기 위해 mGlu2-KO 마우스의 전두엽 피질에서 mGlu2 또는 mGlu2ΔTM4N(5-HT2A-mGlu2 수용체 복합체를 형성하지 않는 mGlu2/mGlu3 키메라 구조체)을 발현하는 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 구조체를 사용하여 이 GPCR 이질체 복합체가 LSD 유사 약물에 의해 유도된 행동 효과에 필요한지 여부를 조사했습니다6.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이러한 LSD, 실로시 빈과 메스와 같은 환각제는 인간의 의식,인지와 감정 7-9에 상당한 변화를 일으킬. 유전 또는 약리학 중 접근 방식에 의해 세로토닌 5-HT 2A 수용체 신호의 불 활성화는 크게 두 설치류 모델 3,10에서 환각제에 대한 행동 반응을 감쇠 11을 인간 원인. 환각제 다른 수용체 아형 8 바인딩 있지만, 5-HT의 2A 수용체는 이러한 화학 물질의 고유 한 행동 활동에 필요로 간주됩니다.

그룹 II 대사성 글루타메이트 수용체 (예., mGlu2 및 mGlu3)는 환각제의 분자 메커니즘과 정신병 (12)의 기초가 자신의 필수적인 역할에 대해 상당한 관심의 대상이되고있다. 이전에는 mGlu2 단백질 (mGlu2-KO 마우스)없이 식을 마우스 복도의 셀룰러 및 행동 효과에 영향을받지 것으로 입증되었다lucinogens 5. 또한, 5-HT (2a)와 mGlu2 수용체와 세로토닌 글루타메이트 리간드 1,2- 살아있는 세포에서 G 단백질 커플 링 패턴을 변조되는 특정 이종 복합체를 형성하는 것이 제안되었다.

구조적으로, 횡단 (TM) 영역 (4) 및 mGlu2 5는 5-HT의 2A 수용체 (5)과 이종 체 형성에 중요한 역할을한다. 또한, 추가 조사는 mGlu2의 TM4의 세포 내 끝에있는 세 가지 잔류 물이 세포 6 살아있는에서 5-HT (2A)의 -mGlu2 수용체 헤테로을 형성 할 필요가 있음을 보여 주었다.

이종 발현 시스템에서 관찰 이러한 연구 결과를 바탕으로, 우리가 있는지 여부를 테스트하기 위해 야생 형 mGlu2 및 mGlu2-KO 마우스의 전두엽 피질에서 mGlu2 / mGlu3 키메라 구조의 HSV-매개 표현의 사용을 설명하는 5-HT (2A) 사이의 이종 형성 및 mGlu2가 필요하다환각 5-HT 2A 수용체 작용제에 의해 유도 머리 트 행동.

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Protocol

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참고 : 동물 사육과 염려에 관한 모든 절차는 마운트 시나이 의과 아이칸 학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 규정에 따라 실시 하였다. 절차를 통해 멸균 장갑을 사용하십시오.

1. 약물 및 바이러스 준비

  1. 의약품 제조
    1. 12.9 ml의 % 0.9의 식염수 용액에 100 ㎎ / ㎖ 케타민 1.35 ㎖의 20 ㎎ / ㎖ 자일 라진 0.75 ml에 용해하여 15.0 ml의 케타민 / 자일 라진의 마취제를 준비합니다. 철저하게 솔루션을 섞는다.
  2. 바이러스 준비
    1. mGlu2를 복제하고 mGlu2ΔTM4N는 표준 프로토콜 이전 6 설명 따르는 bicistronic 단순 포진 바이러스 (HSV) 벡터로 구성한다. 이전 6,13,14 설명 된대로 바이러스 입자를 패키지로 제공된다. 잔류 교체 알라-677 4.40, mGlu2에서의 Ala-681 4.44 및 Ala685 4.48 Ser686 4.40, 박사에 대한e690 4.44와의 Gly-694 4.48 mGlu3 (HA-mGlu2ΔTM4N) 이전에 6 설명 하였다.
      주 : 이전에 키메라 구조 HA-mGlu2ΔTM4N 그대로 G 단백질에 의존 6 신호와 함께 세포막에서 발현되는 것을 증명했다.
    2. 에 바이러스 벡터를 저장 -80 ° C ~ 사용하지 않을 때입니다. 다음 해동 바이러스 얼음 벡터, 및 10 ㎕의 분취 량으로 나누어지는. 수술 절차는 얼음에 보관하십시오.

