내생의 면역 형광 분석 및 외인성 센트로 - 동원체 단백질

Summary

여기에서는 인간 세포에서 내인성 및 외인성 centromere-kinetochore 단백질을 검출하고 고정(파라포름알데히드, 아세톤 또는 메탄올 고정)을 통한 간접 면역형광 염색을 통해 centromeres-kinetochores에서 이러한 단백질 수준을 정량화하는 프로토콜을 보고합니다.

Abstract

Centromeres"와 "kinetochores"는 세포 분열 중에 염색체가 방추체와 결합하는 부위를 나타냅니다. 세포주기 동안 centromere-kinetochore 단백질의 직접 시각화는 이러한 단백질의 메커니즘을 조사하는 데 기본적인 도구로 남아 있습니다. 형광 현미경 검사의 고급 이미징 방법은 centromere-kinetochore 구성 요소의 놀라운 해상도를 제공하고 centromeres 및 kinetochores의 특정 분자 구성 요소를 직접 관찰할 수 있습니다. 또한 특정 항체를 사용한 간접 면역형광(IIF) 염색 방법이 이러한 관찰에 매우 중요합니다. 그러나 IIF 프로토콜에 대한 수많은 보고에도 불구하고 특정 중심체-키네토코어 단백질의 문제를 자세히 논의한 사례는 거의 없었습니다. ^1-4 여기에서는 파라포름알데히드 고정 및 IIF 염색을 사용하여 인간 세포의 내인성 중심체-키네토코어 단백질을 염색하기 위한 최적화된 프로토콜을 보고합니다. 또한, 아세톤 또는 메탄올 고정을 받은 인간 세포에서 Flag 태그가 지정된 외인성 CENP-A 단백질을 검출하기 위한 프로토콜을 보고합니다. 이러한 방법은 인간 세포를 포함하여 내인성 centromere-kinetochore 단백질 및 Flag 태그가 지정된 CENP-A 단백질을 검출하고 정량화하는 데 유용합니다.

Introduction

"중심절은"고전적인 유전학 억제 감수 재조합의 영역으로 정의하고 나중에 유사 분열시 정확한 염색체 분리에 필수적인 역할을한다 유사 분열 염색체의 주요 수축으로 인식되었다. "Kinetochores"은 전자 현미경에 의해 계시 된, 중심절의 표면에 미세 소관 결합 다층 구조로서 기술 하였다; "kinetochores은"나중에 유사 분열 염색체의 동원체에 지역화 거대 분자 복합체로 정의 하였다. 척추 사이 센트로 DNA 서열의 극적인 차이에도 불구하고, 구조 및 동원체 조성물은 고도로 보존된다. 스핀들 미세 소관과 동원체 사이의 역동적 인 상호 작용은 유사 분열시 염색체의 충실한 분리에 필요한 및 센트로 - 동원체 기능 리드의 결함 이수성하여 암이다.

대부분의 진핵 생물의 센트로어떠한 정의 된 DNA 서열이 없지만 171 bp의 α 위성 DNA로 이루어진 반복 alphoid DNA의 큰 배열 (0.3-5 MB)로 구성된다. 효모 신진 제외 센트로 ID가없는 DNA 서열이 아니라 히스톤 H3 변이체 CenH3 포함 특수 뉴 클레오 좀의 존재에 의해 달성된다 (센트로 단백질을 [CENP-A] 인간). ⁵ CENP-A의 뉴 클레오는에 지역화 171-bp의 α-위성 DNA에 포유류 kinetochores ⁷ 바인드의 내부 플레이트. 활성 중심절이 필요 CENP-A 함유 함께 스핀들 체크 포인트를 통해 유사 분열 스핀들 및 후속주기 진행에 염색체의 부착을 조절하는 구성 적 센트로 관련 네트워크 (CCAN)과 동원체 단백질의 모집을 지시하는 뉴 클레오합니다.

상기 증거 비추어 CENP-A는 센트로 ⁸ 후성 마크 것으로 제안되었다; 그러나, 처리되는 CENP-A는 I을 인용NTO 센트로이 DNA 결합을 담당하는 요소가 아직 특징 화되지 않았다. 짧은 센트로 타겟팅 도메인 (CATD)는 CENP-A의 영역을 배 히스톤에 상주하고 CATD와 H3의 해당 영역의 교체가 센트로에 직접 H3에 충분하다. ⁹ 몇몇 연구는 번역 후를위한 기능적 역할을 제안 수정 CENP-A ^12-16의 (PTM) 그러나, 중심절에 모집에서 CENP-A의 이러한 PTMS의 분자 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았다. 우리는 이전에 CUL4A-RBX1 - COPS8 E3 리가 활동이 동원체에 CENP-A의 CENP-A K124의 ubiquitylation 및 지역화를 위해 필요하다고보고했다. ⁽¹⁷⁾

