크기 배제 ICP-MS를 이용하여 정량적 Metalloproteomic 분석을위한 표준

Summary

유도 결합 플라즈마 질량 분석법(ICP-MS)으로 연결된

크기 배제 크로마토그래피는 생물학적 시료에서 직접 금속 단백질의 다양성 변화를 측정할 수 있는 강력한 도구입니다. 여기에서는 분자 질량 및 알려지지 않은 단백질과 관련된 금속의 양을 추정하는 데 사용되는 일련의 금속 단백질 표준물질에 대해 설명합니다.

Abstract

금속은 화학 반응을 촉매하는 보조 인자로서 단백질이 기능하는 데 필수적입니다. 금속 항상성의 붕괴는 알츠하이머병과 파킨슨병을 포함한 여러 질병과 관련이 있지만 이러한 금속이 수행하는 정확한 역할은 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 금속단백질의 식별은 많은 도전과 어려움에 직면합니다. 여기에서는 복잡한 샘플의 금속 단백질을 정량화할 수 있는 접근 방식을 보고합니다. 이는 유도 결합 플라즈마 - 질량 분석법(SEC-ICP-MS)과 결합된 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 달성됩니다. 6개의 알려진 금속단백질을 사용하여 크기 배제 컬럼을 보정할 수 있으며 각각의 미량 원소(철, 구리, 아연, 코발트, 요오드)를 정량화에 사용할 수 있습니다. 인간 뇌 및 혈장의 SEC-ICP-MS 흔적이 제시됩니다. 이러한 금속단백질 표준물질의 사용은 생물학적 시료 간의 금속단백질 함량을 정량적으로 비교할 수 있는 수단을 제공합니다. 이 기술은 신경 퇴행성 질환뿐만 아니라 미량 원소의 불균형이 연루된 다른 질병에서 금속 단백질의 역할을 밝히는 데 도움이 될 준비가 되어 있습니다.

Introduction

필수 금속은 보조 메신저 경로, 대사 경로와 세포 기관의 기능을 포함 정상적인 생물학적 기능에 중요한 역할을한다. 모든 단백질의 30 %가 금속 단백질 ^한 모든 효소 ^(2)의 50 %가 될 것으로 생각된다. Metalloenzymes는 화학 반응을 촉매하는 단백질 구조를 안정화하는 보조 인자로 및 보조 메신저 등의 규제 역할에 대한 이러한 미량 금속을 사용합니다. 신경 퇴행에 관해서 가장 공부 미량 원소 중 일부는 구리, 철, 아연 ^3입니다. 그들은 부정적인 영향을 가질 수있는 dyshomeostasis하여 많은 질병 경로에 관여하는 것으로 생각된다. 예를 들어, 슈퍼 옥사이드 디스 무타 제 (SOD)에 직접적으로 영향을 수명 및 근 위축성 측삭 경화증 (ALS) ⁽⁴⁾ 가족 성 형태의 트랜스 제닉 마우스 모델 표현형의 금속 상태. 알츠하이머 질환, metalloproteomics 기술 P 트랜스페린에서의 금속 상태의 감소를 발견하는데 사용되어왔다lasma ^5. 이 연구는 중요한 역할 금속 단백질이 질병에서 재생할 수 있습니다 강조 표시합니다.

직접 생체 조직에서 금속 단백질의 연구는 현상 필드입니다. 일부 metalloenzymes이 특징되었지만, 대다수는 아직 규명하지 않은 ⁶ 알 남아있다. 금속 단백질 측정의 주요 문제점 중 하나는 단백질 ^(7)의 기본 상태를 유지하기 위해 필요하다. 고전 상향식 프로테옴 기법 펩티드로 단백질 분해에 의존한다. 이 프로세스는 금속 및 단백질의 비공유 상호 작용을 방해. 따라서, 단백질의 금속 상태에 대한 정보가 획득되지 않는다.