2. 수술

  1. 수술 준비
    1. (1.1.1 참조 자세한 내용은) 마우스를 달아 케타민 / 자일 라진 칵테일의 적절한 투여 량으로 마우스를 주입.
    2. 제대로 마취 경우, 참조 응답을 유도 할 수 없습니다, 마우스가 제대로 마취 경우, 통증 응답을 발과 꼬리를 짜내 마우스를 선택합니다.
    3. 가위를 사용하여 코의 선단에 두개골의베이스에서 마우스 면도 헤드. 마우스 AF에 안과 젤을 적용마우스의 실명을 방지하기 위해 terward.
    4. 정위 프레임에 각 주사기를로드합니다. 그들은 10도 떨어져 정상에서되도록 다음 정위 프레임의 각 암의 수직 부분을 기울이십시오. 바늘이 서로 마주되도록, 팔이 기울어되어 있는지 확인합니다.
    5. 70 % 에탄올로 바늘을 작성하여 각 주사기를 청소합니다. 주사기가 깨끗한 지 확인하기 위해 바늘을 적어도 세 번 입력합니다.
    6. 바늘이 세정 된 후, 이중 증류수 H 2 O로 바늘을 작성하여 바늘 플러시 일단 플러시, 두 번 증류수 H 2 O의 1.3 μl를 각 바늘을 채우기 두 번 증류 H 2 O의 0.3 μl를 해제하기 위해 주사기의 플런저를 트위스트 바늘의 끝에서 물이 구슬은 신중하게 물을 닦아합니다. 아무것도 주사기에서 제공하지 않는 경우, 완전히 플런저를 눌러 다음 주사기의 청소를 반복합니다.
    7. 물을 충전 한 후, 다음 주사기를 충전 주사기를 올려공기의 0.5 μL.
    8. 공기와 물이 주사기되면 신중 바이러스 용액 1.3 μL로 주사기를 채우기. 이때 주사기 전량 2.8 μL인지 확인. 다시 바이러스의 0.3 μl를 해제 주사기의 끝을 비틀어. 바늘의 끝에서 액체 구슬, 조심스럽게 액체를 닦아합니다. 아무것도 주사기에서 제공하지 않는 경우, 완전히 플런저를 눌러 다음 주사기의 청소를 반복합니다.
  2. 외과
    1. 두개골 레벨과 평면이되도록 정위 프레임을 조정해야합니다 만드는 정위 프레임에 마우스를 연결합니다. 노출 된 두피에 povodine 요오드 적용합니다. 메스를 사용하여 노광 면도 지역 두개골의 정중선을 따라 시상 절개를 만든다. 그리고 두개골이 노출 남아 있는지 확인하기 위해 절개 부위에 피부에 뷰렛 클램프를 연결합니다.
    2. 의 봉합을 노출 골막을 멀리 용해 H 2 O 2를 사용하여두개골. 지금 브레 그마 및 봉합이 볼 수 있도록, 두개골 레벨이 있는지 확인하기 위해 정위 프레임을 조정해야합니다.
    3. 브레 그마와 주사기의 바늘 끝을 맞추고 브레 그마의 좌표를 기록합니다. 바늘이 삽입 될 예정의 좌표를 계산합니다.
      1. 주동이-Cauldal (RC)면의 경우, 기록 RC의 브레 그마 좌표 (브레 그마로부터 1.6)에 1.6 mm를 추가합니다. 지느러미 - 복부 (DV)면의 경우, 기록 DV의 브레 그마 좌표 (브레 그마에서 -2.4)에서 2.4 mm를 뺍니다.
      2. 마지막으로, 내측 측면 (ML)면에 대해 기록 된 ML의 브레 그마 좌표 (브레 그마로부터 2.6)에 2.6 mm를 추가합니다. 이것은 양자 주입입니다 모든 좌표를 들어, 모두 왼쪽과 오른쪽 좌표를 기록해야합니다.
    4. 원하는 좌표에 바늘을 가져옵니다. 바늘이 삽입되어 드릴, 표시된 영역을 드릴 될 것 곳의 장소를 표시합니다.
    5. 코튼 팁 어플리케이터 위스콘신과초과 혈액이나 뼈 조각을 멀리 퍼가기.
    6. 바늘의 끝은 뇌의 표면을 터치하는 두개골에 바늘을 가져옵니다. 그런 다음 천천히 저하 원하는 좌표에 바늘을 낮 춥니 다.
    7. 바늘 원하는 좌표되면 천천히 (총 0.5 μL)에 5 분에 걸쳐 분당 바늘 0.1 μL의 플런저 꼬아 주사기의 내용물을 주입.
    8. 주입이 완료되면 또 다른 5 분 동안 피질 주사기를 떠난다.
  3. 최대 닫기 / 관리
    1. 꾸준히 천천히 마우스 피질에서 바늘을 제거합니다. 그런 다음 정위 프레임에서 마우스를 제거합니다.
    2. 집게는 피부의 플랩을 잡고 함께 배치와 다음 절개 부위에서 피부의 기본 플랩에 시아 노 아크릴 레이트 (피부 접착제)를 적용합니다.
    3. 시아 노 아크릴 레이트가 건조하도록 허용합니다. 가열 패드가 surg 경우 선택 사항입니다 (가열 패드에 케이지에서 마우스를 놓습니다iCal의 스위트 룸은 37 ° C의 RT에서 유지 - 그렇지 않으면 필요가 없습니다). 침구는 수술 부위에 부착하지 않도록하기 위해 종이 타월에 마우스를 배치해야합니다.
    4. 수술 후 60 분 - 수술의 길이에 따라 마우스 (30) 내 마취 상태임을 보장한다. 수술 후, 동물은 자신의 새장에 배치하고 복구 할 수있는 그 방에 반환하기 전에 의식이 될 때까지 모니터링된다. 이들은 뇌 생화학 적 경로의 일부를 변경하여 실험 한 결과를 변경할 수 없기 때문에 진통제, 수술 후 사용되지 않는다. 그러나 그들은 수술 당일 마취에서 회복 될 때까지 동물을 모니터링하고, 감염과 통증 / 고통의 평가의 징후 일 후 작업.