동원체 단백질의 발견 및 특성화 염색체 분리에 관한 새로운 통찰력을 주도하고있다. ^{18 개의} 100보다 동원체 성분을 다양한 방법으로 척추 동물 세포에서 확인되었다. ^{(19, 20)} 아래형광 현미경에 kinetochores는 조립과 기능 또한 세포 내의 각 센트로 - 동원체 단백질과 단백질 - 단백질 네트워크의 세포 기능의 특성에서 오는 방법의 서. ⁽¹⁹⁾ 직접 시각화 및 고급 이미징 방법은 센트로 - 동원체 구성 요소의 놀라운 해상도를 제공 할 수 중심절과 kinetochores의 특정 분자 구성 요소의 직접 관찰. 또한, 특이 적 항체를 이용하여 간접 면역 형광 방법 (IIF) 염색이 관찰에 중요하다. 그러나, 특정 센트로 - 동원체 단백질의 세부 문제를 논의 IIF 프로토콜, 몇 가지에 대한 수많은 보고서에도 불구하고. ^1-4 따라서, 개발하고 특히 각 센트로 - 동원체 단백질을 분석하는 IIF 염색 및 정량 IIF 분석의 방법을보고하는 것은 매우 중요합니다. IIF 염색에서, 하나의 관심 단백질의 손실을 방지하기 위해 염색 프로토콜을 진행해야하거나셀의 나머지. 그러나 고정 가끔 항원 사이트를 파괴하고, 다른 항체 - 항원 조합은 하나의 정착과 함께 제대로 작동하지만 아주 잘 다른, ^21, 정착액의 선택에 크게 관심의 단백질 (들)에 따라 달라집니다. 따라서, 다른 정착 방법은 센트로 - 동원체 단백질의 IIF 염색에서 중요하다.

간접 면역 형광 (IIF) 염색 및 CENP-A와 국기 태그가 외생 CENP-A 단백질, 인간 세포에서이 단백질의 정량을 포함하여 내인성 센트로 - 동원체 단백질의 현지화를 해결하기 위해 분석의 여기에 최적화 된 방법이 개발되었다. 이러한 방법은 다른 종 센트로-동원체 단백질의 분석에 적용될 수있다.

Protocol

1. 세포 배양 및 형질

1. 6 웰 폴리스티렌 플레이트 커버 유리 (22mm X 22mm)를 넣습니다. 선택적으로 코트 아래 단계에 따라 커버 유리에 유사 분열 세포를 유지하기 위해 (자재 / 장비의 목록 참조) 물에 폴리 - L - 라이신과 커버 유리, V / w 0.1 %, :
   주 : 최적의 조건은 각각의 세포주 및 애플리케이션에 대해 결정되어야한다.
   1. 물에 폴리 - L - 라이신, V / w 0.1 %와 무균 코트 문화 표면 (0.4 ㎖ / 웰의 6 자 폴리스티렌 판). 문화 표면에도 코팅을 보장하기 위해 부드럽게 바위.
   2. 5 분 후, 흡인에 의해 용액을 제거하고 철저하게 무균 조직 배양 등급 물로 표면을 씻어.
   3. 세포와 매체를 도입하기 전에 건조 적어도 2 시간.
2. 씨 헬라 세포 ⁽¹⁷⁾ 또는 6 자 폴리스티렌 판에 넣어 커버 유리 (22mm X 22mm)에 ^{17, 22} 헬라 테트 오프 세포. 해당 셀 밀도가 아니라 당 5.4 × 10 ⁵ 확인하십시오. 문화 세포10 % FBS, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신과 하이 글루코스 DMEM이다.
   주 : 최적의 결과를 실험적 시드에 사용할 셀 밀도를 결정한다.
3. 18 시간 동안 5 % CO ₂ 분위기하에 37 ℃에서 세포를 인큐베이션.
   주 : 헬라 테트 - 오프 셀의 경우, 외래 유전자의 전사를 유도 (즉, 테트라 사이클린 / 독시사이클린) 테트라 사이클린 / 독시사이클린 않고 따라서 배양 세포의 부재하에 활성 및 pTRM4 과발현 벡터 (표 2 일시적 형질 ), 그 전사 TRE 프로모터에 의해 조절된다 (아래 참조).
4. 시드, 트랜 세포 후 여덟 시간은 다음과 같습니다 :
   1. (20 μM 어닐링 주식을 표 1) 1.5 μL의 siRNA를 올리고 혼합하여 용액 A를 확인 및 / 또는 2.0 μg의 플라스미드 (표 2) 50 μl를 감소 혈청 배지 (자재 / 장비의 목록 참조), 5 분 동안 실온에서 품어 .
      참고 :이 분석에서,CA-UTR 된 siRNA (5 혼합물 '및 3'UTR의 siRNA; 표 1)의 공동 형질 감염 프로토콜 (3, 4) (논의 참조)에 사용 하였다.
   2. 내가 혈청 배지를 감소 50 μL에 (재료 / 장비의 목록 참조), 5 분 동안 실온에서 품어 0.75 ㎕를 형질 전환 시약을 혼합하여 용액 B를 확인합니다.
      참고 : 선택적 단계가 형질 전환 시약 II μL 1.0의 추가이다 (자재 / 장비의 목록 참조).
   3. 함께 솔루션 A와 B를 혼합하고 15 분 동안 실온에서 품어.
   4. PBS로 한번 배양 된 세포를 세척 한 후 6 웰 폴리스티렌 플레이트의 각 웰에 혈청 배지를 감소 500 μl를 추가합니다. 직접 아니라 개인의 각 솔루션 및 B (즉, RNA 및 / 또는 DNA 지질 복합체)의 혼합물을 추가합니다.
      주 : 최종 농도 3.3 ㎍ / ㎖ (플라스미드)이고; 50 nM의 (siRNA를).
   5. 4.5 시간 동안 5 % CO ₂ 분위기하에 37 ℃에서 세포를 인큐베이션. 높은 혈당 DMEM 재치에 매체를 변경H, 10 % FBS, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신.
   6. 형질 감염 후 48 내지 72 시간 동안 5 % CO ₂ 분위기하에 37 ℃에서 세포를 인큐베이션.
      주 : 최적의 결과를 위해, 고정 전에 세포 성장에 대한 잠복기가 경험적으로 결정되어야하고, 단백질 결핍 및 / 또는 발현을 웨스턴 블롯 분석으로 확인되어야한다 (프로토콜 6 참조).
   7. 유사 분열 세포 분석이 관심을 경우, 고정하기 전에 배양 세포에 24 시간을 파클리탁셀 (10 nM의)를 추가하거나 고정하기 전에 배양 된 세포 2.5 시간에 TN16 (0.5 μM)를 추가합니다.

