방법 논문

결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다

DOI:

10.3791/53743

⸱

2016년 3월 16일

 ,  , 
1Curriculum in Neurobiology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Cell Biology and Physiology, The University of North Carolina at Chapel Hill

이 논문에서

요약

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생화학적 분석과 결합된 광학 현미경 기술은 네트린 의존성 축삭돌기 분지화에서 SNARE 매개 외세포작용의 관여를 밝힙니다. 이러한 기술의 조합을 통해 축삭돌기 분지 및 세포 모양 변화를 제어하는 분자 메커니즘을 식별할 수 있습니다.

초록

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신경 발달 과정에서 성장하는 축삭은 축삭 가지를 정교하게 만들어 여러 시냅스 파트너로 확장됩니다. 축삭돌기 분지화는 netrin-1과 같은 세포 외 유도 신호에 의해 촉진되며 축삭 원형질막의 표면적을 극적으로 증가시킵니다. Netrin-1 의존성 축삭돌기 분지화는 원형질막 확장의 시간적, 공간적 제어를 포함할 가능성이 높으며, 그 구성 요소는 외래 소포 융합을 통해 공급됩니다. 이러한 융합 사건은 VAMP2(소포 관련 막 단백질 2)와 같은 v-SNARE와 원형질막 t-SNARE, syntaxin-1 및 SNAP25(synaptosomal-associated protein 25)를 포함하는 SNARE 복합체의 형성에 선행됩니다. 본 명세서에 자세히 설명된 것은 축삭돌기 분지화에서 SNARE 매개 외포작용의 역할을 조사하는 데 사용되는 다각적인 접근 방식입니다. 결합된 접근 방식의 강점은 개별 뉴런에서 단일 소포 융합 이벤트의 역학에서 배양된 뉴런 집단에서 SNARE 복합 형성 및 축삭 분기에 이르기까지 다양한 공간 및 시간 해상도에서 데이터를 수집하는 것입니다. 이 프로토콜은 내인성 SNARE 복합체의 수치 분석과 pH 민감성 GFP(VAMP2-pHlourin)로 태그된 VAMP2를 발현하는 피질 뉴런의 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경 검사에 대한 확립된 생화학적 접근 방식을 활용하여 개별 뉴런의 외세포 활성에서 netrin-1 의존적 변화를 식별합니다. netrin-1 의존적 분기의 타이밍을 밝히기 위해 시간 순에 걸친 단일 뉴런의 타임 랩스 미분 간섭 대비(DIC) 현미경이 사용됩니다. SNARE 기전을 절단하고 엑소사이토시스를 차단하는 보툴리눔 신경독과 쌍을 이루는 고정 세포 면역형광은 netrin-1 의존 축삭돌기 분지화가 SNARE 매개 외세포 활성을 필요로 한다는 것을 보여줍니다.

서론

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최근 추정치에 따르면 인간의 뇌에는 1014 개의 시냅스 연결1을 가진 10개의 11 개의 뉴런이 포함되어 있으며, 이는 생체 내에서 축삭 분기의 중요성을 강조합니다. netrin-1과 같은 세포외 축삭 유도 신호는 축삭을 적절한 시냅스 파트너로 안내하고 축삭 분지를 자극하여 시냅스 용량을 증가시킵니다2-5. Netrin-1 의존성 축삭 수목화(accentinal arborization)는 상당한 원형질막 확장(plasma membrane expansion)6을 수반하며, 이를 위해서는 SNARE 복합체 의존성 외계소포 융합(complex dependent exocytic vesicle fusion)7을 통한 추가 막(membrane) 성분의 전달이 필요하다고 가정했습니다.

netrin-1 의존성 축삭돌기 분지화에서 SNARE 매개 외포작용의 역할을 조사하는 것은 몇 가지 요인으로 인해 복잡합니다. 첫째, 피질 뉴런의 이질성으로 인해 중요한 효과를 식별하는 데 필요한 샘플 크기가 증가하여 이미징과 같은 단세포 기술이 복잡해집니다. 둘째, 생화학적 기술을 통해 개체군 수준에서 발생하는 변화를 관찰할 수 있지만,....

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프로토콜

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연구 윤리의 진술 : 여기에 설명 된 동물을 포함한 모든 실험은 규칙과 동물 관리에 UNC위원회의 규정과 관리 및 실험 동물의 사용을위한 NIH 기준이 적용됩니다.