3. 머리 트 위치 응답 실험

  1. 설정
    1. 삼일 stereota 후 - 2 오전 10시 2:00 PM, 사이의 모든 행동 시험을 수행바이러스 입자의 CTIC 주입입니다.
    2. 디졸브 (±) -1- (2,5- 디메 톡시 -4- 요오도 페닐) 2.0 ㎎ / ㎏에 0.9 % 생리 식염수로 -2- 아미노 프로판 염산염 (DOI). 또한 0.9 % 식염수 용액을 제조 하였다.
    3. 어떤 침구 않고 홈 케이지 (28 X 18 X 15cm)를 준비하여 비디오 카메라의 뷰 바로 위에 홈 케이지되도록 트라이 포드를 사용하여 카메라를 조정한다.
    4. 실험을 시작하기 전에 적어도 4 시간 동안 방에 생쥐 길들.
    5. 헤드 트를 기록하는 캠코더를 설정합니다.
  2. 실험
    1. 이 홈 케이지 바로 위에 오도록 카메라를 배치합니다. 전체 홈 케이지 시야에 있도록 카메라 보정.
    2. 마우스를 달아 0.9 % 식염수 또는 DOI 하나의 적절한 투여 량 (0.01 ㎖ / g)를 복강 마우스를 주입. 주 : 마우스 25g 무게 경우 0.25 ml의 총 부피로 투여 량을 투여.
    3. FO 자신의 홈 케이지 다시 각 마우스를 놓습니다R 10 분. 빈 홈 케이지의 중심으로 10 분, 대신 마우스 후 카메라의 시야 내에 맹점이 없는지 확인. 캠코더를 눌러 기록. 방을 둡니다.
      참고 : 마우스 움직임과 그 안에 다양한 행동 반응 (... 머리 트, 귀 스크래치 등이 DOI에 의해 유도 된 행동 반응의 전체 목록의 곤잘레스 - Maeso 등 2,007 보충 데이터 표 1을 참조하십시오) 3, 기록한다 30 분. 따라서, 기록 시야에는 사각이없는 것이 중요하다.
    4. 30 분은 원래의 홈 케이지에 다시 캠코더 및 장소 마우스 녹화를 중지 한 후. 각 마우스에 대해이 과정을 반복합니다.
  3. 리뷰
    1. 테이프 마우스의 실험 조건에 장님 각 심판 검토가) (예., 머리 동안 사용 된 약물은 실험 또는 두개 내 주입시 사용되는 바이러스를 트). 수동으로 모든 머리를 통해 서 트 기록심 비디오.
      참고 : 머리 트가 마우스 (부가 영상)에 의해 수행 빠른 흔들림의 머리의 움직임으로 정의된다.
    2. 각 마우스의 경우, 블라인드 심판의 세 합계에서 최종 HTR 응답을 평균. 그런 그룹이 실험 조건에 의한 값 및 통계 분석 (예., t-테스트 또는 ANOVA)을 실시합니다.