2. 세포 고정과 면역 형광 염색법이 내생 센트로 - 동원체 단백질을 감지하는 (파라 포름 알데히드 고정)

1. 정착액, 버퍼 및 시약의 제조.
   1. 갓 PBS, pH 7.4의 4 % 파라 포름 알데히드 용액 50 ㎖를 준비한다.
      1. 환기 후드에 저어 접시에 유리 비커에 1 × PBS의 40 ML을 추가합니다. 열 동안 stirrin약 60 ° C에 g. 가열 된 PBS에 파라 포름 알데히드 분말 2g을 추가합니다.
      2. 분말 즉시 용해되지 않기 때문에, 총 1 N의 NaOH 1 ㎖을 첨가하여 pH를 서서히 올린다.
         주 : 수산화 나트륨 용액의 첨가 후 클리어한다.
      3. 파라 포름 알데히드는, 차가운 용해시키고, 용액을 필터링하면.
      4. pH 7.4의 1 N 염산으로 pH를 50 ml의 1 × PBS와 솔루션의 볼륨을 조정합니다.
         참고 : 용액의 분취 량은 냉동 또는 긴 1과 일주일 동안 2-8 ° C에 저장할 수 있습니다. 이 사용될 때까지 용액을 빙냉 4 ℃에서 보관해야한다.
   2. 10 mM 트리스 - 염산, pH가 7.5로 구성되어 버퍼 KB1, 50 ㎖를 준비; 150 mM의 NaCl을; 0.5 % BSA; 0.5 % 트리톤 X-100.
      참고 : BSA가 새로 추가해야합니다.
      참고 : 버퍼 KB 시리즈는 이전 보고서에 기술 된 버퍼 KB 기반으로 ^1,2,4.
   3. 10 mM 트리스 - 염산 완충액으로 구성 KB2, 50 ㎖를 준비pH가 7.5; 150 mM의 NaCl을; 및 0.5 % BSA.
      참고 : BSA가 새로 추가해야합니다.
   4. DAPI (50 NG / ㎖)를 포함하는 버퍼 KB3 1 ㎖를 준비합니다.
   5. 1 ㎎ / ㎖의 -p- 페닐 렌 디아민으로 구성되어 장착 배지 100㎖를 준비; PBS 10 %, 90 % 글리세롤.
      1. 1 N NaOH로 9.8 1 × PBS의 pH를 조정 용액에 -p- 페닐 렌 디아민을 용해하고 글리세롤을 추가합니다.
      2. 저장 -80 ° C에서 1 ml의 분취 량. 빛으로부터 보호합니다.
2. 세포 고정 용 48 ~ 72 시간 포스트 형질 전환 (프로토콜 1 참조)에 흡인에 의해 배양 배지를 제거합니다. 한 번 PBS와 린스 세포. 세포의 표면을 방해하지 않도록 배양 웰의 측면에 PBS를 적용한다.
   주 : 셀 고정 용 최적 시점은 경험적으로 결정되어야한다.
3. 4 ℃에서 30 분 동안 PBS 중의 4 % 파라 포름 알데히드에 세포를 고정한다. 충분히 잔류 4 % 파라 포름 알데히드를 제거하는 버퍼 KB2로 두 번 세포를 씻어.
4. PermeabiRT에서 30 분 동안 버퍼 KB1에 샘플 발자. 버퍼 KB2 한 번 세포를 씻어하고, 비특이적 결합의 추가 블록 사이트로 실온에서 5 분 동안 버퍼 KB2를 추가합니다.
   참고 : 버퍼 KB1도 차단에 크게 기여하고있다.
5. 집게를 사용하여 6 웰 폴리스티렌 플레이트에서 커버 유리 (22mm X 22mm)를 제거합니다. 소수성 장벽 펜을 사용하여 각 커버 유리 샘플 주위에 소수성 장벽을 형성하기 위해 옅은 녹색 사각형 또는 원을 그리, (재료 / 장비의 목록 참조). 만지거나하지 마십시오 소수성 장벽 펜으로 세포에 너무 가까이. 새로운 6 자 폴리스티렌 판의 커버 유리를 넣습니다.
6. (; 또한 재료 / 장비 목록을 참조 200 : 100-1 1의 희석 비율) 및 항 CENP-B 항체 (1 희석 비율 : 400) 중 하나 또는 안티 차 센트로하는 항체 또는 동원체 단백질을 희석 센트로 항체 (ACA) (1 희석 비율 : 2,000) 버퍼 KB2의 센트로 위치 마커있다.
   참고 : 최적의 결과를 위해, 마지막 집중하고이 용액에 차 항체 능은 경험적으로 결정되어야한다.
7. 세포 샘플을 몰입하기 위해 희석 차 항체의 충분한 볼륨 (약 30 μL)을 적용합니다. 37 ° C에서 1 시간 동안 세포 샘플을 인큐베이션. 세포를 버퍼 KB2로 3 회 씻어.
8. 각 차 항체에 대해 유도 버퍼 KB2를 사용하여 형광 접합 이차 항체 (200 : 100 1~1의 희석 비)로 희석.
   주 : 최적의 결과를 위해,이 용액 이차 항체의 최종 농도는 실험적으로 결정되어야한다.
9. 충분한 볼륨 세포 샘플을 몰입 할 수있는 희석 차 항체 (커버 유리에 약 30 μl를 한 방울)을 적용합니다. 37 ° C에서 1 시간 동안 세포 샘플을 인큐베이션. 30 분 (다섯 6 분 세척)의 기간 동안 세포를 버퍼 KB2 5 번 씻어.
   참고 : (세포의 손실을 최소화하기위한 즉,) 최적의 결과를 얻으려면, 최적의 세척 조건은 empirica를 결정해야한다에서야.
10. 세포 샘플을 몰입하는 DAPI (50 NG / ㎖)를 포함하는 버퍼 KB3의 충분한 양을 적용합니다. RT에서 5 분 동안 세포 샘플을 인큐베이션. 세포를 버퍼 KB2 1-2 번 씻어.
11. 마이크로 슬라이드에 세포 샘플이 들어있는 커버 유리를 탑재합니다.
    1. 마이크로 슬라이드의 중심 매체를 장착 한 방울을 놓는다.
    2. 세포 샘플로부터 액체를 제거하고, 손 또는 집게를 사용하여 마이크로 슬라이드의 중심에 시료를 위치. 공기 방울을 피하십시오.
    3. 종이 타월로 여분의 설치 매체를 제거합니다.