질량 분석 ^8,9 (SEC-ICP-MS) - 이러한 문제를 극복하기위한 하나의 방법은 유도 결합 형 플라즈마와 짝을 크기 배제 크로마토 그래피를 사용하는 것이다. 이 단백질의 대략적인 크기에 대한 정보뿐만 아니라, ASSOC있는 모든 금속을 생성그것은 ¹⁰ iated. 또한, 크기 배제는 효소 또는 단백질 - 단백질 복합체의 원시 상태를 유지 할 수있는 부드러운 크로마토 그래피 기술이다. 유도 결합 형 플라즈마를 사용하는 장점 중 하나 - 질량 분석법 (ICP-MS)는 기술의 정량적 인 특성이다. 금속 단백질 표준의 세트를 사용하여 생물학적 샘플에서 ^9,11 금속 단백질의 절대 정량을 제공 할 수있다. 이것은 금속의 농도의 범위에서 공지 된 금속 단백질을 주입하여 표준 곡선을 생성함으로써 달성된다.

이 프로토콜은 이것을 금속 단백질의 다양한 표준에 대해 달성 될 수 있는지의 일례를 나타낸다. 이 논문에서는 철 (Fe), 구리 (Cu), 아연 (Zn), 요오드 (I), 코발트 (Co)를 포함하여 주로 생물학적 분야에서 조사되는 금속의 표준 곡선을 작성하고자합니다.

Protocol

버퍼 및 예제 1. 준비

1. 완충액 500 ㎖, 200 mM의 질산 암모늄의 pH 7.6 준비 - 세슘 (CS)와 이율배 (SB)를 7.8 (수산화 암모늄 (NH ₄ OH)로 pH를 조정하여) PPB (10)의 최종 농도에 첨가 하였다. ICP-MS의 응답에있는 드리프트를 모니터하는 내부 표준으로 세슘과 이율배 반을 사용합니다. 0.22 μm의 필터를 통해 사용하는 필터 버퍼 전에.
2. 액, 조직 또는 세포 배양 : 시료의 종류에 따라 시료를 준비한다.
   1. 균질 (예를 들어, 조직 또는 세포)를 필요로 시료를 들어, 세제를 함유하지 않는 것을 보장한다. 샘플 준비 트리스 버퍼를 사용합니다. 또한, 인산 버퍼를 사용하지만 그들은 부정적으로 시간이 지남에 따라 또는 동결 해동 사이클 ^(12)와 metalloproteome에 영향을 줄 수 있습니다.
   2. 트리스 식염수 (50 mM 트리스 pH가 8.0를 버퍼링하여 5 분, 150 mM 염화나트륨을위한 설명서 다운스 또는 초음파에 의해 조직 또는 세포 배양 샘플 균질화(염화나트륨) + 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 무료 프로테아제 억제제).
   3. 5 분 동안 16,000 XG에서 원심 분리하여 균질를 명확히. 결과 상층 액을 수집합니다. 4 ° C에서 샘플을 보관하십시오.
      주 : 모든 시료는 종래 고성능 액체 크로마토 그래피로의 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC) 열을 차단하는 분진을 방지하기 위해 (HPLC) 튜브를 원심 분리 로딩되어야한다.
3. 샘플을 가로 질러 칼럼에 장착 된 단백질의 총량을 정상화. 마이크로 볼륨 UV 분광 광도계 ^(13)를 사용하여 280 nm에서의 단백질 농도를 결정한다. (20) 150 μg의 단백질 사이의로드. 샘플의 농도에 따라 80 μL - 2에 이르기까지 일반적인 사출 볼륨을 사용합니다.
   1. 샘플 로딩 전에 증류수로 마이크로 볼륨 UV 분광 광도계의 샘플 암을 청소합니다. 단백질 시료가로드되는 경우 샘플 암이다.
   2. 제 2 μL에 대한 빈 악기전자 샘플 버퍼. 그리고, 하중이 아암 상에 각 샘플 μL 및 280 nm에서의 흡광도를 측정한다.
   3. 농도를 결정합니다. 조 단백질 시료를 들어, 한 복근 = 1 ㎎ / ㎖의 흡광 계수를 사용한다. 샘플의 단백질 농도를 측정하기 위해, 흡광 계수 ε, A는 흡광도이고 맥주 램버트 법칙 A = ε xlxc를 사용 L은 센티미터의 경로 길이이고, C는 농도이다.

