내생의 면역 형광 분석 및 외인성 센트로 - 동원체 단백질

요약

여기에서는 인간 세포에서 내인성 및 외인성 centromere-kinetochore 단백질을 검출하고 고정(파라포름알데히드, 아세톤 또는 메탄올 고정)을 통한 간접 면역형광 염색을 통해 centromeres-kinetochores에서 이러한 단백질 수준을 정량화하는 프로토콜을 보고합니다.

초록

Centromeres"와 "kinetochores"는 세포 분열 중에 염색체가 방추체와 결합하는 부위를 나타냅니다. 세포주기 동안 centromere-kinetochore 단백질의 직접 시각화는 이러한 단백질의 메커니즘을 조사하는 데 기본적인 도구로 남아 있습니다. 형광 현미경 검사의 고급 이미징 방법은 centromere-kinetochore 구성 요소의 놀라운 해상도를 제공하고 centromeres 및 kinetochores의 특정 분자 구성 요소를 직접 관찰할 수 있습니다. 또한 특정 항체를 사용한 간접 면역형광(IIF) 염색 방법이 이러한 관찰에 매우 중요합니다. 그러나 IIF 프로토콜에 대한 수많은 보고에도 불구하고 특정 중심체-키네토코어 단백질의 문제를 자세히 논의한 사례는 거의 없었습니다. ^1-4 여기에서는 파라포름알데히드 고정 및 IIF 염색을 사용하여 인간 세포의 내인성 중심체-키네토코어 단백질을 염색하기 위한 최적화된 프로토콜을 보고합니다. 또한, 아세톤 또는 메탄올 고정을 받은 인간 세포에서 Flag 태그가 지정된 외인성 CENP-A 단백질을 검출하기 위한 프로토콜을 보고합니다. 이러한 방법은 인간 세포를 포함하여 내인성 centromere-kinetochore 단백질 및 Flag 태그가 지정된 CENP-A 단백질을 검출하고 정량화하는 데 유용합니다.

서론

"중심절은"고전적인 유전학 억제 감수 재조합의 영역으로 정의하고 나중에 유사 분열시 정확한 염색체 분리에 필수적인 역할을한다 유사 분열 염색체의 주요 수축으로 인식되었다. "Kinetochores"은 전자 현미경에 의해 계시 된, 중심절의 표면에 미세 소관 결합 다층 구조로서 기술 하였다; "kinetochores은"나중에 유사 분열 염색체의 동원체에 지역화 거대 분자 복합체로 정의 하였다. 척추 사이 센트로 DNA 서열의 극적인 차이에도 불구하고, 구조 및 동원체 조성물은 고도로 보존된다. 스핀들 미세 소관과 동원체 사이의 역동적 인 상호 작용은 유사 분열시 염색체의 충실한 분리에 필요한 및 센트로 - 동원체 기능 리드의 결함 이수성하여 암이다.

대부분의 진핵 생물의 센트로어떠한 정의 된 DNA 서열이 없지만 171 bp의 α 위성 DNA로 이루어진 반복 alphoid DNA의 큰 배열 (0.3-5 MB)로 구성된다. 효모 신진 제외 센트로 ID가없는 DNA 서열이 아니라 히스톤 H3 변이체 CenH3 포함 특수 뉴 클레오 좀의 존재에 의해 달성된다 (센트로 단백질을 [CENP-A] 인간). ⁵ CENP-A의 뉴 클레오는에 지역화 171-bp의 α-위성 DNA에 포유류 kinetochores ⁷ 바....