3. 셀 C 말단의 고정 및 면역 형광 염색법 국기-태그 CENP-A 단백질 (아세톤 고정)

1. 예비
   1. 얼음처럼 차가운 75 % 아세톤을 준비합니다.
   2. 갓 0.5 % 탈지 우유와 0.5 % BSA가 포함 된 PBS (산도 7.4) 50 ㎖를 준비합니다.
   3. 갓 0.1 % 탈지 우유와 0.1 % BSA가 포함 된 PBS (산도 7.4) 50 ㎖를 준비합니다.
   4. (PBS 1 ml의 준비pH를 7.4) DAPI (50-100 NG / ㎖)을 함유.
   5. 2.1.5에 설명 된대로 설치 매체의 100 ㎖를 준비합니다.
2. 세포 고정 용 48 ~ 72 시간 포스트 형질 전환 (프로토콜 1 참조)에 흡인에 의해 배양 배지를 제거합니다. 한 번 PBS와 린스 세포. 세포의 표면을 방해하지 않도록 배양 웰의 측면에 PBS를 적용한다.
   주 : 셀 고정 용 최적 시점은 경험적으로 결정되어야한다.
3. 빙냉 75 % 아세톤 세포를 고정하고, -20 ° C에서 10 분 동안 세포를 배양한다. 실온에서 30 ~ 60 분 흄 후드에서 커버 유리에 건전지.
   주 : 최적의 결과를 위해, 고정 세포 건조에 필요한 시간은 경험적으로 결정되어야한다.
4. 소수성 장벽 펜을 사용하여 각 커버 유리 샘플 주위에 소수성 장벽을 형성하기 위해 옅은 녹색 사각형 또는 원을 그리, (재료 / 장비의 목록 참조). 만지거나하지 마십시오 소수성 장벽 펜으로 세포에 너무 가까이.
5. 블록 nonspecIFIC PBS는 실온에서 5 분 동안 0.5 % 탈지 우유, 0.5 % BSA를 함유하는 첨가하여 세포 결합 부위.
6. (: 1000 희석 비율 1) 항 CENP-B 항체 (하나의 희석 비율 : 200) 있거나, ACA (1 : 2000 희석 비율 PBS 0.1 % 탈지 우유, 0.1 % BSA를 포함하여, 항 - 플래그 항체를 희석 ) 센트로 위치 마커있다.
   주 : 최적의 결과를 위해,이 용액에 차 항체의 최종 농도는 실험적으로 결정되어야한다.
7. 세포 샘플을 몰입하기 위해 희석 차 항체의 충분한 볼륨 (약 30 μL)을 적용합니다. 37 ° C에서 1 시간 동안 세포 샘플을 인큐베이션. 30 분의 기간 동안 세포를 블로킹 완충액으로 5 회 헹군다.
   주 : 세포를 PBS로 세정 할 수있다. 최적의 결과 (즉, 세포의 손실을 방지하기 위해)을 위해 최적의 세정 조건은 경험적으로 결정되어야한다.
8. 대항 형광 접합 이차 항체 (200 : 100 1~1의 희석 비)로 희석PBS 0.1 % 탈지 우유, 0.1 % BSA를 함유하는 각각의 차 항체.
   주 : 최적의 결과를 위해,이 용액 이차 항체의 최종 농도는 실험적으로 결정되어야한다.
9. 세포 샘플을 몰입하기 위해 희석 차 항체의 충분한 볼륨 (약 30 μL)을 적용합니다. 37 ° C에서 1 시간 동안 세포 샘플을 인큐베이션. PBS는 0.1 % 탈지 우유와 0.1 % BSA를 함유하는 세포 2 번 씻어.
   혼자 PBS를 또한 세포를 세척하는 데 사용할 수 있습니다 있습니다.
10. 세포 샘플을 몰입하는 DAPI (50 ~ 100 NG / ㎖)을 함유 PBS의 충분한 양을 적용합니다. RT에서 5 분 동안 세포 샘플을 인큐베이션. PBS로 세포에게 1-2 번 씻어.
11. 2.11에 기재된 바와 같이 마이크로 슬라이드에 세포 샘플을 포함하는 커버 유리를 탑재.