질량 분석 - 유도 결합 플라즈마를 사용하여 금속 단백질 표준 2. 대량 분석

1. 워밍업 및 조정 제조 업체의 프로토콜을 사용하여 악기.
2. 기기가 예열 ​​및 조정되면, 대량 ICP-MS를 수행합니다.
   참고 : 정제 된 금속 단백질의 재고 솔루션은 일반적으로 측정하기 전에 희석해야합니다. 금속 stochiometries 추정 단백질 집중하고 : 표준의 금속 농도는 공지 된 단백질로부터 추정 될 수있다기. 이 정보는 생성 된 표준 곡선의 범위 내에있는 것이 적합 할 것이다 희석을 결정하는데 사용될 수있다.
   1. 1 % 질산을 사용하여, 500 μg의 / L -가 0의 범위 내에 있도록, 금속 단백질 표준 티로 글로불린, 페리틴, 세룰로 플라스 민, 구리 / 아연 SOD 비타민 B ₁₂ 희석. 이 범위 내에서 기준을 달성하기 위해, 필요한 경우, 이전에이 주식 희석 물에서 연속 희석을 수행하여 제 1 초과 희석액을 사용하지 않는다.
   2. 주사의 순서를 설정합니다. 우선, 일곱 보정 수치를 분석하고, 0에서부터 농도 - 500 μg의 / L은 금속 단백질 표준 하였다. 일곱 보정 레벨 0, 1, 5, 10, 50, 100, 500 μg의 / L이다.
   3. 관심의 요소를 선택합니다. 그들은 단백질 표준이 결합되는 요소가 여기, 철, 구리, 아연, 공동 및 I를 사용합니다. 소자 선택 탭을 열고 eleme을 가산함으로써 취득 방법에서의 요소를 선택할 있는 국세청과 각각의 동위 원소 질량 분석된다.
   4. 악기 샘플 분석을 수행하고 구 소프트웨어가 자동으로 각 요소에 대한 보정 곡선 분석되고 만든다. 검량선은 표준이 μg의 / L로 함유하는 것을 의미한다 금속의 양에 대해 검출 된 금속의 카운트 / 초를 플롯하여 소프트웨어에 의해 생성된다. 미지 시료에서 금속의 농도를 결정하는 캘리브레이션 곡선을 사용한다.
      주 : 검량선을 사용하여, 소프트웨어는 금속 단백질 수준에서 각각의 금속의 농도를 결정한다.
   5. 벌크 분석 결과로부터, 구리의 혼합물을 사용하여 포유 동물 조직에서 세 가장 풍부한 미량 원소를 포함하는 금속 단백질 표준을 생성 아연 슈퍼 옥사이드 디스 뮤타 아제 (SOD)는 최종적으로 구리, 아연 및 페리틴 (FTN) 200 μg의 / L로 희석 철의 2,000 μg의 / L의 농도.

jove_title "> 3. HPLC 시스템 설정 및 크기 배제 크로마토 그래피 열 평형

주 : 모두 1 요구 때문에이 섹션은, 이전에 병렬로 수행되어야 - 완료를 1.5 시간.

1. 퍼지 HPLC 단계 1.1에서 만든 버퍼 펌프 / 분 5 ㎖의 유속으로 5 분 동안 펌프 퍼지.
2. 시스템이 정화 된 후에, 0.1 ㎖ / 분의 유량을 설정하고, 크기 배제 컬럼 (4.6 × 300mm, 3 μm의 150 Å)을 연결한다.
   참고 : 배관 및 열 사이의 젖은 연결은 기포가 열의 연결하는 동안 갇혀 피할 수 있습니다.
3. PEEK 튜브를 사용하여 280 nm에서 흡광도를 측정하기 위해 설정 한 UV 검출기에 컬럼의 반대쪽 끝을 연결합니다.
4. 점차적 0.05 단위의 열 유량 증가 - 0.4 ml의 최종 유속까지 0.1 ㎖ / 분 / 분으로 진행한다. 이 발생하는 동안, 누출의 열을 튜브 연결을 확인하십시오. 압력 모니터링시스템은 소프트웨어의 크로마토 그램에 압접 흔적을 관찰함으로써 열 조건을 초과하지 않도록 보장한다.
5. 10 열 볼륨 - 5를 통해 필요한 유량 평형 열을 둡니다. 이 평형화되면, 악기 샘플 분석이 발생할 수 있도록 연결한다.
6. 15 분 동안 0.4 ㎖ / min으로 칼럼을 통해 완충액 A 펌프하기 위해 HPLC 방법을 설정합니다.