프로토콜

1. 세포 배양 및 형질

1. 6 웰 폴리스티렌 플레이트 커버 유리 (22mm X 22mm)를 넣습니다. 선택적으로 코트 아래 단계에 따라 커버 유리에 유사 분열 세포를 유지하기 위해 (자재 / 장비의 목록 참조) 물에 폴리 - L - 라이신과 커버 유리, V / w 0.1 %, :
   주 : 최적의 조건은 각각의 세포주 및 애플리케이션에 대해 결정되어야한다.
   1. 물에 폴리 - L - 라이신, V / w 0.1 %와 무균 코트 문화 표면 (0.4 ㎖ / 웰의 6 자 폴리스티렌 판). 문화 표면에도 코팅을 보장하기 위해 부드럽게 바위.
   2. 5 분 후, 흡인에 의해 용액을 제거하고 철저하게 무균 조직 배양 등급 물로 표면을 씻어.
   3. 세포와 매체를 도입하기 전에 건조 적어도 2 시간.
2. 씨 헬라 세포 ⁽¹⁷⁾ 또는 6 자 폴리스티렌 판에 넣어 커버 유리 (22mm X 22mm)에 ^{17, 22} 헬라 테트 오프 세포. 해당 셀 밀도가 아니라 당 5.4 × 10 ⁵ 확인하십시오. 문화 세포10 % FBS, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신과 하이 글루코스 DMEM이다.
   주 : 최적의 결과를 실험적 시드에 사용할 셀 밀도를 결정한다.

결과

내생 CENP-A의 면역 형광 분석 CUL4A-E3 리가 아제가 동원체에 CENP-A의 현지화에 필요한 가설을 지원합니다
우리의 최근의 연구는 CUL4A-RBX1 - COPS8 E3 리가 활동이 CENP-A와 동원체에 CENP-A의 현지화에 라이신 124 (K124)의 ubiquitylation 필요하다는 것을 보여 주었다. ⁽¹⁷⁾ 처음에는 계면-센트로 단지 (ICEN가)에 의해 분리 하였다 안티 CENP-A : 기본 염색질 면역, ^32-34는 ICEN 단백질의 일부 중심절에 CENP-A 지역화에서 중요한 역할을 할 수 있다고 가정하고있다. 따라서, siRNA를 녹다운 실험은 그 부재 발현 중심절 ¹⁷ CENP-A의 비편 재화를 유발하는 단백질을 선별하도록 수행되었다 (데이터는 미도시) 비동기 성장 HeLa 세포는 회 Cullin 4A (CUL4A)의 siRNA 또는 R.......