4. 셀 N 말단의 고정 및 면역 형광 염색법 국기-태그 CENP-A 단백질 (메탄올 고정)

1. 예비
   1. 얼음처럼 차가운 메탄올을 준비합니다.
   2. TBS 4 % 염소 혈청을 포함하는 (PH 7.4)을 준비합니다.
   3. TBS DAPI (50 ~ 100 NG / ㎖)를 함유 (PH 7.4) 1 ㎖를 준비합니다.
   4. 2.1.5에 설명 된대로 설치 매체의 100 ㎖를 준비합니다.
2. 세포 고정 용 48 ~ 72 시간 포스트 형질 전환 (프로토콜 1 참조)에 흡인에 의해 배양 배지를 제거합니다. 한 번 TBS와 린스 세포. 세포의 표면을 방해하지 않도록 배양 웰 측으로 TBS 적용.
   주 : 셀 고정 용 최적 시점은 경험적으로 결정되어야한다.
3. 빙냉 메탄올로 세포를 고정하고, -20 ℃에서 6 분 동안 세포를 배양한다. 충분히 잔류 메탄올을 제거하는 TBS로 두 번 세포를 씻어.
4. 소수성 장벽 펜을 사용하여 각 커버 유리 샘플 주위에 소수성 장벽을 만들 옅은 녹색 사각형 또는 원을 그리, (재료 / 장비의 목록 참조). 만지거나하지 마십시오 소수성 장벽 펜으로 세포에 너무 가까이.
5. CEL에 비특이적 결합 부위를 차단4 % 염소 혈청을 포함하는 추가 TBS에 의해 LS. 실온에서 10 분 동안 품어.
6. (1,000 희석 1) 항 CENP-B 항체 (희석 비율 1 : 200) 중 하나를 4 % 염소 혈청을 함유하는 TBS의 동원체 위치 마커 등 (2000 희석 비율 1) 또는 ACA 방지 플래그 항체 희석 .
   주 : 최적의 결과를 위해,이 용액에 차 항체의 최종 농도는 실험적으로 결정되어야한다.
7. 세포 샘플을 몰입하기 위해 희석 차 항체의 충분한 볼륨 (약 30 μL)을 적용합니다. 37 ° C에서 1 시간 동안 세포 샘플을 인큐베이션. 30 분의 기간 동안 세포를 블로킹 완충액으로 5 회 헹군다. 최적의 결과 (셀, 즉 최소한의 손실)의 경우, 최적의 세정 조건은 경험적으로 결정되어야한다.
8. 4 % 염소 혈청을 함유하는 TBS의 각 차 항체에 대해 유도 형광 접합 된 이차 항체 (200 : 100 1~1의 희석 비)로 희석.
   참고 : 최적의 결과를 들어, FINA이 용액에 차 항체 L의 농도는 실험적으로 결정되어야한다.
9. 세포 샘플을 몰입하기 위해 희석 차 항체의 충분한 볼륨 (약 30 μL)을 적용합니다. 37 ° C에서 1 시간 동안 세포 샘플을 인큐베이션. 블로킹 완충액으로 세포를 3 회 헹군다.
10. 세포 샘플을 몰입하는 DAPI (50 ~ 100 NG / ㎖)을 함유 TBS의 충분한 양을 적용합니다. RT에서 5 분 동안 세포 샘플을 인큐베이션. TBS와 세포에게 1-2 번 씻어.
11. 2.11에 기재된 바와 같이 마이크로 슬라이드에 세포 샘플을 포함하는 커버 유리를 탑재.

5. 면역 형광 이미지 관찰, 수집, 정량 및 분석

1. 63X 및 100X 오일 침지 렌즈, 외부 컴팩트 광원 및 CCD 디지털 카메라가 장착 된 전동식 형광 현미경으로 세포 샘플을 관찰한다.
2. 소프트웨어를 이용하여, 디콘 볼 루션 포함한 화상 획득 및 처리를 수행A, 또는 소프트웨어의 B1과 B2는 (재료 / 장비의 목록 참조). 소프트웨어의 B1과 B2에 사용 된 모든 명령에 대한 소프트웨어 A.에 사용 된 모든 명령에 대한 보충 코드 파일 (5.2.1)를 참조하시기 바랍니다, 기업 코드 파일에 (5.2.2)를 참조하시기 바랍니다.
3. 센트로 - 동원체 단백질의 신호를 정량화하기 위해 앞에서 설명한 방법 ^23-25을 사용하여 (예를 들어, 센트로에서 CENP-A의 신호를 나머지) 다음 약간의 수정과 :
   1. 선택 센트로 - 동원체 단백질의 영역과 배경의 다음과 같습니다 :
      1. 유사 분열 세포 (센트로 - 동원체 지역) DAPI로 염색 염색체와 중복 선택 영역; (즉, 세포질 영역) 염색체 외부하지만 동일한 단일 셀 내부 (배경 지역) 및 지역.
      2. 간기 세포 (센트로 - 동원체 지역) DAPI로 염색 염색질과 중복 선택 영역; (크로 마틴 외부하지만 동일한 단일 셀 내부 (배경 지역) 및 지역 즉, 세포질 영역).
         참고 : 각각 소프트웨어 또는 소프트웨어 B2와 영역 선택에도 기업 코드 파일 (5.2.1.4.3) 또는 (5.2.2.6.4)을 참조하십시오.
   2. 다음 식을 사용하여,이 태스크에 대한 소프트웨어 또는 B를 사용하여 잔여 신호의 동원체의 백분율을 정량화 :
      센트로 - 동원체에 센트로 - 동원체 단백질의 신호를 남은
      