4. 설정 및 크기 배제 실행 - 질량 분석 - 유도 결합 플라즈마 결합

참고 : 운영 절차는 악기 및 모델에 따라 다를 수 있습니다. ICP-MS를 사용하고 구성하는 방법에 대한 자세한 내용은 장비 기술 전문가에게 문의하십시오.

1. 유도 결합 플라스마를 배치 - 대기 모드로 MS를 하드웨어 설정을 변경하기 전에.
   1. 일단 대기 모드, 오토 샘플러의 통신을 끄고 샘플 도입 "기타"로 변경.
      참고 : 소프트웨어 및 하드에 따라시료 도입 소스로웨어 구성 선택 "HPLC"는 사용될 수있다. 이 옵션을 사용할 수 있는지 배울 수있는 악기 기술 전문가에게 문의하십시오.
2. 직접 ICP-MS에 분무기로 UV 검출기에서 밖으로 흐름을 연결하는 PEEK 튜브 (ID 0.13 mm)를 사용합니다.
3. 전원은 ICP 백업 - MS 및 장비 (10) 워밍업 할 수 - 20 분.
4. 플라즈마가 점화 후, I​​CP에서 원격 케이블을 연결 - MS를 HPLC 오토 샘플러의 뒷면. 플라즈마가 점화되면이 작업을 수행; 그렇지 않으면 HPLC 시스템은 자동으로 ICP 이후 종료됩니다 - MS가 없습니다.
5. LC-ICP-MS에 대한 데이터를 수집 할 수있는 ICP-MS 방법을 변경합니다.
   1. 시간이 해결 수집 (TRA)에 대한 스펙트럼의 획득 방법을 변경합니다.
   2. (- 0.3 초​​ 일반적으로 0.05 사이) 선택 요소, 철, 구리, 아연, 공동, 나는뿐만 아니라 관심의 다른 요소를 설정하고 통합 시간을 분석한다. 관심 A의 요소 후에선택 재, 크로마토 그래피의 실행 시간을 일치하도록 수집 시간을 조정 (예를 들어, 15 분 크로마토 그래피 실행에 대한 900 초).
   3. 수동으로 조정 ICP - 감도와 충돌 셀 헬륨 MS (그는) 고사와 Sb를 버퍼에 포함하여 흐르는 크로마토 그래피 버퍼와 가스 유량. 헬륨의 유량은 일반적으로 대량 분석에 사용되는 것보다 ~ 1 ㎖ / 분 이하이다. 금속 이온 카운트 안정화 및 상대 표준 편차 (RSD)의 값이 5 % 이하로되면, 시스템은 사용할 준비가되어있다.
6. HPLC 및 ICP-MS 소프트웨어 프로그램 모두에서 샘플을 실행 목록을 확인합니다. 샘플 실행 목록은 각각의 샘플 데이터가 저장 될 것이다하는 이름뿐만 아니라 주입하는 순서를 포함한다. 두 프로그램의 목록 경기에서 샘플의 총 수 있는지 확인합니다.
7. 수집을 시작하는 MS - 유도 결합 플라스마를 트리거 할 HPLC에 의한 시료의 주입으로 HPLC 전에 ICP-MS에 대한 샘플 배치를 시작데이터. 이것이 올바른 순서로 수행되지 않는 경우는 누락 된 데이터가 발생합니다.
8. 6,000 μg의 / L에 200 μg의 / L에서 SOD와 FTN 혼합 표준의 다양한 볼륨을 주입하여 검량선 포인트를 생성은 철에 대한 60,000 μg의 / L에 구리 및 아연과 2,000 μg의 / L 위로를 위해 열을 주입. 사출 볼륨은 1에서 30 μl의 범위.
   참고 :이 농도 범위는 일반적으로 복잡한 균질에서 관찰 철, 구리와 아연의 농도를 포함한다. 단지 정제 된 단백질이 포함 된 샘플에 대한 곡선의 최대 범위를 적절하게 조정한다. 다른 요소에서 샘플 덜 오염이 있기 때문에 더 작은 또는 더 큰 범위를 필요로 할 수 단백질과 연결된 금속의 양.
9. 알 수없는 샘플 조직, 혈장 또는 세포 배양의 각을 분석합니다.