토론

최근 몇 년 동안 많은 연구가 고정 된 세포에 대해 서로 다른 양적 현미경 분석법을 개발 하였다. ⁽⁴²⁾ 진행을 센트로 - 동원체 생물학에 자주 세포 내 공간 - 시간 규제의 변화하는 기능을 반영하고있는 단백질의 센트로 별 또는 동원체 특정 기능에 대한 이해가 필요 세포주기 중에 이러한 단백질. 따라서, 우리가 IIF 염색 구체적으로 다르​​게 취급 샘플에 적용 할 수있는 내인성 및 외인성 CENP-A 단백질의 상대적인 수준을 분석하는 정량적 IIF 분석 방법을 개발했다. 현재 우리는이 연구에서 프로토콜 2를 사용하여 내생 CENP-I, CENP-H, KNL1, Hec1 및 Ska1의 성공적인 IIF 염색을 달성 (. Niikura 등 ^(24)와 데이터가 표시되지 참조; 재료 / 장비의 목록을 항체의 내용) . 미래에는, 하나의 (상이한 센트로-동원체 단백질의 수준을 정량화하기 endog을 모두 동일한 방법을 적용 할 수있다특정 항체를 선택) enous 및 외래 단백질을.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Lipofectamin 2000	Life Technologies/Invitrogen	11668	형질주입 시약 I
Lipofectamin RNAiMAX	Life Technologies/Invitrogen	13778	형질주입 시약 II
Opti-MEM I	Life Technologies/Invitrogen	31985	감소된 혈청 배지, 37°C에서 따뜻함; C 사용 전 수조
고포도당 DMEM(Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 매체)	Life Technologies/BioWhittaker	12-604	고포도당 DMEM, 37°C에서 따뜻하게; 사용 전 C 수조
Fetal Bovine Serum, 인증, 열 비활성화, US origin	Life Technologies/Gibco	10082	FBS (태아 소 혈청)
Poly-L-Lysine SOLUTION	SIGMA-SLDRICH	P 8920	Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, 물 내
UltraPure Distilled Water	Life Technologies/Invitrogen/Gibco	10977	멸균 조직 배양 등급 물
마이크로 커버 유리(22mm x 22mm)	Surgipath	105	커버 유리(22mm x 22mm)
6웰 세포 배양 클러스터	Fisher/Corning Incorporated	07-200-83	6웰 폴리스티렌 플레이트
페니실린, 스트렙토마이신; Liquid	Fisher/Gibco	15-140	페니실린-스트렙토마이신
PAP PEN	결합 부위	AD100.1	소수성 장벽 펜(면역형광 염색 시 발수 장벽용)
파클리탁셀(탁솔)	유사분열 세포 분석용	SIGMA-SLDRICH	T7402
, TN-16, 미세소관 억제제(TN16)	엔조 생명과학	BML-T120	TN16 유사분열 세포 분석용 BSA
(소 혈청 알부민)	SIGMA-SLDRICH	A7906	차단 시약
Triton X-100	SIGMA-SLDRICH	T8787	투과 화 용 세제
파라 포름 알데히드	SIGMA-SLDRICH	P6148	고정 reagant
DAPI	SIGMA-SLDRICH	D9542	핵 염색
용 p- 페닐 렌 디아민	SIGMA-SLDRICH	P6001	매체 장착 용
VWR 마이크로 슬라이드, Frosted	VWR International	48312-013	마이크로 슬라이드
항-CENP-A 항체	Stressgen/Enzo Life Sciences	KAM-CC006	마우스 단클론 항체; 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)
항-CENP-B 항체	Novus Biologicals	H00001059-B01P	마우스 단클론 항체; 1:200 (IIF, 메탄올/아세톤 고정)-1:400 (IIF, 파라포름알데히드 고정)
항-CENP-B 항체의	abcam	ab25734	토끼 다클론 항체; 1:200 (IIF, 메탄올/아세톤 고정)-1:400 (IIF, 파라포름알데히드 고정)
항중심체 항체 (ACA)	Fitzgerald Industries International, Inc.	90C-CS1058	인간 중심체 항혈청; 1:2000 (IIF)
Anti-CENP-H 항체	Bethyl Laboratories	BL1112 (A400-007A)	토끼 다클론 항체; 1:200 (IIF)
Anti-CENP-H 항체	BD	612142	Mouse monoclonal 항체; 1:200 (IIF)
Anti-CENP-I 항체	N/A, Dr. Katusmi Kitagawa N/A, Dr. Katusmi Kitagawa		토끼 다클론 항체; 1:1000 (IIF)의 희석 비율; Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006)
Anti-KNL1 항체	Novus Biologicals	NBP1-89223	토끼 다클론 항체; 1:100 (IIF)
Anti-Hec1 항체	Novus Biologicals / GeneTex	NB 100-338 / GTX70268	Mouse monoclonal antibody; 1:100 (IIF)
Anti-Hec1 항체	GeneTex	GTX110735	Rabbit polyclonal 항체; 희석 비율 1:100 (IIF)
Anti-Ska1 항체	abcam	ab46826	Rabbit polyclonal 항체; 1:100 (IIF)
Anti-Flag 항체	SIGMA-ALDRICH	F3165	Mouse monoclonal 항체의 희석 비율; 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anti-Flag 항체	SIGMA-ALDRICH	F7425	Rabbit polyclonal 항체; 희석 비율 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anti-CUL4A 항체	N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri	N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri	Rabbit 다클론 항체;1:3000의 희석 비율 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999)