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Results

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이전의 결과는 환각제 의해 확실하고 견고하게 유도되는 쥐의 행동 반응을 헤드 트 위치 함을 입증하고, 5-HT 2A -KO 마우스 3 부재. 또한, DOI 및 LSD 환각 5-HT 2A의 작용제에 의해 유발 헤드 트 반응이 크게 mGlu2-KO 마우스 5 감소되었음을 보였다. 그러나, 비록 이전의 연구 결과는 설득력 미해결 남아 살아있는 생쥐의 등이 구조적 배열의 동작 여부를 5-HT 2a 및 mGlu2가, 형질 감염된 세포 1,2,15 시험 관내에서 이종 복합체로 조립되어 있음을 보여줍니다. 완전히 본 manip 여부를 검사 mGlu2-KO 마우스의 전두엽 피질 mGlu2 또는 mGlu2ΔTM4N 하나의 환각 5-HT 2A 수용체 작용제, 식에 의해 유도 된 정신 같은 효과, 5-HT 2A의 -m...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

함께 mGlu2-KO 마우스 (5) 이전의 결과와 함께 배양 된 세포에서의 5-HT 2A의 -mGlu2 수용체 복합체를 형성하지 않는 mGlu2 및 mGlu2 / mGlu3 키메라 구조와 결과가 제안하는 5-HT의 2A -mGlu2에서 이종 체 수용체 복합체 마우스 전두엽 피질 LSD 같은 환각 5-HT 2A 수용체 작용제에 의해 헤드 트 동작을 유도하는데 필요하다. 이 방법의 한계는 기본 조직의 세포 내 수준에 가까운 분자 근접을 측정하지 않습니다. 또한, 주목해야 다양한 한계점이있다. 주 사후 4 일 - 생쥐는 HSV 바이러스 벡터를 주입하기 때문에, 실험이 수행 될 수있는 시간 프레임 (2)이다. 바이러스 벡터의 위치와 표현은 더 이상 4 일 이내 초기 주입 후 단면 한 뇌의 면역 형광 염색 확인해야합니다. 마우스되는 좌표가 일치하지 않거나 바이러스 벡터를 표현한다하지그들은 mGlu2 또는 mGlu2ΔTM4N을 표현하지 않는 실험 데이터에서 제...

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NIH R01MH084894이 연구의 자금 조달에 참여했다. 우리는 박사에게 감사의 말씀을 전합니다. 마우스의 기부금이 작품의 촬영 기간 동안 자신의 수술과 행동 시설의 사용에 대한 의학의 마운트 시나이 학교에서 야스민 허드와 스콧 루소.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
mGlu2 bicitronic 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터 MIT CoremGlu2 및 mGlu2DTM4N을 CMV 프로모터의 제어 하에 GFP를 발현하는 bicistronic HSV-GFP 바이러스 벡터 p1005+ HSV에 subclone하였다. 바이러스 입자는 MIT (McGovern Institute)의 Viral Core Facility에서 생산되었습니다. 자세한 내용은 이사인 Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu)
mGlu2&Delta에게 문의하십시오. TM4N 바이시트로닉 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 벡터 MIT CoremGlu2 및 mGlu2DTM4N을 CMV 프로모터의 제어 하에 GFP를 발현하는 bicistronic HSV-GFP 바이러스 벡터 p1005+ HSV에 subclone하였다. 바이러스 입자는 MIT (McGovern Institute)의 Viral Core Facility에서 생산되었습니다. 자세한 내용은 디렉터인 Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu)
GFP bicitronic herpes simplex virus (HSV) vector MIT CoremGlu2 및 mGlu2DTM4N을 CMV 프로모터의 제어 하에 GFP를 발현하는 bicistronic HSV-GFP 바이러스 벡터 p1005+ HSV에 subclone하였다. 바이러스 입자는 MIT (McGovern Institute)의 Viral Core Facility에서 생산되었습니다. 자세한 내용은 이사인 Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu)
Xylazine LloydList no. 4811-20ml, NADA #139-236, NDC 코드: 61311-481-101.35 ml의 케타민 (100 mg/ml) + 0.75 ml의 자일라진 (20 mg/ml)을 0.9% 식염수 케타민 12.0 ml에 희석;
VedcoKetaVed-10ml, NADA #200-029, NDC 코드: 50989-161-06케타민 1.35ml(100mg/ml) + 자일라진 0.75ml(20mg/ml) 12.0ml에 희석 0.9% 식염수 안
과 젤Fisher ScientificNC0550805
Burret 클립Fisher ScientificNC9268369
Feather 수술용 칼날Fisher ScientificNC9032736
수소 과산화물피셔 사이언티픽19-898-919 
해밀턴 주사기Fisher Scientific14815203
Hamilton™ 스몰 허브 탈착식 바늘 (33 Ga)Fisher Scientific14816206
무선 마이크로 드릴Fisher ScientificNC9089241
Dermabond 피부 접착제Fisher ScientificNC0690470
(±)-1-(2,5-디메톡시-4-요오도페닐)-2-아미노프로판 염산염(DOI)시그마-알드리치42203-78-10.9% 식염수에 2.0mg/kg의 농도로 용해
에게 문의하십시오.

References

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