5. 데이터 분석, 조작 및 시각화

1. 상기 쉼표로 구분 된 값의 데이터 (CSV) 파일 형식을 저장하고 난로드NTO 처리 프로그램 필요.
2. 구 드리프트 제어하기 위해, 또는 세슘 중 Sb를 초당 카운트하여 각 요소의 초당 카운트를 나눈다.
3. 각 요소에 대한 보정 곡선을 생성한다.
   1. 이 바람직한 데이터 분석 소프트웨어 피크 적분을 수행하여 주사 각각에 결합되는 금속 단백질에 해당하는 금속 피크 아래의 면적을 결정한다.
   2. 철에 대한 60,000 μg의 / L - 구리 및 아연 2,000 6,000 μg의 / L - 각 실행에 컬럼에 주입 된 금속의 총량, (200)에 대한 금속 피크에서 영역을 플롯. 소프트웨어 프로토콜에 따라 선형 회귀 분석을 수행합니다.
   3. PG / 초 초당 계수를 변환 계수로 선형 회귀 분석 기울기 결과를 사용한다. 광고 가치 구배 크로마토 그램에 걸쳐 제 2 데이터 포인트 당 카운트 각각을 나눈다.
4. 에서의 데이터를 그래프크로마토 그램의 시간에 대한 페이지 / 초. 관심의 봉우리 아래의 면적을 결정합니다. 피크 아래의 면적은 단백질 PG에 결합되는 금속의 총량을 나타낸다.
5. 공지 된 금속 단백질 그들이 용출되는 시간의 분자량에 기초하여 교정을 생성한다. 복소 샘플의 단백질 피크의 크기를 추정하기 위해이를 사용한다.

Results

금속 단백질 표준의 사용은 크기 배제 컬럼의 교정을 허용한다.도 1a는 대 용출 프로파일을 나타낸다 표준 티로 글로불린, 페리틴, 세룰로 플라스 민, 구리 / 아연 SOD 그들이 결합되는 금속에 기초 비타민 B ₁₂ (FE, 공동은, 구리, 아연 및 I)는.도 1b의 공극 부피로 나눈 값 (Ve를 용출 볼륨의 형식으로 제시 분자 단백질 표준의 중량 및 용출 시간에 기초하여 크기 배제 칼럼에 대한 검량선을) 나타낸다 열 (Vo에). 이 표준 곡선을 생성하는 데 사용되는 단백질은 A, 콘 알부민, 세룰로 플라스 민, 페리틴, SOD와 티로 글로불린을 콘 카나 발린 있습니다.

칼럼에 주입 된 철의 60000 페이지도 2d는 회귀 분석 (P)를 이용하여 수행된다 -도 2a는 2,000의 범위 페리틴의 용출을 나타낸다eak 영역. (b)와 (c) 피크 영역을 사용하여 생성 된 분석 회귀 구리 및 아연과 2E 및 2 층에 대한 구리 / 아연 SOD에 대한 용출 프로파일된다들이다. 회귀 분석 결과 단백질과 연결된 금속의 양을 정량적으로 측정 할 수 있도록 PG / 초의 카운트 / 초에서 원시 데이터를 변환하기 위해 사용된다. 변환은 선형 회귀 (구리 예 334.6 (카운트 / 초) × (초 / PG))의 기울기에 의해 카운트 / 초 분할함으로써 수행된다.

언급 한 바와 같이,이 기술은 복잡한 생물학적 시료에서 금속 단백질을 식별하기 위해 사용될 수있다. 인간의 뇌와 플라즈마는이 기술을 실시하고도 3 및도 4는 각각 얻어진 결과를 도시하고있다. SEC-ICP-MS에 의해 분리 된 인간의 두뇌는 각각 다른 금속을 나타내고,도 3a 내지도 3c에 도시 이자 (구리, 아연 또는 철을). 인간 혈장이 기술을 실시하는 경우도 4A-4C는 취득한 트레이스를 도시한다. 샘플의 복잡성 풍부 보이는 피크의 수에 영향을 미칠 것이다. 예상 플라즈마 세룰로 플라스 민 및 트랜스페린을 포함하는 몇 가지 금속 단백질에 의해 지배되어있다.