Anti-RBX1 antibody	Cell Signaling	4397	Rabbit polyclonal antibody; 1:2000 (WB)
Anti-GAPDH antibody	Chemicon	MAB374	Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:5000 (WB)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG	Life Technologies/Invitrogen	A11001	fluorophore-conjugated secondary 항체 (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG	Life Technologies/Invitrogen	A11005	fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG	Life Technologies/Invitrogen	A11008	fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG	Life Technologies/Invitrogen	A11012	fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Non fat powdered milk (approved substitutetion for carnation powdered milk)Fisher	Scientific	NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629)	탈지 우유
Leica DM IRE2 전동 형광 현미경	Leica		전동 형광 현미경
HCX PL APO 63x 오일 이멀젼 렌즈	라이카	LEICA HCX PL APO NA 1.40 오일 PH 3 CS	63X 오일 이멀젼 렌즈
HCX PL APO 100x 오일 이멀젼 렌즈	라이카	LEICA HCX PL APO NA 1.40 오일 PHE	100X 오일 이멀젼 렌즈
라이카 EL6000 컴팩트 광원	라이카		형광 여기용 외부 컴팩트 광원
ORCA-R2 디지털 CCD 카메라	하마마츠	C10600-10B	디지털 CCD 카메라
Openlab 버전 5.5.2 과학 이미징 소프트웨어	Perkin Elmer/Improvision		이미지 관찰, 획득, 정량화 및 분석용
Velocity 버전 6.1.1 3D 이미지 분석 소프트웨어	Perkin Elmer/Improvision		이미지 관찰, 획득, 정량화 및 분석을 위한
완전한 EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일	Roche	11873580001/11836170001	프로테아제 억제제 칵테일 정제
PlusOne 2-D Quant Kit	Amersham Biosciences	80-6483-56	단백질 농도 측정을 위한 상용 단백질 분석 시약 I(2% SDS와 호환 가능)
Bio-Rad 단백질 분석	Bio-Rad	500-0006	단백질 농도 측정을 위한 상용 단백질 분석 시약 II(0.1% SDS와 호환 가능)
Immobilon-FL	EMD Millipore	IPFL00010	PVDF 멤브레인
IgG	LI-COR Biosciences	926-32210	IR 형광 염료 접합 2차 항체(Affinity-purified 2차 항체); 희석 비율 1:20000 (IIF)
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32221	IR 형광 염료 접합 2차 항체 (Affinity-purified secondary 항체); 1:20000 (IIF)
Goat anti-Mouse IgG DyLight 549	Fisher Scientific	PI35507	DyLight-conjugated secondary antibodyIR 형광 염료 접합 2차 항체 (Affinity-purified secondary antibody); 1:20000의 희석 비율 (IIF)
Goat anti-Rabbit DyLight 649	Fisher Scientific	PI35565	DyLight-conjugated secondary antibodyIR 형광 염료 접합 2차 항체 (Affinity-purified secondary antibody); 1:20000 (IIF)의 희석 비율
anti-mouse IgG-HRP	Santa Cruz	SC-2005	HRP-conjugated secondary antibodyDyLight conjugated secondary antibodyIR 형광 염료 접합 2차 항체 (Affinity-purified secondary antibody) 항체); 1:10000 (IIF)
염소 항토끼 IgG-HRP	Santa Cruz	SC-2004	HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR 형광 염료-conjugated secondary 항체 (Affinity-purified secondary antibody); 1:10000 (IIF)의 희석 비율
Openlab version 5.5.2. 과학 이미징 소프트웨어	Improvision/PerkinElmer		소프트웨어 A
Volocity 버전 6.3 3D 이미지 분석 소프트웨어(Volocity Acquisition)	PerkinElmer		소프트웨어 B1
Volocity 버전 6.3 3D 이미지 분석 소프트웨어(Volocity Quantification)	PerkinElmer		소프트웨어 B2
Branson SONIFIER 450			Sonicator
Branson Ultrasonics Sonicator Microtip Step, Solid, 스레드 9.5mm	VWR Scientific Products Inc.	33995-325	초음파 처리 용 디스럽터 혼
Branson 초음파 초음파 발생기 Microtip 테이퍼 6.5mm	VWR Scientific Products Inc.	33996-185	초음파 처리를 위한 마이크로팁
Odyssey CLx 적외선 이미징 시스템	LI-COR Biosciences		면역 얼룩 감지를 위한 적외선 이미징 시스템
Image Studio 분석 소프트웨어 버전 4.0	LI-COR Biosciences		소프트웨어 C
분자 이미저 Versadoc MP4000 시스템	Bio-Rad		화학발광 이미저
Quantity One 1-D 분석 소프트웨어	Bio-Rad		Software D
SuperSignal West Femto 최대 감도 기판	Thermo	34095	초고감도 강화 화학발광(ECL) 기판