      b는 백그라운드 신호의 밝기이다; s는 ACA 또는 CENP-B 염색으로 확인 된 선택된 영역의 신호의 휘도이고 R _샘플의 siRNA (들) 처리 된 세포에 대한 기준 ACA 또는 CENP-B 신호이고; 및 R의 _{CTRL 루크} siRNA를 형질 세포에 대한 기준 ACA 또는 CENP-B 신호이다.
      주 : 이전에보고 한 바와 같이이 분석에서, CENP-B 신호 CUL4A위한 기준 신호로 사용 RBX1 하였다.
   3. 복사 후이 계산 엑셀 파일을 사용하여 전술 한 신호 정량 소프트웨어의 원시 데이터를 붙여. 또한 기업 코드 파일을 참조하십시오 자세한 내용은 (5.2.1.4) 및 (5.2.2.6 참조). 계산의 일례를 표 3에 나타낸다.
4. 각각의 측정 수준에 대한 염색 및 이미지 수집의 변화를 제거하기 위해 최소한 20 세포를 분석 할 수 있습니다. 각각의 셀을 분석하기위한 선택적으로 다른 센트로 - 동원체 단백질 중 이러한 값을 비교 센트로 - 동원체 신호를 나머지의 "평균값"를 사용합니다.

총 단백질 6. 웨스턴 블롯 분석

1. 버퍼 변성에 세포를 재현 탁 (20 mM 트리스 - 염산을 pH가 7.4의 50 mM의 NaCl, 0.5 % Nonidet P-40, 0.5 % 데 옥시 콜레이트, 0.5 % SDS, 1mM의 EDTA 및 완전 EDTA 프리 프로테아제 억제제 칵테일) 피사체 ^(26), 초음파 및 동결 해동 방법 및 측정하는 현탁액단백질 농도 다음과 같습니다 :
   1. 초음파 처리를 들면, 48 내지 72 시간의 형질 감염 후에서 6 웰 폴리스티렌 플레이트의 웰로부터 수집 개의 셀 버퍼의 50 μL를 추가 (프로토콜 1 참조). 장애 물질의 혼과 마이크로 팁이 장착 된 초음파 분쇄기를 작동 한 샘플 당 총 15 초 간헐적 인 펄스 기간 (듀티 사이클 50 %)에 대한 (자재 / 장비의 목록 참조).
   2. 동결 - 해동 과정 들어, 액체 질소로 동결하고 세포를 실온에서 세포를 해동.
   3. 상업 단백질 분석 시약 I 또는 II를 사용하여 단백질 농도를 측정 (자재 / 장비의 목록 참조).
      주 : 해물 시약 I 또는 II 중 하나와 단백질 농도의 측정 1:10의 비율로 희석된다. 이 희석에서, 버퍼의 SDS 존재는이 측정에 거의 또는 전혀 방해를 보여줍니다.
2. 2 × 4 × SDS-PAGE 로딩 버퍼 전체 단백질의 20 ~ 30 μg의 포함 된 해물을 섞는다. ²⁷ 삶아 샘플5 분 후 전기에 대한 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔을 변성 12.0 % -15.0 %에 그들을로드합니다.
3. 전술 웨스턴 블럿 방법을 사용하여 PVDF 막에 SDS-PAGE에 의해 분리 된 단백질을 옮긴다. ^{17,24,27-31을}
   1. 1 × PBS에서 5 % 무 지방 우유 멤브레인 비특이적 결합 부위를 차단하고 실온에서 1 시간 동안 희석 차 항체 용액과 함께 막을 배양한다. 각 기본 항체의 상세 정보 (예를 들면, 희석 비율) 재료 / 장비 목록을 참조하십시오.
   2. PBS-T 완충액 (진탕 각각 3-5 분 인큐베이션) 막 3-4 회 세척 한 후 (1 x PBS, 0.1 %의 트윈 20), 근적외선 (IR​​)의 혼합물에 막 부화 형광 염료 접합 이차 항체 (하나의 희석 비율 : 20,000) DyLight 접합 된 이차 항체 (하나의 희석 비율 : 20,000) 및 / 또는 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)를 PBS-T에 희석 이차 항체 (π 공역; diluti을RT에서 1 시간 10,000) : 1의 비율. 각 보조 항체의 상세 정보 (예를 들면, 희석 비율) 재료 / 장비 목록을 참조하십시오.
4. 막을 3 회 세척 한 후, 적외선 이미지 시스템 및 / 또는 면역 검출 용 화학 발광 이미 저 단백질 분석 막을 검사 (재료 / 장비의 목록 참조).
   1. 적외선 이미징 시스템을 사용하기 위해, 기업 코드 파일에 (6.4.1)를 참조하십시오.
   2. 화학 발광 이미 저를 사용하기 위해, 기업 코드 파일에 (6.4.2)를 참조하십시오. 초 고감도 강화 된 화학 발광 (ECL) 기판을 사용하여이 시스템 (자재 / 장비의 목록 참조).