1. 준비 및 해리 두피 뉴런의 도금

  1. CO에 의해 자궁 경부 전위 다음 2 흡입을 초과 임신 여성을 안락사. 각 반구에서 배아 일 15.5 (E15.5) 마우스 및 microdissect 피질의 두개골에서 전체 뇌를 제거합니다. Viesselmann 등의 알 (8)를 참조하십시오 배아 마우스 피질의 미세 절제에 관한 자세한 지침.
  2. 멸균 1.6 ml의 마이크로 튜브에 해부 미디어 1 ㎖에는 4 개 이상의 피질을 배치합니다. 10 배 트립신의 120 μl를 추가하고 관 3 반전 - 혼합 5 회.
  3. 혈구를 사용하여, 세포는 세포 배양 접시를 시드 계산합니다. 주 : 1 피질 반구가 제공하는 approximately 삼백만 세포.
    1. SDS 방지 SNARE 복잡한 생화학 분석의 경우, 35mm 접시 당 육백만 세포를 판과 상태에 따라 두 가지 요리를 이용한다. 주 :이 여러 조건을 비교하면 6 웰 플레이트를 사용함으로써 단순화된다. <....

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결과

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시험관 내 생화학 적 기법을 활용하는 것은. 뉴런의 인구 SDS 방지 SNARE 복합체의 양을 분석 그림 1 SNAP-25, syntaxin1A 및 VAMP2에 대한 프로브 SDS 방지 SNARE 복잡한 분석의 결과 웨스턴 블롯 다음 완료를 보여줍니다.

기저 세포막에서 TIRF 현미경 단셀의 개체 exocytic 융합 이벤트의 높은 해상도 이미지를 제공한다.도 2a-VAMP2 phluorin 매개 exocytic 이벤트를 식별하기위한 이미지 분석 방법을 보여주고있다. 소포 융합이 발생 VAMP2-phluorin은 세포막 내에서 확산되고있다.도 2b는 대뇌 피질 신경 세포에서 (초)의 시간에 걸쳐 발생하는 exocytic 이벤.......

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토론

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축삭 분기는 근본적인 신경 발달 과정이며 포유류 신경계의 광범위한 신경 연결성을 뒷받침합니다. 국소 원형질막 확장과 관련된 메커니즘을 이해하는 것은 정상 및 병리학적 신경 발달에 대한 이해에 필수적입니다. 집단 수준과 단일 세포 수준 방법론을 모두 통합하는 다각적인 접근 방식을 사용하면 집단 수준 분석을 손상시키지 않으면서 재현성이 향상되고 공간적, 시간적 해상도가 향상됩니다. 단일 세포 수준에서 네트린 의존성 축삭 분기를 검사하기 위해 고정 세포 및 살아있는 세포 접근법을 모두 활용하면 여러 실험에서 큰 샘플 크기를 수집할 수 있는 능력, DIC 이미징을 통한 시간적 분해능, TIRF 현미경을 사용한 엑소 사이틱 융합의 시공간 분해능의 세 가지 이점을 제공합니다.

SDS 내성 SNARE 복합 분석을 통해 배양에서 피질 뉴런의 이질성을 설명하는 SNARE 활성을 측정할 수 있습니다. SNARE 복합체는 매우 안정적입니다. 대부분의 다른 단백질 복합체는 SDS를 첨가하여 해리됩니.......