크기 배제 크로마토 그래피 그림 1. 보정 -. 각각의 금속에 따라 금속 단백질 표준 알려진 금속 단백질 (A) 용출 프로파일을 사용하여 질량 분석 - 유도 결합 플라즈마를 결합. (B) 단백질 표준 티로 글로불린 (I) 페리틴 대한 분자량의 검량선 (Ⅱ), 세룰로 플라스 민 (Ⅲ), 콘 알부민은 (IV), 구리 / 아연 SOD는 (V) 및 (VI), 콘 카나 발린."대상 ="_ 빈은 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

페리틴 및 금속 단백질 기준으로 구리 / 아연 SOD 그림 2.는 복잡한 생물학적 샘플에서 금속 단백질과 구리, 철 또는 아연 관련의 양을 결정합니다 (A) 용출 프로파일을 페리틴의 분사 범위 2,000 이상 -. 60,000 μg의 / L 철. (B) 및 (200)의 분사 영역 위에 구리 / 아연 SOD를위한 (C) 용출 프로필 - 각각 구리와 아연의 6,000 μg의 / L. (D), (E) 및 (F) 금속 철, 구리, 아연에 대한 회귀 분석 결과를 보여, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. 구리, 철 및 (C) 아연 추적 인간의 두뇌. (A) 구리 트레이스 (B) 철 추적의 아연 Metalloproteome. 각 금속의 단백질 표준의 용출이 그래프에서 표시된 자신의 분자량 검은 추적으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

인간의 플라즈마 그림 4. 구리, 철 및 아연 Metalloproteome. (A) 구리 트레이스 (B) 철 추적 (C) 아연 추적. 각 금속의 단백질 표준의 용출들은 분자량이 검은 추적에 의해 표시됩니다그래프 아래 dicated. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

단백질의 고유 상태를 보장하는 것은 사용 된 샘플의 저장이 필요한 버퍼들에 특별한주의를 의미한다. 모든 크로마토 그래피 기술 또는 시료 전처리 기술이 이용 될 수 없음. 이 샘플 준비 및 크로마토 그래피에서 사용되는 버퍼가 금속 킬레이트 및 생리 학적 pH와 염 농도를 모방 사용 버퍼없는 것이 중요하다. 피하기 위해 다른 조건은 가열에게 샘플 또는 단백질 변성제 (예를 들면, 요소)의 추가를 포함한다. 이 동결 해동 사이클의 수를 최소화하는 것이 중요하다. 가의 금속을 결합하는 선택 버퍼의 능력이 중요하다 트리스 또는 질산 암모늄 버퍼는 포스페이트 계 완충제 위에 선택되는 이유이다.

크로마토 다른 형태의 크기 배제 크로마토 그래피 상대적인 저해상도 피크 용량은 이러한 기술의 주요 제한된다. 크기 배제 chromatogra의 그러나, 부드러운 자연PHY는 단백질의 원래 상태를 유지하고, 따라서 비교적 약한 금속 - 단백질 결합을 유지하는 것이 중요하다. 단백질의 원래 상태를 유지하기위한 요구 사항은 금속 킬 레이터 (예 : EDTA) 또는 카오 트로픽 염 또는 세제 회피 동결 해동 사이클의 수를 제한을 포함하는 샘플의 치료에 특별한주의를 필요로한다.

이 기술의 영향이 낮은 해상도는 두 개 이상의 단백질을 포함 보이는 봉우리와 같은 복잡한 샘플에있는 경우 특정 단백질과 관련된 금속의 양을 정량화 할 수있는 능력. 따라서, 피크의 적분을 사용하여 결정 금속의 양은 모든 단백질은 단지 하나의 특정 단백질이 시점에서 용출되지와 연관된 금속의 총량의 표시 일 것이다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 관심의 단백질은 상기 기본 조건 하에서 정제되어야한다. 이것의 정량 허용이 단백질과 연결된 금속 certainity 높은 수준으로보고한다. 이 방법의 또 다른 잠재적 인 제한으로 인한 열 비 가역적으로 결합 단백질을 상실 할 것이다. 열 오프 용출 된 단백질의 양이 주입되는 양을 일치하는지 결정하기 위해 분석된다이 회복 실험이 발생하는 경우를 결정하기 위해 수행되어야한다. 동일한 용출은 물질의 금속 함량 및 벌크 ICP-MS에 의해 출발 물질을 측정함으로써 수행 될 수있다. 열 회수는 사용 조건에 따라 다를 수 있지만,이 크기 배제 칼럼으로부터의 단백질 전체 복구 ⁹ 가능하다고 밝혀졌다. 따라서, 사용되는 작동 조건에서 손실이 있는지의 여부를 확인하는 것이 중요하다.