Results

내생 CENP-A의 면역 형광 분석 CUL4A-E3 리가 아제가 동원체에 CENP-A의 현지화에 필요한 가설을 지원합니다
우리의 최근의 연구는 CUL4A-RBX1 - COPS8 E3 리가 활동이 CENP-A와 동원체에 CENP-A의 현지화에 라이신 124 (K124)의 ubiquitylation 필요하다는 것을 보여 주었다. ⁽¹⁷⁾ 처음에는 계면-센트로 단지 (ICEN가)에 의해 분리 하였다 안티 CENP-A : 기본 염색질 면역, ^32-34는 ICEN 단백질의 일부 중심절에 CENP-A 지역화에서 중요한 역할을 할 수 있다고 가정하고있다. 따라서, siRNA를 녹다운 실험은 그 부재 발현 중심절 ¹⁷ CENP-A의 비편 재화를 유발하는 단백질을 선별하도록 수행되었다 (데이터는 미도시) 비동기 성장 HeLa 세포는 회 Cullin 4A (CUL4A)의 siRNA 또는 R...

Discussion

최근 몇 년 동안 많은 연구가 고정 된 세포에 대해 서로 다른 양적 현미경 분석법을 개발 하였다. ⁽⁴²⁾ 진행을 센트로 - 동원체 생물학에 자주 세포 내 공간 - 시간 규제의 변화하는 기능을 반영하고있는 단백질의 센트로 별 또는 동원체 특정 기능에 대한 이해가 필요 세포주기 중에 이러한 단백질. 따라서, 우리가 IIF 염색 구체적으로 다르​​게 취급 샘플에 적용 할 수있는 내인성 및 외인성 CENP-A 단백질의 상대적인 수준을 분석하는 정량적 IIF 분석 방법을 개발했다. 현재 우리는이 연구에서 프로토콜 2를 사용하여 내생 CENP-I, CENP-H, KNL1, Hec1 및 Ska1의 성공적인 IIF 염색을 달성 (. Niikura 등 ^(24)와 데이터가 표시되지 참조; 재료 / 장비의 목록을 항체의 내용) . 미래에는, 하나의 (상이한 센트로-동원체 단백질의 수준을 정량화하기 endog을 모두 동일한 방법을 적용 할 수있다특정 항체를 선택) enous 및 외래 단백질을...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamin 2000	Life Technologies/Invitrogen	11668	형질주입 시약 I
Lipofectamin RNAiMAX	Life Technologies/Invitrogen	13778	형질주입 시약 II
Opti-MEM I	Life Technologies/Invitrogen	31985	감소된 혈청 배지, 37°C에서 따뜻함; C 사용 전 수조
고포도당 DMEM(Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 매체)	Life Technologies/BioWhittaker	12-604	고포도당 DMEM, 37°C에서 따뜻하게; 사용 전 C 수조
Fetal Bovine Serum, 인증, 열 비활성화, US origin	Life Technologies/Gibco	10082	FBS (태아 소 혈청)
Poly-L-Lysine SOLUTION	SIGMA-SLDRICH	P 8920	Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, 물 내
UltraPure Distilled Water	Life Technologies/Invitrogen/Gibco	10977	멸균 조직 배양 등급 물
마이크로 커버 유리(22mm x 22mm)	Surgipath	105	커버 유리(22mm x 22mm)
6웰 세포 배양 클러스터	Fisher/Corning Incorporated	07-200-83	6웰 폴리스티렌 플레이트
페니실린, 스트렙토마이신; Liquid	Fisher/Gibco	15-140	페니실린-스트렙토마이신
PAP PEN	결합 부위	AD100.1	소수성 장벽 펜(면역형광 염색 시 발수 장벽용)
파클리탁셀(탁솔)	유사분열 세포 분석용	SIGMA-SLDRICH	T7402
, TN-16, 미세소관 억제제(TN16)	엔조 생명과학	BML-T120	TN16 유사분열 세포 분석용 BSA
(소 혈청 알부민)	SIGMA-SLDRICH	A7906	차단 시약
Triton X-100	SIGMA-SLDRICH	T8787	투과 화 용 세제
파라 포름 알데히드	SIGMA-SLDRICH	P6148	고정 reagant
DAPI	SIGMA-SLDRICH	D9542	핵 염색
용 p- 페닐 렌 디아민	SIGMA-SLDRICH	P6001	매체 장착 용
VWR 마이크로 슬라이드, Frosted	VWR International	48312-013	마이크로 슬라이드
항-CENP-A 항체	Stressgen/Enzo Life Sciences	KAM-CC006	마우스 단클론 항체; 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)
항-CENP-B 항체	Novus Biologicals	H00001059-B01P	마우스 단클론 항체; 1:200 (IIF, 메탄올/아세톤 고정)-1:400 (IIF, 파라포름알데히드 고정)
항-CENP-B 항체의	abcam	ab25734	토끼 다클론 항체; 1:200 (IIF, 메탄올/아세톤 고정)-1:400 (IIF, 파라포름알데히드 고정)
항중심체 항체 (ACA)	Fitzgerald Industries International, Inc.	90C-CS1058	인간 중심체 항혈청; 1:2000 (IIF)
Anti-CENP-H 항체	Bethyl Laboratories	BL1112 (A400-007A)	토끼 다클론 항체; 1:200 (IIF)
Anti-CENP-H 항체	BD	612142	Mouse monoclonal 항체; 1:200 (IIF)
Anti-CENP-I 항체	N/A, Dr. Katusmi Kitagawa N/A, Dr. Katusmi Kitagawa		토끼 다클론 항체; 1:1000 (IIF)의 희석 비율; Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006)
Anti-KNL1 항체	Novus Biologicals	NBP1-89223	토끼 다클론 항체; 1:100 (IIF)
Anti-Hec1 항체	Novus Biologicals / GeneTex	NB 100-338 / GTX70268	Mouse monoclonal antibody; 1:100 (IIF)
Anti-Hec1 항체	GeneTex	GTX110735	Rabbit polyclonal 항체; 희석 비율 1:100 (IIF)
Anti-Ska1 항체	abcam	ab46826	Rabbit polyclonal 항체; 1:100 (IIF)
Anti-Flag 항체	SIGMA-ALDRICH	F3165	Mouse monoclonal 항체의 희석 비율; 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anti-Flag 항체	SIGMA-ALDRICH	F7425	Rabbit polyclonal 항체; 희석 비율 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anti-CUL4A 항체	N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri	N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri	Rabbit 다클론 항체;1:3000의 희석 비율 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999)