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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RO1 - GM108970 (SLG)와 F31-NS087837 (CW) :이 작품은 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
6-웰 조직 배양 처리 플레이트Olympus Plastics25-105
유리 커버슬립Fisher Scientific12-545-8112CIR-1.5; 24시간 동안 질산 처리하고 DI 물로 2번 헹구고 사용 전에 건조해야 합니다. 1 mg/ml 폴리-디-라이신으로 코팅하고 세포를 도금하기 전에 헹궈야 합니다.
Amaxa nucleofection solutionLonzaVPG-1001100 ml/transfection
Amaxa Nucleofector/electroporatorLonzaprogram O-005
35 mm Glass bottom live cell imaging dishesMatek Corporationp356-1.5-14-C는 1 mg/ml Poly-d-lysine으로 코팅하고 세포
Olympus IX81-ZDC2 도립 현미경Olympus
람다 LS 크세논 램프Sutter Instruments Company
환경 무대 상단 인큐베이터Tokai Hit
100x 1.49 NA TIRF objective올림푸스
Andor ixon EM-CCDAndor
Odyssey Licor 적외선 이미징 시스템LI-COROdyssey CL-X블롯 스캔에 사용
이미지 스튜디오 소프트웨어 제품군LI-COROdyssey Infrared 시스템에서 스캔하는 데 사용됩니다. 블롯의 오프라인 분석에 사용되는 Image studio lite
Metamorph for OlympusMolecular devices, LLC버전 7.7.6.0모든 이미징 및 DIC 타임랩스 분석에 사용되는 소프트웨어
CELL TIRF 제어 소프트웨어 TIRF 이미징용 레이저 제어에 사용되는Olympus
피지(이미지 J)NIHImageJ 버전 1.49t
60x Plan Apochromat 1.4 NA 대물렌즈Olympus
40x 1.4 NA Plan Apochromat objectiveOlympus
Neurobasal mediaGIBCO21103-049무혈청 및 트립신 담금질 매체용 기본 솔루션
보충제 B27GIBCO17504-044500ml/50ml 무혈청 배지 및 트립신 담금질 배지
L-Glutamine35050-0611ml/50ml 무혈청 배지
소 혈청 알부민Bio Basic Incorporated9048-46-8커버슬립 차단을 위한 1x PBS의 10% 용액; 니트로셀룰로오스 멤브레인 차단을 위한 TBS-T의 5% 용액.
10x  트립신시그마59427C
HEPESCELLGRO25-060-Cl
둘베코의 인산염 완충 식염수(DPBS)+ Ca + Mg코닝21-030-cm
태아 소 혈청Corning/CELLGRO35-010-CV
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Corning/CELLGRO20-021-CV
NaClFisher scientificBP358-10
EGTAFisher scientificCAS67-42-5
MgCl2Fisher scientificBP214-500
TRIS HClSigmaT5941-500
TRIS baseFisher scientificBP152-5
N-Propyl GallateMP Biomedicals102747
글리세롤 광도 등급Acros Organics18469-5000
글리세롤 (비광학 등급)Fisher scientificCAS56-81-5
B-mercaptoethonalFisher scientificBP176-100
SDSFisher scientificBP166-500
증류수 GIBCO152340-147
Poly-D-LysineSigmap-78861 mg/ml의 멸균수에 용해
Botulinum A 독소 BoNTAList Biological Laboratories128-A
Rabbit polyclonal anti human VAMP2Cell signaling11829
Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1ASanta Cruz Biotechnologysc-12736
염소 다클론 항 인간 SNAP-25Santa Cruz Biotechnologysc-7538
마우스 단클론 항 인간 및 베타; III-튜불린 CovanceMMS-435P
Alexa Fluor 568 및 Alexa Fluor 488 phalloidin, 또는 Alexa Fluor 647Invitrogen
LI-COR IR-염료 2차 항체LI-CORP/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022800 당나귀 안티 마우스, 680 당나귀 안티 토끼, 680 당나귀 안티 염소
0.2 μ m 기공 크기 니트로셀룰로오스 멤브레인Biorad9004-70-0
Tween-20Fisher ScientificBP337-500
메탄올Fisher ScientificS25426A
Bromphenol BlueSigmaB5525-5G
자당Fisher ScientificS6-212
파라포름알데히드Fisher ScientificO-4042-500
트리톤-X100피셔 사이언티픽BP151-500
TEMED피셔 사이언티픽BP150-20
40% 비스-아크릴리미드피셔 사이언티픽BP1408-1
NameCompany카탈로그 번호Comments
Alternative Validated Antibodies
Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 클론Sigma AldrichS0664
  마우스 단클론 Synaptobrevin 2 (VAMP2)Synaptic Systems104-211
Mouse Monoclonal SNAP25Synaptic Systems111-011
전에 헹궈야 합니다. 소프트웨어

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Drachman, D. A. Do we have brain to spare? Neurology. 64 (12), 2004-2005 (2005).
  2. Serafini, T., et al. Netrin-1 Is Required for Commissural Axon Guidance in the Developing Vertebrate Nervous System. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
  3. Métin, C., Deléglise, D., Se....

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Axon BranchingNeuronal MorphogenesisSNARE Mediated ExocytosisTIRF MicroscopyVAMP2 pHlourinDIC ImagingWestern BlotBotulinum ToxinNetrin 1 StimulationCortical Neurons

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