프로토콜 수정 분석 요소뿐만 아니라 사용되는 금속 단백질 기준과 관련 될 수있다. 금속 단백질 표준 우리의 유형에드는 관심있는 요소에 따라 달라집니다. 이러한 구리, 철 및 아연 단백질 등의 요소를 들어, SOD 및 페리틴이 사용된다. 공지 stoichometries이 다른 금속 단백질도 사용할 수 있고, 몇 가지 예는 여기에 도시되어있다.

이 기술을 사용하여 발생할 수있는 하나의 주요 합병증은 ICP-MS의 성화에 소금 결정의 빌드 업입니다. 시스템을 통과 한 또는 육안에 의해 결정될 때 토치가 세정되어야한다는 완충액 1000 ml의 - 염 결정의 형성을 방지하기 위해, 토치 500 회 후 증류수로 세척한다. 발생할 수있는 또 다른 문제점은 시료 추출 콘의 청결도에 더 빠르게 감소한다. 이들은 제조 업체의 프로토콜 다음 정기적으로 청소해야합니다.

초기 샘플 준비 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. 금속 복잡한 INF - 단백질에 변경이있는 경우ormation이 유효하지 않습니다 생성합니다. 이 기술의 주요한 제한 사항 중 하나이고; 뿐만 아니라 저해상도의 사용은, 크기 배제 컬럼은 금속 단백질 생물학의 진정한 복잡성 제한된 상세도를 산출한다.

여기에 설명 된 기술은 생물체의 metalloproteome 지식의 확장을 허용한다. 벌크 분석은 시료 내의 금속의 양을 변화시켜 조 표시를 제공한다. 고려되어야 할 일반적인 고려 사항 외에도,이 기술은 얻어지는 트레이스와 비교하여 차이가 단백질뿐만 아니라 식별 금속 단백질과 연결된 금속의 양을 정량하기 위해 사용될 수있는 도구를 제공한다. 이 기술의 사용은 질환 상태의 차이를 식별하는 데 사용될 수있다. 식별 된 금속 단백질 후 더 그들은 질병 과정에서의 역할을 결정하는 데 도움을 조사 할 수 있습니다. 하이픈 ICP-MS의 적용은 증가를 가지고미래 약물 결합 단백질을 식별 할 수있는 예컨대 ICP-MS 등의 백금, 구리, 요오드 또는 헤테로이 약물의 역할을 결정한다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
애질런트 1290 인피니티 바이너리 펌프	, 애질런트	G4220A
, 애질런트 1290 인피니티 오토샘플러	, 애질런트	G4226A,
애질런트 1200 시리즈 오토샘플러 서모스탯 애	질런트	G1330B
, 애질런트 1290 인피니티 온도 조절 컬럼 컴파트먼트	애질런트	G1316C
, 애질런트 1290 인피니티 가변 파장 검출기	Agilent	G1314E
Agilent 7700 ICP-MS	Agilent	G3282A
수산화암모늄 미량 금속 기초	시그마	338818
질산암모늄	시그마	256064	실험 당일에 새로운 200mM 용액을 만드십시오
안티노미	선택 분석	10002-3
세룰로플라스민	시그마
세슘	선택 분석	100011-1
완전한, EDTA 무료 프로테아제 억제제	로슈	11873580001
코알부민	시그마	C7786
Canavalia ensiformis (잭 빈)의 Concanavalin A	시그마	L7647
Cu, Zn 과산화물 디스뮤타제	시그마	S9697
페리틴	시그마	F4503
ICP-MS 다원소 보정 표준물질	AccuStandard		1% 질산에서 필요한 농도로 구성
. 마이크로볼륨 UV 분광 광도계	써모 사이언티픽
65% 질산	Millipore	100441	사용을 위해 1%로 희석됨
엿보기 튜빙	애질런트	5042-6461
크기 제외 컬럼 BioSEC-3 PLC. 컬럼, 4.6 x 300 mm, 3 μ m, 150 Å	애질런트	5190-2508
염화나트륨	화학 공급	SA046
트리스 하이드로클로라이드	ICN 바이오메디컬 Inc.	103130
갑상선 글로불린	시그마	T9145
비타민 B12	시그마	V2876