Anti-RBX1 antibody	Cell Signaling	4397	Rabbit polyclonal antibody; 1:2000 (WB)
Anti-GAPDH antibody	Chemicon	MAB374	Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:5000 (WB)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG	Life Technologies/Invitrogen	A11001	fluorophore-conjugated secondary 항체 (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG	Life Technologies/Invitrogen	A11005	fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG	Life Technologies/Invitrogen	A11008	fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG	Life Technologies/Invitrogen	A11012	fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Non fat powdered milk (approved substitutetion for carnation powdered milk)Fisher	Scientific	NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629)	탈지 우유
Leica DM IRE2 전동 형광 현미경	Leica		전동 형광 현미경
HCX PL APO 63x 오일 이멀젼 렌즈	라이카	LEICA HCX PL APO NA 1.40 오일 PH 3 CS	63X 오일 이멀젼 렌즈
HCX PL APO 100x 오일 이멀젼 렌즈	라이카	LEICA HCX PL APO NA 1.40 오일 PHE	100X 오일 이멀젼 렌즈
라이카 EL6000 컴팩트 광원	라이카		형광 여기용 외부 컴팩트 광원
ORCA-R2 디지털 CCD 카메라	하마마츠	C10600-10B	디지털 CCD 카메라
Openlab 버전 5.5.2 과학 이미징 소프트웨어	Perkin Elmer/Improvision		이미지 관찰, 획득, 정량화 및 분석용
Velocity 버전 6.1.1 3D 이미지 분석 소프트웨어	Perkin Elmer/Improvision		이미지 관찰, 획득, 정량화 및 분석을 위한
완전한 EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일	Roche	11873580001/11836170001	프로테아제 억제제 칵테일 정제
PlusOne 2-D Quant Kit	Amersham Biosciences	80-6483-56	단백질 농도 측정을 위한 상용 단백질 분석 시약 I(2% SDS와 호환 가능)
Bio-Rad 단백질 분석	Bio-Rad	500-0006	단백질 농도 측정을 위한 상용 단백질 분석 시약 II(0.1% SDS와 호환 가능)
Immobilon-FL	EMD Millipore	IPFL00010	PVDF 멤브레인
IgG	LI-COR Biosciences	926-32210	IR 형광 염료 접합 2차 항체(Affinity-purified 2차 항체); 희석 비율 1:20000 (IIF)
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32221	IR 형광 염료 접합 2차 항체 (Affinity-purified secondary 항체); 1:20000 (IIF)
Goat anti-Mouse IgG DyLight 549	Fisher Scientific	PI35507	DyLight-conjugated secondary antibodyIR 형광 염료 접합 2차 항체 (Affinity-purified secondary antibody); 1:20000의 희석 비율 (IIF)
Goat anti-Rabbit DyLight 649	Fisher Scientific	PI35565	DyLight-conjugated secondary antibodyIR 형광 염료 접합 2차 항체 (Affinity-purified secondary antibody); 1:20000 (IIF)의 희석 비율
anti-mouse IgG-HRP	Santa Cruz	SC-2005	HRP-conjugated secondary antibodyDyLight conjugated secondary antibodyIR 형광 염료 접합 2차 항체 (Affinity-purified secondary antibody) 항체); 1:10000 (IIF)
염소 항토끼 IgG-HRP	Santa Cruz	SC-2004	HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR 형광 염료-conjugated secondary 항체 (Affinity-purified secondary antibody); 1:10000 (IIF)의 희석 비율
Openlab version 5.5.2. 과학 이미징 소프트웨어	Improvision/PerkinElmer		소프트웨어 A
Volocity 버전 6.3 3D 이미지 분석 소프트웨어(Volocity Acquisition)	PerkinElmer		소프트웨어 B1
Volocity 버전 6.3 3D 이미지 분석 소프트웨어(Volocity Quantification)	PerkinElmer		소프트웨어 B2
Branson SONIFIER 450			Sonicator
Branson Ultrasonics Sonicator Microtip Step, Solid, 스레드 9.5mm	VWR Scientific Products Inc.	33995-325	초음파 처리 용 디스럽터 혼
Branson 초음파 초음파 발생기 Microtip 테이퍼 6.5mm	VWR Scientific Products Inc.	33996-185	초음파 처리를 위한 마이크로팁
Odyssey CLx 적외선 이미징 시스템	LI-COR Biosciences		면역 얼룩 감지를 위한 적외선 이미징 시스템
Image Studio 분석 소프트웨어 버전 4.0	LI-COR Biosciences		소프트웨어 C
분자 이미저 Versadoc MP4000 시스템	Bio-Rad		화학발광 이미저
Quantity One 1-D 분석 소프트웨어	Bio-Rad		Software D
SuperSignal West Femto 최대 감도 기판	Thermo	34095	초고감도 강화 화학발광(ECL) 기판